Name: 多细胞人类原发性子宫内膜器官的生成 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: 学习利用人原代子宫内膜组织生成多细胞类器官的方法，该类器官包含上皮细胞和基质细胞，可模拟体内组织结构与激素反应，为研究生殖健康、激素失衡及子宫内膜癌等疾病机制提供可靠的体外研究平台。

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本研究由美国国家环境卫生科学研究所/美国国立卫生研究院/国家转化科学促进中心（NIEHS/NIH/NCATS）UG3 项目基金（ES029073）和西北大学范伯格医学院桥梁基金（JJK）资助。我们感谢西北大学病理学核心设施对固定类器官进行石蜡包埋处理的支持。我们感谢整个 UG3 团队，包括 Woodruff、Burdette 和 Urbanek 实验室，提供了富有洞见的讨论与合作。

根据机构审查委员会批准的方案，子宫内膜样本采集自在中国西北大学普伦蒂斯妇女医院因良性子宫疾病接受常规子宫切除术的绝经前女性。研究中所有女性均签署了书面知情同意书。
1. 琼脂糖模具的制备
<ol>
	<li>在开始细胞分离之前，根据制造商的说明，制备并平衡用于培养类器官的1.5%琼脂糖微模具（材料表）。</li>
</ol>
2. 子宫内膜类器官的生成
<ol>
	<li>分离原代基质细胞和上皮细胞
	<ol>
		<li>在生物安全柜中，采用无菌技术配制酶溶液（将 I 型胶原酶 2.5 mg/mL 与 DNase I 0.1 mg/mL 溶于 10 mL dispase [500 units] 中），于 37 °C 预热，并使用 0.2 µm 注射器滤器将溶液无菌过滤至 15 mL 锥形管中。</li>
		<li>在生物安全柜中，采用无菌技术刮取子宫活检组织的子宫内膜，并在通风橱内用手术刀将组织切碎成极小的碎片。 
		注意： 需要至少 20 mm × 10 mm × 1 mm 的子宫内膜组织，以获得足够数量的类器官。</li>
		<li>将 freshly 粉碎的组织放入含有酶溶液的 15 mL 圆锥形离心管中。盖紧管盖，并用石蜡膜包裹管口材料表以防止污染。</li>
		<li>将装有组织的离心管置于37 °C水浴或培养箱中，轻轻振荡（80−100 rpm）30分钟。</li>
		<li>将100 µm细胞滤筛叠放在50 mL离心管上的20 µm细胞滤筛上。将溶液通过这两个滤筛过滤，然后用10 mL的Hank’s平衡盐溶液（HBSS； 材料表）并将洗涤液通过滤网，以确保收集全部细胞。 
		注意： 流穿液含有基质细胞和红细胞（总体积约20 mL）。上皮细胞收集在20 µm滤器上。未消化的组织碎片留在100 µm滤器表面。将未消化的组织丢弃至生物危害废物容器中。</li>
		<li>将2.1.5步骤中的20 µm细胞筛翻转至一个新的50 mL锥形管上，用20 mL类器官培养基将上皮细胞从筛网中冲洗下来（材料表添加1%青霉素-链霉素溶液</li>
		<li>将步骤 2.1.5 和 2.1.6 中的锥形管在 500 x g 5 分钟。</li>
		<li>收集的基质细胞中去除上清液，然后用10 mL红细胞裂解缓冲液重悬沉淀。&#160; 37 °C 下孵育 10−15 分钟。将锥形管在 500 x g 5分钟，弃上清，用200−300 µL类器官培养基重悬沉淀（详见步骤2.2.2的操作说明）。</li>
		<li>收集上皮细胞后，去除上清液，并用100 µL类器官培养基重悬（详见步骤2.2.2的说明）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>接种细胞
	<ol>
		<li>将1.5%琼脂糖模具（每孔1个模具）在24孔板的孔中平衡后，移除琼脂糖模具外部的类器官培养基，并倾斜组织培养板，以小心移除琼脂糖培养皿细胞接种室中的培养基。</li>
		<li>在显微镜下观察上皮细胞悬液（来自步骤 2.1.9）和间质细胞悬液（来自步骤 2.1.8）。&#160; 每次向上皮或间质细胞悬液中添加100 µL的类器官培养基，使两种悬液的密度大致相等。 
		注意： 上皮细胞会聚集在一起，因此不建议将上皮细胞消化或胰酶处理为单细胞悬液。</li>
		<li>按体积将1份间质细胞与3份上皮细胞混合。</li>
		<li>将50 µL（60,000个细胞）混合细胞悬液移液至琼脂糖模具的细胞接种室中。</li>
		<li>待琼脂糖模具中加入细胞后，小心向24孔板的孔中加入400 µL新鲜类器官培养基。 
		注意： 培养基液面略低于琼脂糖培养皿的表面，不会导致细胞漂出模具。培养2−3天后，细胞将沉降并开始形成类器官。</li>
		<li>每隔一天更换一次培养基，每次加入500 µL类器官培养基。</li>
		<li>2至3天后，更换培养基，加入0.1 nM雌二醇（E）和0.8 nM睾酮（T），以促进上皮细胞和间质细胞的有序排列。 
		注意： 尽管上皮细胞和间质细胞的组织化过程可在有或无激素的情况下发生，但在激素存在时会形成更多的类器官。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 实验用子宫内膜类器官的收获
注意：实验结束后，可对子宫内膜类器官进行组织学或 RNA 分析。以下步骤描述了如何处理这些类器官。
<ol>
	<li>组织学
	<ol>
		<li>将1.5%琼脂糖溶于磷酸盐缓冲液（PBS）中，加热至沸腾溶解。使液态琼脂糖冷却至约50 °C。</li>
		<li>在解剖显微镜下，倾斜24孔板，小心吸出琼脂糖模具外部的培养基。再小心吸出琼脂糖模具内部的培养基，避免破坏类器官。</li>
		<li>在解剖显微镜下，小心吸取70–75 µL温热（50 °C）的1.5%琼脂糖溶液，加入琼脂糖培养皿的腔室中。注意不要扰动类器官。</li>
		<li>在4 °C冷却5分钟。</li>
		<li>向24孔板的每孔中加入4%多聚甲醛（PFA），于4 °C固定含有类器官的完整密封琼脂糖模具过夜。随后转移至4 °C的70%乙醇中保存，直至进行石蜡包埋处理。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>RNA提取
	<ol>
		<li>在解剖显微镜下，倾斜24孔板，小心吸出琼脂糖模具腔室中的培养基。</li>
		<li>用力将1 mL新鲜类器官培养基直接吹入琼脂糖模具中，使类器官从微孔中被冲出。注意避免产生过多气泡。</li>
		<li>使用步骤3.2.2中的相同培养基重复吹打一次。</li>
		<li>收集所有含有类器官的培养基。以最大转速离心以收集类器官，随后进行RNA提取。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Henriet, P., Gaide Chevronnay, H. P., Marbaix, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endocrine+and+paracrine+control+of+menstruation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">The endocrine and paracrine control of menstruation.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 358 (2), 197-207 (2012).</li>
<li>Gellersen, B., Brosens, I. A., Brosens, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decidualization+of+the+human+endometrium%3A+mechanisms%2C+functions%2C+and+clinical+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Reproductive+Medicine%22%5BJournal%5D)">Decidualization of the human endometrium: mechanisms, functions, and clinical perspectives.</a> Seminars in Reproductive Medicine. 25 (6), 445-453 (2007).</li>
<li>Gellersen, B., Brosens, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+decidualization+of+the+human+endometrium+in+reproductive+health+and+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Reviews%22%5BJournal%5D)">Cyclic decidualization of the human endometrium in reproductive health and failure.</a> Endocrine Reviews. 35 (6), 851-905 (2014).</li>
<li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antiproliferative+action+of+progesterone+in+uterine+epithelium+is+mediated+by+Hand2%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The antiproliferative action of progesterone in uterine epithelium is mediated by Hand2.</a> Science. 331 (6019), 912-916 (2011).</li>
<li>Wetendorf, M., DeMayo, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+progesterone+receptor+regulates+implantation%2C+decidualization%2C+and+glandular+development+via+a+complex+paracrine+signaling+network%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">The progesterone receptor regulates implantation, decidualization, and glandular development via a complex paracrine signaling network.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 357 (1-2), 108-118 (2012).</li>
<li>Boretto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+organoids+from+mouse+and+human+endometrium+showing+endometrial+epithelium+physiology+and+long-term+expandability%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Development of organoids from mouse and human endometrium showing endometrial epithelium physiology and long-term expandability.</a> Development. 144 (10), 1775-1786 (2017).</li>
<li>Turco, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term%2C+hormone-responsive+organoid+cultures+of+human+endometrium+in+a+chemically+defined+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Long-term, hormone-responsive organoid cultures of human endometrium in a chemically defined medium.</a> Nature Cell Biology. 19 (5), 568-577 (2017).</li>
<li>Kurita, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+progesterone+receptors+mediate+the+inhibitory+effects+of+progesterone+on+estrogen-induced+uterine+epithelial+cell+deoxyribonucleic+acid+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Stromal progesterone receptors mediate the inhibitory effects of progesterone on estrogen-induced uterine epithelial cell deoxyribonucleic acid synthesis.</a> Endocrinology. 139 (11), 4708-4713 (1998).</li>
<li>Kim, J. J., Kurita, T., Bulun, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progesterone+action+in+endometrial+cancer%2C+endometriosis%2C+uterine+fibroids%2C+and+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Reviews%22%5BJournal%5D)">Progesterone action in endometrial cancer, endometriosis, uterine fibroids, and breast cancer.</a> Endocrine Reviews. 34 (1), 130-162 (2013).</li>
<li>Bui, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+serum+testosterone+during+the+menstrual+cycle+evaluated+by+daily+measurements+with+an+ID-LC-MS%2FMS+method+and+a+2nd+generation+automated+immunoassay%5BTitle%5D)+AND+%22Steroids%22%5BJournal%5D)">Dynamics of serum testosterone during the menstrual cycle evaluated by daily measurements with an ID-LC-MS/MS method and a 2nd generation automated immunoassay.</a> Steroids. 78 (1), 96-101 (2013).</li>
<li>Wiwatpanit, T., Murphy, A. R., Lu, Z., Urbanek, M., Burdette, J. E., Woodruff, T. K., Kim, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaffold-free+endometrial+organoids+respond+to+excess+androgens+associated+with+polycystic+ovarian+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Endocrinology+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Scaffold-free endometrial organoids respond to excess androgens associated with polycystic ovarian syndrome.</a> The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. , (2019).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

我们已成功构建出由子宫内膜上皮细胞和间质细胞组成的人类子宫内膜类器官，且未使用任何外源性支架材料。尽管已有研究证明，原代子宫内膜上皮细胞能够形成类器官6,7，但这些细胞需嵌入由小鼠肉瘤细胞分泌的凝胶状蛋白基质（见材料表）中，以帮助形成类似球状的结构，此外，这些模型中缺乏子宫内膜间质细胞。我们推测，在本体系中，作为子宫内膜组织重要支持成分的间质细胞为上皮细胞提供了附着的支架，并在不同细胞类型之间发生了旁分泌信号交流。上皮细胞围绕间质细胞的排列方式表明两种细胞之间存在主动的相互作用，从而提供了生理性的调控信号。由于子宫内膜的激素反应依赖于上皮细胞与间质细胞之间的旁分泌相互作用4,8,9，因此我们构建的多细胞类器官为原生组织提供了一种替代性的、更为复杂的模拟体系。
<p class="jove_con...

人类子宫内膜衬于子宫腔内，是胚胎着床时的首个接触部位。子宫内膜由腔面及腺体上皮细胞、支持性的基质成纤维细胞、内皮细胞以及免疫细胞组成。这些细胞类型共同构成子宫内膜组织，该组织是对性类固醇激素反应最敏感的组织之一1。在每个月经周期中发生的组织变化十分显著。子宫内膜必须进行适当的生长和重塑，才能允许胚胎成功着床。对雌激素和孕激素的异常反应可能导致子宫内膜处于抵抗状态，无法支持妊娠的成功建立，甚至可能引发包括子宫内膜肿瘤在内的多种疾病。
为了研究子宫内膜中发生的激素反应及关键性变化，研究人员已将手术或子宫内膜活检时切除的患者子宫内膜组织中的细胞进行体外培养。子宫内膜间质细胞具有较强的增殖和传代能力，且孕酮诱导的分化过程可在体外重现。因此，关于这一被称为蜕膜化（decidualization）的分化过程，已有大量研究进展2,3。然而，子宫内膜中的另一主要细胞类型——腔隙及腺上皮细胞——在传统单层培养条件下生长不佳，容易丧失极性、进入衰老状态，且增殖潜能有限。因此，人们对这类细胞的生物学特性及其在人类子宫内膜中的作用了解较少。由于许多肿瘤起源于上皮细胞，与增生或向癌细胞转化相关的机制仍有待进一步阐明。此外，已有研究证实，激素反应涉及子宫内膜上皮细胞与间质细胞之间密切的旁分泌相互作用4,5。
最近，两个独立的研究团队建立了子宫内膜上皮细胞的三维（3D）类器官培养体系6,7，这是首次报道由子宫内膜组织形成的类器官。这些类器官由嵌入蛋白基质中的子宫内膜上皮细胞构成（材料表），但未包含子宫内膜中重要的激素响应组分——间质成纤维细胞。由于基质蛋白在不同批次间可能存在差异，并可能激活在组织中并不必然发生的信号通路，因此理想情况下应以子宫内膜自身的成分类替代这些基质蛋白。本研究提供了一种生成无支架的人子宫内膜类器官的方案，该类器官包含人子宫内膜的上皮细胞和间质细胞。间质细胞的存在不仅为上皮细胞提供了结构支持，还提供了已被证实对子宫内膜激素响应至关重要的旁分泌作用4,8,9。
新型多细胞子宫内膜类器官提供了一种简单的子宫内膜模型系统，该系统包含上皮细胞和间质细胞。这些类器官可用于研究长期激素变化以及由激素失衡或外源性损伤引起的疾病早期事件，例如肿瘤发生。这些类器官的复杂性未来有望进一步扩展，以包含其他细胞类型，包括内皮细胞、免疫细胞，甚至可能加入肌层细胞，从而真正模拟人类组织的生理状态。&#160;

<table><tbody><tr><td>琼脂糖 HS，分子生物学级</td><td>Denville Scientific</td><td>CA3510-6</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖模具</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z764043</td><td>(https://www.microtissues.com/)</td></tr><tr><td>氯化铵 (NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Cl)</td><td>Amresco</td><td>0621</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-雌二醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2257</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶 II 型，粉末</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17101015</td><td></td></tr><tr><td>中性蛋白酶</td><td>Corning</td><td>354235</td><td></td></tr><tr><td>脱氧核糖核酸酶 I (DNase I)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4513</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸 (EDTA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP120-1</td><td></td></tr><tr><td>伊红染液</td><td>VWR</td><td>95057-848</td><td></td></tr><tr><td>雌激素受体 (SP1)，兔单克隆抗体</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>RM-9101-S</td><td></td></tr><tr><td>含 DAPI 的荧光封片剂，组织学封片介质</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6057</td><td></td></tr><tr><td>Hank's 平衡盐溶液 (HBSS)</td><td>Corning</td><td>21-022-CV</td><td>1×，不含钙、镁和酚红</td></tr><tr><td>苏木精染液</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3530-32</td><td>改良 Harris 配方，无汞</td></tr><tr><td>肝素溶液</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>07980</td><td>添加至 MammoCult 培养基</td></tr><tr><td>氢化可的松储备液</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>07925</td><td>添加至 MammoCult 培养基</td></tr><tr><td>类器官培养基 - Mammocult</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>05620</td><td>补充 2 &amp;micro;L/mL 肝素和 5 &amp;micro;L/mL 氢化可的松</td></tr><tr><td>多聚甲醛，16% 溶液</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液，pH 7.4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3813</td><td></td></tr><tr><td>孕激素受体 PgR 1294，未偶联，培养上清液</td><td>Agilent Technologies</td><td>M356801-2</td><td></td></tr><tr><td>蛋白基质 - Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>纯化小鼠抗 E-钙黏蛋白抗体</td><td>BD Biociences</td><td>610181</td><td>克隆号 36</td></tr><tr><td>重组抗波形蛋白抗体 [EPR3776]</td><td>Abcam</td><td>ab92547</td><td></td></tr><tr><td>RNA 裂解与提取试剂盒</td><td>Zymo Research</td><td>R2060</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠 (NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>睾酮</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>86500</td><td></td></tr><tr><td>三色染色试剂</td><td>Abcam</td><td>ab150686</td><td></td></tr><tr><td>石蜡膜 - Parafilm</td><td>VWR</td><td>52858-000</td><td></td></tr></tbody></table>

人原代子宫内膜类器官的多细胞生成

Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids

人类子宫内膜是体内激素反应最敏感的组织之一，对妊娠的建立至关重要。该组织也可能发生病变，导致疾病甚至死亡。目前用于研究人类子宫内膜生物学的模型系统仅限于单一细胞类型的体外培养体系。此外，子宫内膜的主要细胞类型之一——上皮细胞，在培养中增殖困难且难以维持其生理特性，因此我们对子宫内膜生物学的理解仍然有限。我们首次成功构建了包含人类子宫内膜上皮细胞和间质细胞的子宫内膜类器官。这些类器官无需任何外源性支架材料，能够自发有序地组织，形成上皮细胞包绕类球状结构、极性化排列，而间质细胞位于中心并产生和分泌胶原蛋白的结构。上皮细胞和间质细胞均表达雌激素、孕激素和雄激素受体，生理性浓度的雌激素和睾酮处理可促进类器官的结构组织化。这一新型模型系统可用于以过去无法实现的方式研究正常的子宫内膜生物学及其相关疾病。

方案的示意图见图1。子宫组织经病理学家检查后，从手术标本中获取。通过刮取法将子宫内膜层与肌层分离，并按照本方案所述，采用酶消化法将子宫内膜组织解离为单个细胞。上皮细胞和间质细胞被加入琼脂糖模具中的微孔内。培养7天后，类器官额外接受雌二醇（E）和睾酮（T）处理，持续7−14天。
进行组织学处理时，将含有子宫内膜类器官的琼脂糖模具用琼脂糖封固，随后用4%多聚甲醛（PFA）固定过夜。这些模具按标准程序进行石蜡包埋、切片，并用于组织学染色、免疫荧光或免疫组织化学分析。苏木精和伊红（H&amp;E）染色（图2A）显示类球状结构，外周由单层细胞排列，中心区域含有细胞。子宫内膜上皮细胞（E-钙黏蛋白）和间质细胞（波形蛋白）的特异性标记物染色显示，上皮细胞位于类器官外围，间质细胞位于中心区域（图2B）。
<p class="jove_conten...

本文介绍了一种生成人原代子宫内膜类器官的方案，该类器官包含上皮细胞和间质细胞，并保留了天然子宫内膜组织的特性。本方案详细描述了从子宫组织获取到子宫内膜类器官组织学处理的全过程。

人类子宫内膜是体内对激素反应最敏感的组织之一，对于妊娠的建立至关重要。该组织可以……

子宫内膜是一种每月随激素变化而发生改变的组织。激素失衡可能阻碍胚胎着床，并导致癌症等疾病。我们的实验方案可重建子宫内膜，使其能够在体外以生理学方式被研究。该技术的主要优势在于，它能够提供由两种具有激素响应性的细胞类型（即上皮细胞和间质细胞）组成的细胞三维结构，这些细胞能够像在体内一样进行特定的组织排列并表现出相应的生物学行为。由于类器官能够更好地模拟组织功能，因此最终可用于测试不同的药物。子宫内膜类器官可用于研究目前已知的癌症风险因素（包括肥胖和多囊卵巢综合征）所产生的直接效应。我们的类器官强调了两种细胞类型之间旁分泌作用的重要性。起始时需要有足够的组织量。获得适当密度的上皮细胞和间质细胞可能较为困难。此外，类器官体积较小，使用免疫组化染色进行观察较为困难。该操作过程的可视化非常重要，因为其中一些步骤在实际观察后会更容易理解，包括获取子宫的正确组织层、获得合适的细胞密度用于混合，以及在琼脂糖模具中接种细胞。开始细胞分离前，根据制造商说明书制备并平衡用于培养类器官的1.5%琼脂糖微模具。在生物安全柜中，采用无菌技术在37摄氏度下配制酶溶液，并使用0.2微米注射器滤器将溶液过滤至15毫升锥形管中。使用手术刀从子宫活检组织上刮取子宫内膜，并将组织切碎成非常小的片段。将新鲜切碎的组织放入含有酶溶液的15毫升锥形管中。盖紧管盖，并用石蜡膜包裹管口以防止污染。将管子置于37摄氏度水浴或培养箱中，轻轻振荡孵育30分钟。此后，将一个100微米的细胞筛置于50毫升锥形管上，再在其上方叠加一个20微米的细胞筛。将溶液通过这两个筛网进行过滤。用HBSS冲洗15毫升锥形管，并将洗涤液一并过筛，以确保收集全部细胞。然后，将20微米细胞滤筛倒置在新的50毫升锥形管上，用20毫升添加了1%青霉素和链霉素的类器官培养基将上皮细胞从滤筛上冲洗下来。将锥形管在500 × g离心5分钟。对于收集的间质细胞，弃去上清液，并将沉淀重悬于10毫升红细胞裂解缓冲液中。在37摄氏度下孵育10至15分钟。将这些细胞在500 ×g下离心5分钟。弃去上清液，并用200至300 µL类器官培养基重悬沉淀。对于收集的上皮细胞，弃去上清液，并将沉淀重悬于100 µL类器官培养基中。待1.5%琼脂糖模具平衡后，移除琼脂糖模具外部的类器官培养基，并倾斜组织培养板，以便小心移除琼脂糖培养皿细胞接种室中的培养基。在显微镜下观察上皮细胞和间质细胞悬液，并向悬液中添加更多类器官培养基，每次仅添加100 µL，确保各悬液的密度大致相等。然后按体积将一份基质细胞与三份上皮细胞混合。用移液器将50微升混合后的细胞悬液加入琼脂糖模具的细胞接种室中。待琼脂糖模具接种细胞后，小心向24孔板的各孔中加入400微升新鲜类器官培养基。在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育，每隔两天更换一次培养基，每次加入500微升类器官培养基。七天后，将培养基更换为添加了0.1纳摩尔雌二醇和0.8纳摩尔睾酮的培养基，以促进上皮细胞和间质细胞的有序排列。首先，将1.5%琼脂糖溶于PBS中，通过煮沸使其溶解。将液态琼脂糖放入盛有热水的烧杯中，使其冷却至约50摄氏度。在解剖显微镜下，倾斜24孔板，用移液器小心吸出琼脂糖模具外部的培养基，然后小心吸出琼脂糖模具内部的培养基，避免破坏类器官。小心地将 70 至 75 微升温热的 1.5% 琼脂糖加入琼脂糖培养皿的腔室中，注意不要扰动类器官。将培养板置于 4°C 冷却 5 分钟。随后，在 24 孔板的每孔中加入 4% 多聚甲醛，于 4°C 对整个密封的琼脂糖模具固定过夜。第二天，将培养板置于70%乙醇中，4摄氏度保存，直至准备进行石蜡包埋处理。开始RNA提取前，在解剖显微镜下观察培养板。倾斜培养板，小心地用移液器从琼脂糖模具的腔室中吸出培养基。用力将一毫升新鲜类器官培养基直接吹入琼脂糖模具中，使类器官从微孔中冲出，注意避免产生过多气泡。使用相同的培养基，重复此强力吹打操作一次。随后，收集含有类器官的全部培养基。以500 ×g离心收集类器官，随后进行RNA提取。在本研究中，人类子宫内膜类器官由子宫内膜的上皮细胞和间质细胞组成，且未使用外源性支架材料进行培养。对于组织学处理，将含有子宫内膜类器官的琼脂糖模具用琼脂糖封固，随后用4%多聚甲醛固定过夜。这些组织块经过标准石蜡包埋处理，切片后进行组织学、免疫荧光或免疫组织化学染色。苏木精-伊红染色中的苏木精显示类球状结构，外层由单层细胞排列，中心区域也含有细胞。子宫内膜上皮细胞和间质细胞的特异性标记物显示，类器官周围为上皮细胞，中心区域为间质细胞。子宫内膜生理学标志物证实，子宫内膜类器官保留了原生组织的某些特性。三色染色法可将胶原染成蓝色、细胞染成红色，结果显示在间质细胞所在的中心区域存在胶原，表明间质细胞活跃地产生和分泌胶原，类似于原生组织。此外，免疫组织化学染色显示上皮细胞和间质细胞中均存在雌激素受体、雄激素受体和孕激素受体。接种细胞时密度要足够高，以确保我们获得足够的类器官用于后续实验。这需要一些练习。子宫内膜类器官可在不同条件下培养，随后收获用于免疫组织化学或免疫荧光染色等实验以研究蛋白质表达，或收获用于提取RNA以研究基因表达。我们的实验室研究子宫内膜如何响应激素水平的变化，这种变化可能导致子宫内膜增生和癌症。我们可以利用这些类器官进行长期的激素处理，并添加多囊卵巢综合征中常见的睾酮过量等病理条件，或来自脂肪细胞的信号，以研究肥胖引起的子宫内膜改变。人体组织被视为生物危害物，采取适当的防护措施至关重要。

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

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