无参考牵引力显微镜平台的制造和实施

牵引力显微镜用于测量细胞产生的力。该协议简化了牵引力数据的收集分析，以便让没有经验的用户更容易访问。与现有的无参考牵引力显微镜平台不同，该技术的主要优点是多光度光刻光刻能够根据单个实验需求进行快速、简单的图案设置重新设计。

在构建和实施这个新的无参考牵引平台时，有许多关键步骤，这些步骤通过可视化表示而不是仅通过文本更容易理解。对于基础水凝胶的光聚化，首先将三微升的预聚合物溶液添加到薄薄的、扁平的全氟脱氧气碱板上，并将平坦的 150 微米厚 PDMS 条放在周围，但与聚合物前溶液不接触。在 PDMS 上放置丙烯酸硅化盖玻片，预聚合物液滴居在盖玻片下，将预聚合物液滴压到 PDMS 垫片的厚度。

将夹层预聚合物溶液暴露在紫外线下约一分钟。当水凝胶完全形成时，小心地将盖玻片与 PDMS 分隔器分离。使用高性能双面丙烯酸粘合剂将打开的底部培养皿连接到盖玻片上。

将充满水凝胶的盖玻片粘附在培养皿上时，请特别小心。湿盘或应用过程中压力过小，会漏油，破坏样品。向粘合剂接触面施加压力，在盖玻片、粘合剂和培养皿之间形成完整的密封，注意不要打碎玻璃。

使用无菌过滤的 PBS 冲洗水凝胶。然后，在为水凝胶合成准备的实验室溶液的 800 微升中添加 8 微升 NVP。要将二进制图像转换为数字掩码，请打开 MATLAB 并打开并运行 runscript。

m MATLAB 脚本。选择要转换的二进制 TIF 文件，然后选择一个文件夹来保存区域的文件。输入所选图像所需的最终大小（以微米）。

输入图像将缩放和标注尺寸以匹配这些参数。若要创建单个像素数组，请在"感兴趣区域生成器选项"中，取消选中"小区域/单个像素"下的"删除 tic"框，选中"正方形"框，取消选中"水平断线下使用"。然后，单击"确定"。OVL 文件将在以前指定的文件夹中找到。

在显微镜软件中打开文件，在两次光子激光扫描光刻过程中加载控制激光快门所需的区域。应在光线极小的条件下执行以下步骤。在低光照条件下制造基准标记阵列，将先前准备的 NVP 实验室解决方案的 200 微升与 20 毫克 Alexa Fluor 633 彻底混合，并从含有水凝胶的培养皿中去除所有 PBS。

将PEG-633混合物加入水凝胶，作为完全包含基水凝胶的液滴，将Peri盘加载到显微镜阶段的样品支架上。然后盖上盘子，让图案溶液浸泡在水凝胶中至少30分钟，不受光线的影响。要配置显微镜进行成像，请选择适当的激光器和滤镜来可视化 Alexa Fluor 488。

使用 PEG-488 信号定位水凝胶，并阻止从探测器收集更长的发射波长。使用垂直和水平切片扫描定位 XY 平面中的水凝胶中心，并在此位置将舞台归零。使用 Z 堆栈函数中的线扫描来定位水凝胶的表面，并在此位置将焦点归零。

通过重复从 XY 中心之外的线扫描来识别表面位置，根据需要调整显微镜阶段的固定螺钉，对水凝胶进行调平。在显微镜软件工作区中，创建一个单独的光模型实验文件，将多光子功率设置为 1.8%，扫描速度设置为 6。调整图像帧和像素的大小，以实现像素大小为 0.1 微米/像素，纵横比为 100 比 1，然后将区域文件加载到区域选项卡中。

使用宏设置所有区域以获取和打开 Z 堆栈函数。将间距设置为 3.5 微米，总深度为 28 微米，Z 切片总数为 9 个。然后使用"位置"函数在水凝胶上设置特定位置，其中将采用光模式进行基准标记阵列。

当浸泡时间接近 30 分钟标记时，每五分钟获取一次水凝胶表面的 Z 堆栈线扫描，以根据表面相对于零对焦位置的位置变化检查膨胀。如果在五分钟间隔内表面位置未发生更改，请运行阵列设置并使用 488 纳米激光器验证水凝胶表面在阵列过程中未移动。然后从显微镜上取出水凝胶，从培养皿中吸出PEG-633溶液，然后用无菌过滤的PBS冲洗。

要获取细胞和基准标记图像，请将培养皿返回样品架以定位图案区域。找到感兴趣的细胞并获取该细胞的传输或荧光图像。然后获取单元格下方图案数组的 Z 堆栈（如演示），并获取第二组细胞的传输或荧光图像。

收集图像堆栈时，生成的图像应显示一个常规的图案特征数组，这些特征的强度会随着图像堆栈中 Z 位置的函数而振荡。追踪m 脚本提供了多个诊断图像，包括用于评估预处理质量的荧光模型标记的 Z 投影、检测到的质心图、作为 Z 位置的函数用于评估对象检测质量的颜色，以及表示已检测到的标记中心的轨道图，这些轨迹已链接到 Z 方向的列中，以评估对象跟踪质量。

DISP 3D.m 脚本提供强度图，作为给定图像堆栈中每个检测到要素列的 Z 位置的函数，以评估基准标记强度配置文件的质量。两个 DISP 3D。

m 和 DISP 剪切。m 一起提供每个笛卡尔坐标尺寸中测量的位移噪声的直方图以及位移的插值热图。此外，中间final3D_2。

m 提供使用外包代码计算的表面牵引力的热图。在此过程过程中，要记住的最重要的事情是，包含 LAP 的解决方案对光敏感，应尽可能保护环境光源。请记住，NVP 是一种挥发性有机化合物，应始终在化学流罩中处理。