Name: 通过总内部反射荧光显微镜与数量和亮度分析相结合，活细胞中细胞表面受体的显微化动力学 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: 了解全内反射荧光显微镜结合数量与亮度分析技术，用于活细胞HeLa细胞表面受体寡聚化动力学实时成像研究。该方法可追踪FGFR1-mEGFP分子扩散并测定配体结合后的平均寡聚状态。

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国家心血管研究中心（CNIC）由科学、创新与大学部以及Pro CNIC基金会提供支持，并被授予塞韦罗·奥乔亚卓越中心（SEV-2015-0505）称号。&#160;我们还得到了欧洲区域发展基金（FEDER）的支持 &#34;一种构建欧洲的方式&#34;. UC 感谢意大利癌症研究协会、国际癌症研究协会（现名为全球癌症研究）以及意大利卫生部的支持。A.T. 感谢 &#34;隆巴迪亚山地银行基金会&#34; 部分支持其获得光伏奖学金期间的研究工作 &#34;伊瓦诺·贝基职业能力项目&#34; 2011-2012.

1. 样品制备
<ol>
	<li>第1天。在玻璃底培养皿中，以每毫升100,000–200,000个细胞的浓度，将HeLa细胞接种于完全培养基中。接种6–8个重复培养皿。 
	注意：本示例中，培养基添加了10%热灭活胎牛血清（FBS）、1 mM丙酮酸钠、100 U/100 µg青霉素/链霉素。需准备多个重复培养皿。</li>
	<li>第2–3天。当细胞处于亚汇合状态时，在无血清培养基中将一半培养皿转染目标蛋白质粒，另一半转染参考质粒（单体和二聚体）。 
	注意：转染在补充有抗生素、0.1%牛血清白蛋白和25 mM HEPES缓冲液（不含酚红）的无血清培养基中进行。</li>
	<li>第3–4天。检查转染后的细胞是否贴附于培养皿底部，且细胞膜呈现荧光。弃去细胞过度生长或荧光信号极弱的培养皿。 
	注意：避免细胞过度生长。细胞应分布均匀，并贴附于培养皿的玻璃区域（图1A）。可使用预先包被的玻璃底培养皿以促进细胞贴附。所有细胞培养在实验前均需检测支原体污染。本示例中，实验组细胞使用(A207K)mEGFP-FGFR1质粒转染，对照细胞则分别转染GPI-(A207K)mEGFP和GPI-(A207K)mEGFP-(A207K)mEGFP质粒，转染操作按标准方案进行。进行活细胞显微成像时，建议使用无指示剂培养基；添加25 mM HEPES缓冲液以防止成像过程中pH值变化。</li>
</ol>
2. TIRF 成像——激光线的对准与 TIRF 照明的优化
<ol>
	<li>实验前4小时，启动显微镜的37 °C恒温培养箱。</li>
	<li>打开显微镜、计算机和相机，并等待相机达到正常工作温度。 
	注意：本研究所用相机的工作温度为-75 °C。</li>
	<li>在物镜上滴加少量镜油。将样品培养皿放置到位。关闭培养箱门，使培养皿温度平衡约10分钟。</li>
	<li>打开落射荧光光源和488 nm激光器。</li>
	<li>选择落射荧光对比模式，通过目镜观察样品，寻找一个细胞进行对焦。 
	注意：通过目镜寻找细胞时，使用荧光灯并非必需，也可使用合适的激光谱线代替。</li>
	<li>选择合适的滤光片，用于通过显微镜相机采集绿色荧光信号（激发滤光片：490/20 (500) 带通，发射滤光片：525/50 带通，或类似规格）。</li>
	<li>在落射荧光模式下，将光路从目镜切换至相机端口（图1中的相机#1），精细调节对焦，然后切换至全内反射荧光（TIRF）模式。落射荧光与TIRF模式的具体名称可能因显微镜品牌不同而有所差异。 
	注意：若盖玻片界面缺乏荧光标记物，可能难以对焦或校准激光。为正确校准激光（对获得良好TIRF图像至关重要），应对焦于盖玻片。通常很难判断盖玻片是否处于焦点位置，建议可尝试对焦于细胞边缘。</li>
	<li>根据TIRF显微镜的操作说明，启动自动校准程序。 
	注意：简要说明步骤2.4至2.8：首先通过目镜找到细胞并进行对焦，然后将荧光信号导向TIRF显微镜的相机端口，在显微镜计算机屏幕上重新对焦细胞，并启动激光校准程序。校准过程的关键是找到激发光发生全反射的临界角（图3）。不同品牌的商用显微镜可能具有略有差异的校准流程，部分系统可完全自动化；有些系统还配备小型相机，以辅助观察临界角条件。</li>
	<li>选择合适的照明深度，并优化隐逝场的方向（图3）。 
	注意：所有对照组和样品均保持相同的穿透深度。</li>
</ol>
3. 全内反射荧光成像：时间序列的采集
<ol>
	<li>定义一个至少为 256 x 256 像素的感兴趣区域（ROI）。 
	注意： 在本实验设置中，图像采集通过相机 #2 在仅直接控制相机的软件下完成（参见 图 1 图注）。</li>
	<li>将曝光时间设为 1 ms，EM 增益设为 1,000（即公式 12 和 13 中的 G 因子）。在此速度下，可能需要调整或增加激光功率。本实验中激光功率为 0.5 mW。 
	注意： 根据相机类型以及蛋白扩散系数、荧光强度和背景的限制，设定激光功率的一般原则是避免探测器饱和、最小化光漂白，并在合理的信噪比（S/N）下尽可能快速地采集图像。EM 增益始终设置为相机允许的最大值（见引言部分）。</li>
	<li>在初始条件下运行一次初步序列，并粗略估算信噪比（S/N）值。在第一次时间序列的第一帧中测得的 S/N 值达到 2–3 或更高时，条件可接受。</li>
	<li>使用连接相机 #2 与显微镜的发射光分光系统滑块，遮蔽图像的一侧（图 1B，图 4A-B）。 
	注意： 在本实验设置中，相机 #2 上安装了多通道成像连接器，以实现同时获取两个空间位置完全相同的图像。该系统配备可安装不同发射滤光片的滑槽。其中一个滑槽安装有黑色遮蔽片，用于覆盖图像的一侧。被遮蔽的区域用于每个时间序列的内部校准，以确定相机参数（公式 12 和公式 13）。这样就无需独立的校准步骤，更重要的是，校准与每个时间序列的采集同步进行。若无此系统，可采用已发表的方案对相机进行校准33。</li>
	<li>选择相机的文件自动保存选项。</li>
	<li>开始图像序列的采集。至少采集 700 帧，且信噪比（S/N）最低为 2。 
	注意： 分析所需的帧数取决于样品对光漂白的稳定性以及数据的离散程度。因此，每个时间序列的质量将在 N&amp;B 分析过程中进行评估。</li>
	<li>在不将培养皿移出显微镜的情况下，加入配体。</li>
	<li>选择一个细胞膜荧光较强的细胞，并迅速开始动力学实验的第一个时间序列采集。 
	注意： 若配体添加操作迅速，则此次采集即定义为配体动力学的起始时间点（t = 0）。软件会记录采集的精确时间。</li>
	<li>寻找第二个细胞，并采集动力学的第二个时间点。 
	注意： 某些配备 x,y,z 电动载物台的显微镜提供点位访问程序。这些程序可记忆培养皿上的多个位置，有助于在不同细胞间的时间序列采集之间保持更恒定的时间间隔。</li>
	<li>在动力学实验的每个时间点均采集一个新细胞。 
	注意： 采集后，细胞会经历部分光漂白，无法再次成像。因此，动力学数据通过整合多个细胞的时间序列获得，每个细胞在不同的时间点被采集。</li>
	<li>对于每个新的培养皿，重复步骤 2.3 至 3.9。 
	注意： 对于对照组培养皿，加入与配体等体积的溶剂（含 0.01% 牛血清白蛋白的 PBS）。</li>
</ol>
4. 数量与亮度（N&amp;B）：时间序列的质量检测
<ol>
	<li>使用相机软件获取的文件（本示例中为 .sif 文件）转换并保存为 .TIFF 格式。</li>
	<li>通过启动 N&amp;B 图形用户界面（GUI）MATLAB，将 .TIFF 文件导入分析软件程序。 
	注意：此处使用定制的 Matlab 可执行 N&amp;B 程序（N&amp;B 分析详见 https://www.cnic.es/en/investigacion/2/1187/tecnologia）。打开导入的 .TIFF 文件后，该程序将生成平均强度图像、平均强度分布图，并允许逐帧查看图像序列（补充图1）。其他可用于 N&amp;B 分析的软件也可使用（例如 SimFCS 软件）。</li>
	<li>排除平均强度分布图显示光漂白超过 10% 的序列，以及在采集过程中出现明显细胞膜形变或位移的序列。</li>
	<li>裁剪明显失焦的帧。 
	注意：该程序内置裁剪工具，可用于剔除图像序列中的单个或多个帧。由于帧间时间并非关键因素，而像素驻留时间（曝光时间）至关重要，因此该操作是允许的（见讨论部分）。</li>
	<li>仅保留包含至少 500 个时间帧的序列用于后续分析。</li>
</ol>
5. 数字与亮度（N&amp;B）：相机参数（偏移量、σ 和 S）的测定
<ol>
	<li>启动校准相机程序。</li>
	<li>在探测器噪声区域中选择至少 20 × 50 像素的区域（图4）。 
	注意：该程序将生成数值（也称为数字灰度级，DL）的直方图，并返回频率相对于数字灰度级的对数图。</li>
	<li>在频率对数与数字灰度级的图中，移动线性红色光标以划分曲线的高斯部分和线性部分。 
	注意：红色光标将曲线分为两个部分，并触发程序返回偏移量（即相机响应高斯函数的中心值）、高斯拟合的标准差 σ，以及 S 因子（即相机响应线性部分的斜率）（图4C-D）。</li>
</ol>
6. 数量与亮度（N&amp;B）：选定感兴趣区域（ROI）中B值的计算
<ol>
	<li>激活 B 键。 
	注意： 此操作将生成平均强度图像（图5，第一列）以及B图像，其中每个单独的B值与图像中对应的像素相关联（补充图1）。</li>
	<li>应用最小合并像素（2×2）以减少数据的离散性，并生成B-I直方图（图5，第二列）。 
	注意： B-I直方图表示图像中所有像素的B值分布相对于像素强度的分布情况。Y = B/S；X = (<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq1.jpg" alt="静态平衡方程 ΣFx=0 示意图，展示力平衡与矢量叠加。" data-altupdatedat="1788282455000"> - 偏移量)/S（补充图1 以及公式11和15）。</li>
	<li>使用交互式方形光标检查B-I直方图。</li>
	<li>为分析选择一个方形感兴趣区域（ROI）（图5，第三列）。 
	注意： 光标会在平均强度图像上同步一个可移动的掩膜，突出显示位于方形光标区域内的像素（补充图1）。通过此检查，可将背景及强度极低的区域从分析中排除。</li>
	<li>生成所选ROI的B图（图5，第四列）。</li>
	<li>保存与所选区域相关的B值的ASCII文件。</li>
	<li>将ASCII文件导入图形软件，以计算数据的频率分布，并获得平均B值 ± 标准误（S.E）（图5，第五列）。 
	注意： 若数据均一，B值的频率分布近似于高斯分布。</li>
	<li>应用公式15，推导每个细胞在动力学实验各时间点的平均亮度 <img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq18.jpg" alt="静态平衡示意图，ΣFx=0，ΣFy=0，显示梁上的受力；力学分析设置。" data-altupdatedat="1788282455000"> = <img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq19.jpg" alt="静态平衡，ΣFx=0 示意图，平衡分析中的受力，物理学教学资源。" data-altupdatedat="1788282455000"> - 1 [（计数/分子）每驻留时间]。根据以下公式对数据进行归一化： 
	<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq17.jpg" alt="说明静态平衡概念的方程；公式：ε'_t/ε'_0 = (B'_t-1)/(B'_0-1)。" data-altupdatedat="1788282455000"> 
	其中 <img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq20.jpg" alt="静态平衡方程 ΣFx=0；受力示意图；物理学分析中的矢量分解。" data-altupdatedat="1788282455000"> 是在加入配体后时间“t”测得的平均B值，而 <img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq21.jpg" alt="核磁共振波谱中的磁场 \(\langle B'_{0} \rangle\)，附光谱拟合图。" data-altupdatedat="1788282455000"> 是在t=0时（加入配体后10-20秒）测得的平均B值。 
	注意： 对结果进行归一化可实现不同日期进行的实验之间的直接比较，从而补偿由于激光功率和技术波动引起的亮度测量差异。</li>
	<li>绘制归一化平均亮度随采集时间的变化曲线，以构建动力学曲线（图6）。</li>
</ol>

<ol><li>Agwuegbo, U. C., Jonas, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+functional+insights+into+gonadotropin+hormone+receptor+dimerization+and+oligomerization%5BTitle%5D)+AND+%22Minerva+Ginecologica%22%5BJournal%5D)">Molecular and functional insights into gonadotropin hormone receptor dimerization and oligomerization.</a> Minerva Ginecologica. 70 (5), 539-548 (2018).</li>
<li>Ferre, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+protein-coupled+receptor+oligomerization+revisited%3A+functional+and+pharmacological+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Reviews%22%5BJournal%5D)">G protein-coupled receptor oligomerization revisited: functional and pharmacological perspectives.</a> Pharmacological Reviews. 66 (2), 413-434 (2014).</li>
<li>Marsango, S., Ward, R. J., Alvarez-Curto, E., Milligan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscarinic+receptor+oligomerization%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Muscarinic receptor oligomerization.</a> Neuropharmacology. 136 (Pt C), 401-410 (2018).</li>
<li>Oishi, A., Cecon, E., Jockers, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melatonin+Receptor+Signaling%3A+Impact+of+Receptor+Oligomerization+on+Receptor+Function%5BTitle%5D)+AND+%22International+Review+of+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Melatonin Receptor Signaling: Impact of Receptor Oligomerization on Receptor Function.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 338, 59-77 (2018).</li>
<li>Thelen, M., Munoz, L. M., Rodriguez-Frade, J. M., Mellado, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokine+receptor+oligomerization%3A+functional+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Chemokine receptor oligomerization: functional considerations.</a> Current Opinion in Pharmacology. 10 (1), 38-43 (2010).</li>
<li>Van Craenenbroeck, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GPCR+oligomerization%3A+contribution+to+receptor+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Subcellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">GPCR oligomerization: contribution to receptor biogenesis.</a> Subcellular Biochemistry. 63, 43-65 (2012).</li>
<li>Wnorowski, A., Jozwiak, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homo-+and+hetero-oligomerization+of+beta2-adrenergic+receptor+in+receptor+trafficking%2C+signaling+pathways+and+receptor+pharmacology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Signaling+Technology%22%5BJournal%5D)">Homo- and hetero-oligomerization of beta2-adrenergic receptor in receptor trafficking, signaling pathways and receptor pharmacology.</a> Cell Signaling Technology. 26 (10), 2259-2265 (2014).</li>
<li>Fricke, F., Dietz, M. S., Heilemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+methods+to+study+membrane+receptor+oligomerization%5BTitle%5D)+AND+%22Chemphyschem%22%5BJournal%5D)">Single-molecule methods to study membrane receptor oligomerization.</a> Chemphyschem. 16 (4), 713-721 (2015).</li>
<li>Vidi, P. A., Ejendal, K. F., Przybyla, J. A., Watts, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+protein+complementation+assays%3A+new+tools+to+study+G+protein-coupled+receptor+oligomerization+and+GPCR-mediated+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Fluorescent protein complementation assays: new tools to study G protein-coupled receptor oligomerization and GPCR-mediated signaling.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 331 (2), 185-193 (2011).</li>
<li>Trussell, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTrussell%2C+HJ+%22Academic+Press+Library+in+Signal+Processing%22">Academic Press Library in Signal Processing</a>. Trussell, J., et al. 4, Elsevier. 3-9 (2014).</li>
<li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li>
<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+%28STORM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).</li>
<li>Nagerl, U. V., Willig, K. I., Hein, B., Hell, S. W., Bonhoeffer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+imaging+of+dendritic+spines+by+STED+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Live-cell imaging of dendritic spines by STED microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18982-18987 (2008).</li>
<li>Tsekouras, K., Custer, T. C., Jashnsaz, H., Walter, N. G., Presse, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+to+accurately+locate+and+count+large+numbers+of+steps+by+photobleaching%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">A novel method to accurately locate and count large numbers of steps by photobleaching.</a> Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3601-3615 (2016).</li>
<li>Godin, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revealing+protein+oligomerization+and+densities+in+situ+using+spatial+intensity+distribution+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Revealing protein oligomerization and densities in situ using spatial intensity distribution analysis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (17), 7010-7015 (2011).</li>
<li>Qian, H., Elson, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+molecular+aggregation+by+analysis+of+fluctuation+moments%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Distribution of molecular aggregation by analysis of fluctuation moments.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (14), 5479-5483 (1990).</li>
<li>Chen, Y., Muller, J. D., So, P. T., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+photon+counting+histogram+in+fluorescence+fluctuation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">The photon counting histogram in fluorescence fluctuation spectroscopy.</a> Biophysical Journal. 77 (1), 553-567 (1999).</li>
<li>Dalal, R. B., Digman, M. A., Horwitz, A. F., Vetri, V., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+particle+number+and+brightness+using+a+laser+scanning+confocal+microscope+operating+in+the+analog+mode%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+and+Technique%22%5BJournal%5D)">Determination of particle number and brightness using a laser scanning confocal microscope operating in the analog mode.</a> Microscopy Research and Technique. 71 (1), 69-81 (2008).</li>
<li>Unruh, J. R., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+molecular+concentration+and+brightness+from+fluorescence+fluctuation+data+with+an+electron+multiplied+CCD+camera%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Analysis of molecular concentration and brightness from fluorescence fluctuation data with an electron multiplied CCD camera.</a> Biophysical Journal. 95 (11), 5385-5398 (2008).</li>
<li>Hess, S. T., Huang, S., Heikal, A. A., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+and+chemical+applications+of+fluorescence+correlation+spectroscopy%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Biological and chemical applications of fluorescence correlation spectroscopy: a review.</a> Biochemistry. 41 (3), 697-705 (2002).</li>
<li>Muller, J. D., Chen, Y., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Fluorescence correlation spectroscopy.</a> Methods in Enzymology. 361, 69-92 (2003).</li>
<li>Levi, V., Ruan, Q., Kis-Petikova, K., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+FCS%2C+a+novel+method+for+three-dimensional+particle+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Scanning FCS, a novel method for three-dimensional particle tracking.</a> Biochemical Society Transactions. 31 (Pt 5), 997-1000 (2003).</li>
<li>Hinde, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+the+dynamics+of+the+oligomeric+transcription+factor+STAT3+by+pair+correlation+of+molecular+brightness%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Quantifying the dynamics of the oligomeric transcription factor STAT3 by pair correlation of molecular brightness.</a> Nature Communications. 7, 11047(2016).</li>
<li>Waithe, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+processing+and+analysis+of+conventional+confocal+microscopy+generated+scanning+FCS+data%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Optimized processing and analysis of conventional confocal microscopy generated scanning FCS data.</a> Methods. 140-141, 62-73 (2018).</li>
<li>Digman, M. A., Dalal, R., Horwitz, A. F., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+number+of+molecules+and+brightness+in+the+laser+scanning+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Mapping the number of molecules and brightness in the laser scanning microscope.</a> Biophysical Journal. 94 (6), 2320-2332 (2008).</li>
<li>Ossato, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+two-step+path+to+inclusion+formation+of+huntingtin+peptides+revealed+by+number+and+brightness+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">A two-step path to inclusion formation of huntingtin peptides revealed by number and brightness analysis.</a> Biophysical Journal. 98 (12), 3078-3085 (2010).</li>
<li>Nagy, P., Claus, J., Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+resting+and+ligand-bound+ErbB1+and+ErbB2+receptor+tyrosine+kinases+in+living+cells+using+number+and+brightness+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Distribution of resting and ligand-bound ErbB1 and ErbB2 receptor tyrosine kinases in living cells using number and brightness analysis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (38), 16524-16529 (2010).</li>
<li>Ming, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+and+Distribution+of+Klothobeta+%28KLB%29+and+fibroblast+growth+factor+receptor-1+%28FGFR1%29+in+living+cells+reveal+the+fibroblast+growth+factor-21+%28FGF21%29-induced+receptor+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Dynamics and Distribution of Klothobeta (KLB) and fibroblast growth factor receptor-1 (FGFR1) in living cells reveal the fibroblast growth factor-21 (FGF21)-induced receptor complex.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (24), 19997-20006 (2012).</li>
<li>Ross, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligomerization+state+of+dynamin+2+in+cell+membranes+using+TIRF+and+number+and+brightness+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Oligomerization state of dynamin 2 in cell membranes using TIRF and number and brightness analysis.</a> Biophysical Journal. 100 (3), L15-L17 (2011).</li>
<li>Hellriegel, C., Caiolfa, V. R., Corti, V., Sidenius, N., Zamai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Number+and+brightness+image+analysis+reveals+ATF-induced+dimerization+kinetics+of+uPAR+in+the+cell+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Number and brightness image analysis reveals ATF-induced dimerization kinetics of uPAR in the cell membrane.</a> FASEB J. 25 (9), 2883-2897 (2011).</li>
<li>Zamai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Number+and+brightness+analysis+reveals+that+NCAM+and+FGF2+elicit+different+assembly+and+dynamics+of+FGFR1+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Number and brightness analysis reveals that NCAM and FGF2 elicit different assembly and dynamics of FGFR1 in live cells.</a> Journal of Cell Science. 132 (1), (2019).</li>
<li>Hassler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+internal+reflection+fluorescence+correlation+spectroscopy+%28TIR-FCS%29+with+low+background+and+high+count-rate+per+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Total internal reflection fluorescence correlation spectroscopy (TIR-FCS) with low background and high count-rate per molecule.</a> Optics Express. 13 (19), 7415-7423 (2005).</li>
<li>Di Rienzo, C., Gratton, E., Beltram, F., Cardarelli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+fast+fluorescence+imaging+to+molecular+diffusion+law+on+live+cell+membranes+in+a+commercial+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">From fast fluorescence imaging to molecular diffusion law on live cell membranes in a commercial microscope.</a> Journal of Visualized Experiments. (92), e51994(2014).</li>
<li>Beenken, A., Mohammadi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+FGF+family%3A+biology%2C+pathophysiology+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">The FGF family: biology, pathophysiology and therapy.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 8 (3), 235-253 (2009).</li>
<li>Joubert, J., Sharma, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+microscopy+digital+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Light microscopy digital imaging.</a> Current Protocols in Cytometry. , (2011).</li>
<li>Gell, C., Berndt, M., Enderlein, J., Diez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TIRF+microscopy+evanescent+field+calibration+using+tilted+fluorescent+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">TIRF microscopy evanescent field calibration using tilted fluorescent microtubules.</a> Journal of Microscopy. 234 (1), 38-46 (2009).</li>
<li>Burghardt, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+incidence+angle+for+through-the-objective+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Measuring incidence angle for through-the-objective total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Journal of Biomedical Optics. 17 (12), 126007(2012).</li>
<li>Trullo, A., Corti, V., Arza, E., Caiolfa, V. R., Zamai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+limits+and+data+correction+in+number+of+molecules+and+brightness+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+and+Technique%22%5BJournal%5D)">Application limits and data correction in number of molecules and brightness analysis.</a> Microscopy Research and Technique. 76 (11), 1135-1146 (2013).</li>
<li>Caiolfa, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monomer-dimer+dynamics+and+distribution+of+GPI-anchored+uPAR+are+determined+by+cell+surface+protein+assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Monomer-dimer dynamics and distribution of GPI-anchored uPAR are determined by cell surface protein assemblies.</a> Journal of Cell Biology. 179 (5), 1067-1082 (2007).</li>
<li>Campbell, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+monomeric+red+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A monomeric red fluorescent protein.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (12), 7877-7882 (2002).</li>
<li>Cutrale, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+enhanced+number+and+brightness+to+measure+protein+oligomerization+dynamics+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Using enhanced number and brightness to measure protein oligomerization dynamics in live cells.</a> Nature Protocols. 14 (2), 616-638 (2019).</li>
<li>Dunsing, V., Chiantia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Fluorescence+Fluctuation+Spectroscopy+Assay+of+Protein-Protein+Interactions+at+Cell-Cell+Contacts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts.</a> Journal of Visualized Experiments. (142), (2018).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在选择细胞模型和标记策略时，N&amp;#38;B 方法需要注意若干事项。该方法仅适用于在整个图像采集期间能够稳定贴壁的活细胞。由于细胞整体刚性位移引起的额外波动，可通过适当的图像重建方法进行处理38。然而，通常情况下，当细胞发生移动时，细胞膜也会随之变形，而结构形变所产生的较大额外方差会严重限制对膜蛋白的分析。本研究中，荧光标记的构建体在 HeLa 细胞系中表达，因为该细胞系中内源性 FGFR1 的表达可忽略不计。必须避免内源性蛋白的存在，否则可能会形成荧光与非荧光受体寡聚体的混合群体。因此，基于仅荧光标记蛋白群体亮度的 N&amp;#38;B 分析将无法可靠地估计平均寡聚状态。这一问题在应用 N&amp;#38;B 检测受体二聚化事件时尤为关键，例如在 FGF2 配体存在下 FGFR1 的二聚化，其亮度仅增加 2 倍。在此情况下，混合二聚体的存在可能完全掩盖 N&amp;#38;B 可检测到的二聚化事件。除非标记蛋白大量过表达，否则荧光寡聚体与非荧光内源性形式的共存是任何基于荧光检测方法的潜在缺陷之一。然而，在蛋白过表达条件下进行寡聚化研究，会引发对其功能相关性的担忧。瞬时转染的细胞通...

我们介绍一种全内反射荧光-计数与亮度（TIRF-N&amp;B）成像方法，用于确定活细胞质膜上受体分子的平均寡聚状态，旨在将受体组装动力学与蛋白质的生物学功能联系起来（图1）。
当细胞外配体结合后，受体根据其构象、寡聚化状态、潜在的共受体以及膜组成，启动细胞内信号转导。尽管受体寡聚化在细胞信号传导中具有重要性和普遍性，并被公认为关键事件1,2,3,4,5,6,7，但目前能够检测聚簇事件并实验测定聚簇程度的方法仍十分有限8,9。共聚焦显微镜的检测体积（x,y ≈ 300 nm，z ≈ 900 nm）分辨率不足以证明分子间的相互作用和化学计量关系，即使通过图像重建算法优化后仍如此10。即使采用x,y分辨率达20–70 nm的超分辨率成像技术（如PALM11、STORM12和STED13），也无法仅基于空间位置解析蛋白质寡聚体的亚基组成。此外，这些技术的时间分辨率（每幅图像需数分钟）无法追踪秒级动力学过程。单分子步进漂白法仅在蛋白质寡聚体处于静止状态时才能解析其化学计量比14。
测量单幅图像中荧光标记蛋白密度与寡聚化的最通用方法之一是空间强度分布分析（SpIDA），该方法依赖于空间采样。SpIDA适用于化学固定细胞和活细胞，可利用标准荧光显微镜同时分析细胞内多个感兴趣区域。15或者，可采用矩方法，例如荧光相关光谱法（FCS）16，光子计数直方图（PCH）17，以及数量与亮度（N&amp;B)18,19适用于定量测量寡聚体。这些方法通过分析荧光分子在进出照明体积时随时间变化的荧光强度波动，来获取信息。强度波动的幅度可由荧光分子的分子亮度（ε）以及照明体积内荧光分子的平均数量（n）唯一确定。17 (图2通常，可通过FCS获得荧光分子的扩散系数以及照明体积内的平均分子数（与G(0)值成反比）。20然而，由于扩散时间仅与分子质量的立方根成正比，荧光相关光谱法（FCS）对分子质量变化的检测灵敏度不足。21在实际应用中，单色FCS无法检测膜受体的二聚化。PCH能够准确分辨不同寡聚体的混合物。通过利用光强分布的两个以上矩量，它可以检测占据相同照明体积但亮度不同的分子。扫描FCS22 以及一些新进展，例如有趣的分子亮度对相关（pCOMB）方法23，旨在拓展荧光相关方法在生物系统中的适用范围24仍是单点测量方法，无法在细胞的大范围内快速测量，需要在每个像素点进行连续多次观测，数据采集耗时以秒计。
N&amp;B 是 PCH 的一种简化形式，仅考虑荧光分布幅度的一阶矩和二阶矩，即平均强度&lt;I&gt;和方差 σ2（图2）18,19。因此，N&amp;B 无法确定混合物中未知寡聚体的摩尔分数，只能估算混合物的平均寡聚化状态。然而，N&amp;B 的优势在于，它能够在单个像素基础上，通过监测荧光强度随时间的变化波动，使用比 PCH 更短的时间序列图像即可完成分析。由于 N&amp;B 将每个像素的采集时间缩短至几微秒，因此可在较大的细胞区域内追踪快速的寡聚化动力学过程，使得在光栅扫描显微镜（如共聚焦、双光子显微镜）中图像采集的时间尺度达到秒级，在基于相机的显微镜（如全内反射荧光显微镜 TIRFM）中则达到毫秒级。
已有多个研究报告表明，通过成像细胞的较大区域，N&amp;B技术能够定量分析蛋白质簇中的亚基数目。在CHO-K1细胞的黏附位点处检测到Paxillin-EGFP簇25，并在COS-7细胞中描述了致病性Httex1p肽的细胞内聚集现象26。N&amp;B已被用于追踪ErbB受体的配体驱动寡聚化过程27，以及配体FGF21对HeLa细胞中Klothob（KLB）和FGFR1c的影响28。结合全内反射荧光（TIRF）成像与N&amp;B分析，研究显示dynamin-2在整个细胞膜上主要以四聚体形式存在29。我们将N&amp;B应用于光栅扫描和TIRF图像，证实了uPAR和FGFR1细胞膜受体的配体驱动二聚化30,31。
荧光相关方法（如N&amp;B、FCS和PCH）基于这样一个概念：在开放体积中，粒子的占据数遵循泊松分布。由于只能检测到荧光分子所发射的光子，因此图像中某像素随时间变化的测量荧光强度的平均值 <img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq1.jpg" alt="静态平衡方程 ΣFx=0 示意图，展示力的平衡与矢量叠加。" data-altupdatedat="1788282455000"> 等于照明体积内荧光分子的平均数量 n 与其分子亮度 ε 的乘积17：
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq2.jpg" alt="静力平衡方程，ΣFx=0，示意图；力学分析中的概念，力平衡计算。" data-altupdatedat="1788282455000">
其中，ε 表示当分子位于照明体积中心时，每个分子在单位时间内（通常为每秒）发射的光子数。
亮度是给定采集条件下每种荧光团的固有属性，而强度则是所有荧光团贡献的总和。在生物学背景下，亮度会随着共同波动的荧光团数量增加而增加，从而提供有关荧光标记蛋白寡聚状态的信息。在特定像素处的波动幅度通过荧光信号的方差 σ2 来测量：
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq3.jpg" alt="统计方差公式，σ² = ⟨I²⟩ - ⟨I⟩²，数学方程。" data-altupdatedat="1788282455000">
其中，强度平方的平均值 <img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq4.jpg" alt="静态平衡公式 ⟨I²⟩；数学符号；用于教育和科研，简洁描述。" data-altupdatedat="1788282455000"> 与强度平均值的平方 <img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq5.jpg" alt="静态平衡方程 ΣFx=0；工程概念图示；力平衡分析。" data-altupdatedat="1788282455000">，均由每帧图像中各像素的单独强度值计算得出：
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq6.jpg" alt="数学方程、静力平衡、用于统计分析的公式 ΣI/K。" data-altupdatedat="1788282455000">
其中，K 为时间序列中的总帧数。实验上，需要计算整个图像序列的方差，该方差描述了单幅图像中每个像素处的个体强度值围绕平均强度值的离散程度。该方差包含了来自不同来源的所有波动。在一级近似下，照明体积内扩散粒子引起的方差 σ20 可与探测器散粒噪声引起的方差 σ2d 相分离。这两个方差相互独立，因此总方差由二者之和给出：
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq7.jpg" alt="方差公式 σ²=σ₀²+σₐ²，用于统计分析；数学公式。" data-altupdatedat="1788282455000">
由于分子进出检测体积的波动所导致的方差，与分子亮度和强度呈线性关系：
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq8.jpg" alt="应力分布方程，σ²=ε(I)，材料应力分析的关键公式。" data-altupdatedat="1788282455000">
根据公式 1 重新整理公式 6：
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq9.jpg" alt="静态平衡方程 σ₀²=ε²n，教育研究公式。" data-altupdatedat="1788282455000">
根据荧光相关光谱学中的典型概念，公式7指出，由粒子数波动引起的方差取决于粒子亮度的平方。
然后，在假设探测器工作在其饱和极限以下的条件下，由探测器波动引起的方差是检测到的强度的线性函数19：
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq10.jpg" alt="静态平衡方程 σ²_d = a(I) + c；数学公式分析。" data-altupdatedat="1788282455000">
对于光子计数探测器，a=1 且 c=0，因此探测器的方差等于平均强度：
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq11.jpg" alt="静态平衡方程 σd²=⟨I⟩，教育研究中的公式表示。" data-altupdatedat="1788282455000">
为了将这些概念应用于活细胞中的实际测量，Gratton 及其同事18将每个像素的表观亮度 B 定义为方差与平均强度的比值：
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq12a.jpg" alt="静态平衡方程，Σ(σ²/l) = (σ₀²/l) + (σd²/l)，数学公式，研究背景。" data-altupdatedat="1788282455000">
B 是通过实验测定的参数。在本研究中，利用全内反射荧光显微镜（TIRF）获取 HeLa 细胞质膜上 FGFR1 受体的时间序列图像，并通过 N&amp;B 分析确定其平均表观亮度 B。随后，在加入 FGF2 后，连续采集时间序列图像，以追踪受体与其经典配体结合后，膜表面受体分子自组装状态的变化。
然而，由于TIRF显微镜的探测器是EMCCD相机，表观亮度的表达式需要修正为19：
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq13a.jpg" alt="科学分析背景下的静态平衡方程，σ项，Δσ²/⟨I⟩-偏移量" data-altupdatedat="1788282455000">
其中，offset 是检测电子元件的强度偏移量，为探测器设置的一个特征参数。模拟探测器的方差和平均强度分别由以下公式给出：
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq14a.jpg" alt="静力学平衡方程，ΣFx=0，受力平衡示意图，研究，教育分析。" data-altupdatedat="1788282455000">
其中，G 为以数字灰度级（DL/光子）表示的模拟增益，S 表示每光子对应的数字灰度级19，其值由恒定强度光源（无时间波动）的光强-方差曲线的斜率确定。γ 因子与像素检测体积的形状有关。根据 Hassler 等人32 的研究，当全内反射荧光（TIRF）成像在检测相机最大增益下工作时，γ 因子等于 0.319。偏移量、S 和 G 参数均为相机和显微镜的固有特性。表观亮度 B 可通过将公式 11 重新整理为公式 12 和 13 得到：
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq15.jpg" alt="静力平衡方程，B/S=G/S*γε+1，数学公式示意图。" data-altupdatedat="1788282455000">
从实验角度来看，ε 是激光强度和系统检测效率的复杂函数。然而，由于 B/S 与 ε 呈线性关系，因此只需确定给定检测模式下 ε 的相对值即可：
<img src="/files/ftp_upload/60398/60398eq16.jpg" alt="公式15，B/S = B' = ε' + 1；静态平衡分析的数学表达式。" data-altupdatedat="1788282455000">
其中 ε' 与 ε 成正比。然而，仍需使用内参进行校准。

<table><tbody><tr><td>配备 smi-自动 TIRF 校准功能的 3 色快速 TIRF Leica AM TIRF MC 倒置显微镜。该显微镜配有 488 nm 激光二极管、100 倍 1.46 数值孔径油浸 TIRF 物镜、490/20 和 525/50 的激发/发射带通滤光片、温控/CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱，以及 Andor DU 8285 VP EMCCD 相机。显微镜由 Leica LIF 软件控制。</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白，纯度 ≥98%</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA</td><td>A7906-100G</td><td></td></tr><tr><td>不含酚红、含 25 mM HEPES 的 DMEM 培养基</td><td>GIBCO Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>21063029</td><td>用于显微镜观察的无血清培养基</td></tr><tr><td>高糖 DMEM GlutaMAX I 培养基</td><td>GIBCO Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>10566-016</td><td>用于配制完全培养基</td></tr><tr><td>Dulbecco 磷酸盐缓冲液 10 倍浓缩液 (PBS)</td><td>Biowest, Nuaill&amp;eacute;, France</td><td>X0515-500</td><td></td></tr><tr><td>Photometrics DV2 发射光分光系统</td><td>TeledynePhotometrics, Tucson, AZ, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清，经鉴定合格，来源巴西</td><td>GIBCO Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>10270106</td><td>完全培养基中添加 10%，经灭活处理</td></tr><tr><td>35 mm 玻璃底无菌培养皿（1.5 级玻璃）</td><td>MatTek, Ashland, MA, USA</td><td>P35G-0.170-14-C</td><td>未包被，玻璃厚度为 0.17 微米</td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>人宫颈癌 (HeLa) 细胞，无血清动物成分 (AC) 培养细胞</td><td>Millipore-Sigma ECACC, Darmstadt, Germany</td><td>CB_08011102</td><td></td></tr><tr><td>iXonEM+ 897 EMCCD（背照式）ANDOR 相机，由 ANDOR Solis 软件控制</td><td>Oxford Instruments, Andor TM Technology, Abingdon-on-Thames, UK</td><td></td><td>该相机安装在显微镜的额外端口上，用于采集 N&amp;B 时间序列数据</td></tr><tr><td>Matlab 可执行 N&amp;B 程序</td><td>西班牙马德里国家心血管研究中心（CNIC）显微镜与动态成像单元</td><td></td><td>下载地址：https://www.cnic.es/en/investigacion/2/1187/tecnologia</td></tr><tr><td>MatLab v.2018b</td><td>The MathWorks, Inc. Natick, MA, USA</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;https://www.mathworks.com/products/matlab.html">https://www.mathworks.com/products/matlab.html&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>组织培养用青霉素-链霉素溶液（100 倍浓缩）</td><td>Biowhittaker Inc. Walkersville, MD, USA</td><td>LONZA 17-602E</td><td>培养基中终浓度为青霉素 100 U / 链霉素 100 &amp;micro;g</td></tr><tr><td>pN1-mEGFP-FGFR1 表达载体</td><td>意大利米兰欧洲肿瘤学研究所 IRCCS 妇科肿瘤研究组</td><td></td><td>Zamai 等，2019</td></tr><tr><td>pN1-N-Gly-mEGFP-GPI 表达载体</td><td>西班牙马德里国家心血管研究中心（CNIC）显微镜与动态成像单元</td><td></td><td>Hellriegel 等，2011</td></tr><tr><td>pN1-N-Gly-mEGFP-mEGFP-GPI 表达载体</td><td>西班牙马德里国家心血管研究中心（CNIC）显微镜与动态成像单元</td><td></td><td>Hellriegel 等，2011</td></tr><tr><td>重组 FGF2 蛋白</td><td>PeproTech EC, Ltd., London, UK</td><td></td><td>配体溶液：在含 0.01% BSA 的 PBS 中配制 20 ng/mL 的 FGF2 溶液</td></tr><tr><td>丙酮酸钠 GIBCO</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11360070</td><td>培养基中添加终浓度为 1 mM</td></tr><tr><td>TransIt-LT1 转染试剂</td><td>MirusBio LLC, Madison, WI, USA</td><td>MIR 2300</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA（0.25%），含酚红</td><td>GIBCO Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>类型 F 浸油，10 mL</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td><td>11513 859</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure BSA（50 mg/mL）</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM2618</td><td>用于转染实验的无酚红培养基中添加 0.1%</td></tr></tbody></table>

结合全内反射荧光显微镜与数目和亮度分析法研究活细胞中细胞表面受体的寡聚化动态

Oligomerization Dynamics of Cell Surface Receptors in Living Cells by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy Combined with Number and Brightness Analysis

尽管受体寡聚化具有重要性和普遍性，但可用于检测聚集事件并测量聚集程度的方法却很少。本文介绍一种成像方法，用于测定活细胞膜中mEGFP标记的受体同源复合物的平均寡聚状态。该方案基于全内反射荧光（TIRF）显微镜结合数目与亮度（N&amp;#38;B）分析。N&amp;#38;B方法类似于荧光相关光谱（FCS）和光子计数直方图（PCH），这些方法均基于对观察时间内荧光分子在照明体积内进出所引起的荧光强度波动的统计分析。具体而言，N&amp;#38;B是对PCH的简化，用于获取寡聚混合物中蛋白质平均数量的信息。强度波动幅度由荧光分子的分子亮度以及照明体积内荧光分子的平均数量决定。因此，N&amp;#38;B仅考虑振幅分布的一阶矩和二阶矩，即平均强度和方差。这既是该方法的优势，也是其局限性所在。由于仅考虑两个矩，N&amp;#38;B无法确定混合物中未知寡聚体的摩尔分数，而只能估计混合物的平均寡聚化状态。然而，该方法可应用于相对较小的时间序列（相较于其他矩方法），以像素为单位对活细胞图像进行分析，仅需监测荧光强度随时间的变化即可。该方法将每个像素的有效时间缩短至几微秒，使数据采集可在秒到毫秒的时间尺度内完成，这对于快速寡聚化动力学的研究至关重要。最后，该方法还可用于检测较大的细胞区域以及亚细胞区室。

在相同培养皿中接种的两个代表性 HeLa-mEGFP-FGFR1 细胞的实验结果如图5和补充表1所示。这两个细胞分别在加入 FGF2 配体后 0 分钟（图5A，上图）和 7 分钟（图5A，下图）时被捕捉成像。
图5 还展示了两个代表性HeLa细胞的实验结果，其中一个表达纯单体GPI-mEGFP（图5B，上图），另一个表达共价连接的二聚体荧光蛋白GPI-mEGFP-mEGFP（图5</...

我们介绍了一种成像方法，用于测定活细胞质膜中由配体结合诱导的mEGFP标记受体寡聚体的平均寡聚状态。该方案基于全内反射荧光（TIRF）显微镜结合粒子数与亮度（N&amp;B）分析。

尽管受体寡聚化具有重要性和普遍性，但可用于检测聚集事件并测量其聚集程度的方法却很少……

受体聚集普遍存在，且通常是信号级联激活所必需的。然而，目前可用于测量聚集程度的方法较少。我们采用全内反射荧光（TIRF）显微镜技术，追踪活细胞质膜中FGFR1-mEGFP分子的扩散行为。然后我们应用编号与亮度（N&B）分析来描述刺激后受体聚集的动力学过程。全内反射荧光显微镜（TIRF）非常适合对细胞表面附近发生的分子事件进行快速时间成像，而N&B分析则基于荧光分子在显微镜照明体积内扩散进出的情况，确定其平均寡聚状态。事实上，该方法可用于关联细胞表面受体在信号传导过程中的时空组织特性。N&B 方法仅需使用配备快速采集模块的显微镜即可。只要具备荧光涨落方法的基础知识，即可对大面积活细胞进行分析。该方法适用于能够形成二聚体或簇状结构，并可与荧光染料进行化学计量标记的蛋白质。如果蛋白质位于细胞内区室中，则需使用其他类型的显微镜来获取图像。构建一个表达荧光蛋白单体形式的载体非常重要，以便在实验条件下测量纯单体亮度作为对照。第一天，在玻璃底培养皿中加入1.5毫升完全培养基，以每毫升100,000至200,000个细胞的浓度接种HeLa细胞。接种六到八个重复培养皿，在37摄氏度的培养箱中孵育。在第二或第三天，细胞已达到亚汇合状态。向其中一半培养皿中加入含蛋白质粒的无血清培养基，向另一半培养皿中加入含有单体和二聚体的参照质粒，以转染细胞。一天后，检查转染的细胞是否已贴附于培养皿底部，且细胞膜是否呈现荧光。弃去细胞过度生长或荧光极弱的培养皿。实验前4小时，将显微镜的温控培养箱预热至37摄氏度。打开显微镜、计算机和相机，并等待相机温度降至正常工作温度零下75摄氏度。在物镜上滴加一滴镜油。将样品皿放入显微镜的培养箱中，关闭培养箱门，使样品皿温度平衡10分钟。打开落射荧光灯和488纳米激光器。选择落射荧光对比模式，通过目镜观察样品，寻找一个细胞进行聚焦。选择合适的滤光片，通过显微镜相机收集绿色发射光，激发光滤光片为带通490/20 500，发射光滤光片为带通525/50，或类似规格。将观察方式从目镜切换至落射荧光模式下的相机成像。优化焦距后，切换至全内反射荧光（TIRF）模式。随后根据全内反射荧光显微镜的操作说明，启动自动校准程序。选择合适的照明深度，并优化渐逝场的方向。切换至第二台相机。定义一个至少为 256 × 256 像素的感兴趣区域。将曝光时间设为1毫秒，EM增益设为1,000。将激光功率调整至0.5毫瓦。必须了解该蛋白质的扩散系数，因为曝光时间必须短于荧光分子在照明体积内停留的平均时间。在初始条件下运行第一次试验序列，并粗略估算信噪比值。当首次时间序列测量的信噪比达到二至三或更高时，该条件即为可接受。然后使用连接第二台相机与显微镜的发射分光系统滑块，遮蔽图像的一侧。选择相机文件自动保存选项。以至少为2的信噪比开始采集图像序列，持续采集不少于700帧。在不将培养皿从显微镜取出的情况下，加入配体。选择一个细胞膜荧光明亮的细胞，并迅速开始动力学实验的第一个时间序列。寻找第二个细胞，采集动力学的第二个时间点。每个动力学时间点均需采集一个新的细胞。对于每个新培养皿，重复进行激光线的对准以及TIRF照明的优化。现在，将相机软件获取的图像文件转换并保存为tif格式文件。通过启动N&B图形用户界面MATLAB，将tif文件导入分析软件程序中。对于平均强度曲线显示光漂白超过10%的序列，或在采集过程中出现明显细胞膜形变或位移的序列，应予以剔除。对明显失焦的帧进行裁剪。仅保留时间帧数不少于500帧的序列用于分析。首先确定相机参数。启动相机校准程序。在探测器噪声区域中选择一个至少为 20 × 50 像素的区域。在对数频率与数字信号强度关系图中，移动线性红色游标，以划定曲线上线性部分的高斯分布范围。按下 B 键，应用最小为 2.2 的通道合并（binning）以减少数据离散性，并生成 B-I 直方图。使用迭代方形光标检查 B-I 直方图。为分析选择一个方形 ROI，并生成所选 ROI 的 B 图。然后保存与该选择相关的 B 值的 ASCII 文件。将ASCII文件导入图形软件，计算数据的频率分布，得到平均B值及其标准误（S.E.）。应用epsilon方程，计算动力学实验中每个时间点每个细胞的平均亮度。根据归一化方程对数据进行归一化处理，其中B't表示在加入配体后时间t测得的平均B值，B'0表示在配体加入后t = 0时测得的平均B值（即配体加入后10至20秒）。绘制归一化平均亮度随采集时间的变化曲线，以构建动力学曲线。本研究展示了同一培养皿中两个表达 mEGFP-FGR1 的 HeLa 细胞在加入 20 纳克/毫升 FGF2 后时间零点和七分钟时的代表性结果。与参考构建体 GPI-mEGFP 和 GPI-mEGFP-mEGFP 二聚体相比，整个分析序列显示了时间序列的平均强度。所有 B 值的曲线图。B-I 直方图。所选 ROI 的 B 图。以及相应的 B 分布直方图。在使用 20 纳克/毫升 FGF2 刺激后，代表性动力学曲线显示了平均亮度随时间变化的情况，描述了受体在细胞表面持续数分钟的缓慢二聚化过程。当使用 50 微克/毫升 NCAM-Fc 刺激时，动力学曲线显示出受体在寡聚混合物中快速且呈周期性的转变，其亮度值亦超过二聚体水平。归一化的平均值反复达到三。必须尽量减少因分子波动和荧光漂白引起的额外变异。细胞必须良好地贴附在玻璃底培养皿上，不能过度生长，也不能堆积。如果我们关注的是在细胞内区室中扩散较快的蛋白质，可以采用更快的零时间点，并使用共聚焦或双光子显微镜进行扫描，以成像细胞内部。通过我们的方法，可以在研究二聚化等事件的动态过程时，最大限度地减少光漂白带来的不利影响。这些事件调控多种细胞反应，而利用其他技术在活细胞中很难证实这些过程。

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来源：Winkle, C. C., et al．利用联合方法定义质膜递送在轴突分支和神经元形态发生中的作用．J. Vis. Exp.

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