用于生成多细胞三维球体的 CD 实验室平台

此技术可用于使用实验室对 CD 平台从单个和多个细胞类型生成细胞球体，该平台是快速生成球体的开创性系统。该技术使用离心力将细胞沉积到指定的微井中，允许多种细胞类型连续生长，以生产不同的球体。对于CMS培养芯片的制造，首先通过计算机数控加工为培养芯片的上层和底层制造聚碳酸酯模具。

接下来混合PDMS碱基和PDMS固化剂，以10比1的比例处理5分钟，然后将混合物放入干燥器中一小时，以去除气泡。将脱气的 PDMS 混合物倒入 CMS 培养芯片模具中，将模具放入干燥器中再浇注一个小时，以清除任何气泡。在第二次脱气结束时，在80摄氏度下将混合物固化在80摄氏度的热室中两个小时，然后将芯片放入真空等离子清洁剂中，表面朝上粘合。

将培养芯片暴露在18瓦的助力等离子体中30秒，并在80摄氏度下将芯片的两层粘合在热室中30分钟，以增加粘附强度。然后在 121 摄氏度的自动下对 CMS 培养芯片进行消毒 15 分钟。为准备球体形成细胞，在36.5摄氏度的水浴中，将含有5至10倍的1毫升小瓶解冻至5个感兴趣的细胞，两分钟后再向细胞中加入1毫升DMEM，然后轻轻混合。

接下来，将细胞添加到直径为 150 毫米的 Petri 盘中，该培养皿含有 15 毫升 36.5 摄氏度的培养素，并将该培养皿放在细胞培养培养箱中 24 小时。第二天，用15毫升的新鲜DMEM替换上一代，将细胞返回孵化器。要分离细胞，在36.5摄氏度和5%的二氧化碳下用四毫升的三辛丁，在四分钟内产生培养，当细胞从盘子底部升起时，用新鲜的媒介停止反应。

要给细胞贴上标签，在将20微升无水二甲基硫化物加入小瓶以获得一毫摩尔溶液之前，将适当的细胞荧光染料加热到室温。将荧光稀释为DMEM中一微摩尔的最终工作浓度，并将染料加入感兴趣的细胞悬浮液中，轻轻混合。然后将细胞放在细胞培养箱中20分钟。

对于单培养球体形成，首先向CMS培养芯片的入口孔添加2.5毫升4%的Pluronic F-127溶液，同时以每分钟500至1000次旋转芯片。添加所有解决方案后，使用 CMS 系统以每分钟 4，000 次旋转速度旋转芯片三分钟。在旋转结束时，在36.5摄氏度的二氧化碳下孵育培养芯片过夜。

第二天早上，取出Pluronic溶液，用DMEM清洗培养芯片。在干净的工作台上干燥芯片 12 小时后，向进气口添加 2.5 毫升介质，每分钟旋转 4，000 次，旋转芯片三分钟。在旋转结束时，用100微升的已准备好的电池悬浮液替换进气口的100微升介质，而芯片以每分钟500至1000次旋转的速度旋转。

然后以每分钟3000次旋转的芯片旋转3分钟，用离心力将芯片捕获到每个微井中的细胞，然后将芯片放入细胞培养箱中三天，每天刷新所展示的介质。对于同心球形共培养的生成，将100微升介质中的第一组细胞添加到芯片的入口端口，同时芯片以每分钟500至1000次旋转的速度旋转，然后以每分钟3000次旋转的速度旋转3分钟。在旋转结束时，在芯片以每分钟500至1000次旋转的速度旋转时，添加100微升的第二个单元群，以每分钟3000次旋转的速度旋转芯片，再旋转3分钟。

当两卷细胞被注射后，将芯片以每分钟1000至2000次旋转的速度放入细胞培养箱，24小时。对于Janus球体形成，在芯片以每分钟500至1000次旋转时，加入100微升的首批细胞群，然后以每分钟3000次旋转的速度旋转3分钟。在旋转结束时，将芯片放在细胞培养箱中，以每分钟1000至2000次旋转的速度旋转3小时。

在孵育结束时，加入第二个细胞群的100微升，而芯片以每分钟500至1000次旋转的速度旋转，然后以每分钟3000次旋转的芯片旋转3分钟。然后将细胞在细胞培养培养箱中以每分钟1000至2000次旋转24小时。对于三明治球状形成，首先添加100微升的第一个细胞群，而芯片以每分钟500至1000次旋转，然后以每分钟3000次旋转的速度旋转3分钟。

在旋转结束时，将芯片放在细胞培养培养箱中的旋转器上，以每分钟1000至2000次旋转的速度放置芯片两小时，然后加入第二组细胞的100微升，而芯片以每分钟500至1000次旋转的速度旋转。以 3，000 RPM 旋转芯片三分钟，然后将芯片放回孵化器中，进行三小时的旋转孵化。然后再添加第一个细胞群的100微升，而芯片以每分钟500到1000次旋转的速度旋转，然后旋转和培养刚演示的12小时细胞。

按照所证明的协议，可以成功制造一个直径为六厘米的CMS培养芯片。CMS 培养芯片的通道包括入口端口以及中央、滑动和微井区域。如所证明，在单个 CMS 芯片内，以每分钟 2，000 次旋转速度拍摄的两种类型的细胞培养的延时图像显示了球体的成功形成。

三天培养后对微井的成像表明，球体具有优异的均匀性和球面性。也可以生成具有锥形、Janus 和三明治结构的共培养球体。此外，细胞培养物暴露在高重力下7天，然后是活/死染色，表明大多数细胞在芯片内长期培养。

CMS 培养芯片的顶部和底部在粘合时应仔细对齐，否则每个微井中的细胞数可能不相等。本研究可以降低共培养球类研究的进入门面，并可广泛应用于共培养研究，例如筛选感兴趣的新药。