使用光子芯片的高通量总内反射荧光和直接随机光学重建显微镜

本手稿的主要目标是介绍新开发的基于光子芯片的 TIRF 显微镜和单分子本地化显微镜（如 dSTORM）的成像过程。这里的主要组件是由光学波导系列构成的光子芯片。光波导内部的光是根据总的内部反射来引导的。

有些光以消逝的波的形式存在于表面。那些消逝的波，它们从表面呈指数级衰变，穿透深度为几百纳米。这使得它们适用于 TIRF 照明。

通过光波导的TIRF照明可在极大区域使用，该区域由波导几何定义，因此非常适合高通量成像。与我们的方法相比，传统 TIRF 和 dSTORM 设置之间的主要区别在于，我们使用光子芯片来照亮样品，而不是通过成像客观透镜发送光线。我们的方法将照明和收集灯部分分离，为新的成像可能性开辟了。

使用晶圆钳子将芯片放在玻璃培养皿中，用 1% 的 Hellmanex 溶液完全覆盖。将培养皿放在 70 度的加热盘上 10 分钟。在加热盘上时，用洁净室组织棉签擦拭表面。

从培养皿上取下碎屑。用至少100毫升的去水冲洗。用至少 100 毫升异丙醇冲洗，注意溶剂表面不干燥，以防止蒸发污渍。

用至少100毫升的去水冲洗。用氮气枪将芯片吹干。稍后在培养皿中旋转 150 微米 PDMS。

使用手术刀从 PDMS 图层切割大约 1.5 1.5 厘米的框架。用钳子从培养皿上提起框架。平放在干净抛光的芯片上。

该示例现在已准备就绪，用于细胞种子设定。细胞种子后，从介质上取出芯片。使用移液器从 PDMS 腔室外清除多余的液体。

用移液器从 PDMS 腔室内取出电流液体，同时添加大约 60 微升清洁 PBS。用 60 微升清洁 PBS 更换 PBS，让它孵育一分钟。重复上一步，让它孵育五分钟这一次。

取出 PBS，然后用 60 微升染料溶液进行更换。让样品孵育约15分钟，保护其免受光线的遮挡。使用前面描述的程序用 PBS 清洗样品。

卸下 PBS，同时将其替换为 40 微升的成像缓冲器。将盖玻片放在顶部，防止气泡在下方形成。轻轻按压成像室上的盖玻片，以去除任何多余的介质。

使用移液器去除盖玻片外的任何多余的介质。使用水湿拭子清洁盖玻片外区域，以避免干燥浸入式介质残留物形成晶体。此版本的设置由三个主要组件组成。

带滤光片支架、白色光源、相机和目标左轮手枪的显微镜。耦合级，这是一个三轴压电级，带光纤耦合激光和耦合透镜。样品级，这是一个单轴手动级，带尖端和倾斜，带真空支架。

耦合和样品级都安装在双轴电动级上，用于样品转换。将芯片放在真空卡车上，将耦合面朝向耦合目标。确保芯片与耦合目标大约一焦距。

打开真空泵。将激光打开至一毫瓦。大致调整芯片高度，使光束击中其边缘。

关闭激光。打开白色光源。选择低放大倍数的客观镜头，例如，10 倍。

将显微镜聚焦在波导上。沿波导翻译显微镜，看其是否与光路对齐。将显微镜移动到耦合边缘。

以一毫瓦或更少电位打开激光。沿耦合边缘翻译显微镜以找到激光。将光束聚焦在芯片边缘上。

沿光路调整耦合级，沿方向减小激光束点大小，直到其消失。光束现在位于芯片表面的上方或下方。调整耦合级高度，直到光束点重新出现并最大化。

重复前两个步骤，直到激光形成聚焦点。将焦点移动到感兴趣的波导。将显微镜翻译到离边缘较远的地方，以便聚焦光束点不再可见。

关掉白灯。调整对比度。如果波导在引导，则沿波导的散射光应清晰可见。

调整耦合级轴以最大化散射光强度。关闭激光。打开白光。

如有必要，调整对比度。导航到成像区域。关注所需的想象目标。

关闭白灯。插入荧光过滤器，将激光功率转动至一毫瓦。将摄像机曝光时间设置为大约 100 毫秒。

根据需要调整对比度。确保联轴器仍经过优化。找到成像感兴趣的区域。

打开压电阶段循环以平均出节点。捕获至少 300 张图像。使用虚拟堆栈将捕获的图像堆栈加载到斐济。

从斐济的图像菜单中，选择"堆栈"和"Z 项目"。通过选择投影类型"平均强度"来计算 TIRF 图像。将激光打开至一毫瓦，将摄像机曝光时间设置为 30 毫秒。

调整对比度和焦点。增加激光功率，直到观察到闪烁。放大示例的小区域。

调整对比度。捕获一些图像，以查看闪烁是否分离良好。调整摄像机曝光时间以获得最佳闪烁效果。

打开压电阶段循环。根据闪烁密度，录制至少 30，000 帧的图像堆栈。打开斐济，将 dSTORM 堆栈加载为虚拟映像。

如有必要，调整对比度。使用矩形工具选择要重建的区域。在斐济的雷暴插件中打开运行分析。

在雷暴中设置与您的设备对应的基本摄像机设置。剩余的默认参数通常令人满意。开始重建。

将筛选重建软件提供的本地化列表，以删除非特异性本地化。如有必要，将应用额外的漂移校正。基于芯片的成像与传统成像的主要区别在于仪器和数据采集。

因此，可以像从商业超分辨率显微镜中评估图像一样评估重建图像的质量。由于使用多模式波导，因此，如果收集的图像太少，生成的图像可能会表现出不均匀的激发。这显示在面板 a 中。

增加激发模式的数量应导致不均匀的激发，如面板 B 所示。在这里，我们用荧光标记的血浆膜成像了肝脏正弦内皮细胞。面板 a 和 b 是衍射受限的图像。

面板 c 显示面板 b 中插入的衍射受限图像。面板 d 显示同一区域的 dSTORM 图像。肝正弦内皮细胞的血浆膜中具有纳米大小的芬斯特，在面板d的超分辨率图像中清晰可见。

基于芯片的超分辨率成像的主要优势之一是可实现的大视野。面板 a 显示了一个 500 微米到 500 微米大的 dSTORM 图像，该图像显示肝脏正弦内皮细胞与荧光标记的微图布林。面板 b 显示面板 a 中的洋红色内嵌，同时显示衍射受限和超分辨率图像进行比较。

面板 c 显示面板 a 中的绿色插图。捕获的图像分辨率为 77 纳米。在这段视频中，我们使用光子芯片对肝脏正弦内皮细胞进行了大视场TIRF和dSTORM成像。

我们的方法比传统的使用预先数值孔和低视场的显微镜目标执行 TIRF 的方法不那么复杂、更紧凑、更灵活。本地化显微镜（如 dSTORM）是我们使用光子芯片探索的几种超分辨率成像技术之一。例如，光可以更紧密地限制在高折射率光学波导材料内，而不是使用成像物镜。

芯片照明的这一特性在提高强度波动光学显微镜法和结构化照明显微镜分辨率方面已占应用。此外，光子芯片还受益于小型化、成本效益和简单的光学设置。作为一种集成技术，它与其他片上光学功能兼容。

总之，这使得改装成传统的衍射受限显微镜成为可能，从而能够以较低的成本实现超分辨率。