小鼠脑基底前脑Meynert核内胆碱能纤维长度的体视学估算

许多神经系统疾病中的神经变性是一个慢性过程，神经纤维的丢失通常早于神经元胞体的丢失。对神经纤维进行三维立体定量分析，为检测早期神经退行性改变提供了一种敏感且准确的方法。该技术利用基于计算机的、无偏倚的空间球体分馏法，可靠且高效地测量三维空间中神经纤维等线状结构的长度。

该操作将由本实验室的立体学专家、博士后 Prabhakar Singh 和研究助理 David Peng 演示。在确认麻醉小鼠对足底反射无反应后，使用约 50 毫升冰冻的 0.1 摩尔 DPBS 进行心脏灌注，随后使用约 25 毫升含 4% PFA 的 0.1 摩尔 PBS 灌注。灌注结束后，将脑组织置于盛有新鲜 4% PFA 的容器中，在 4 摄氏度下后固定 24 小时。

第二天，用新鲜的DPBS溶液清洗脑组织，每次清洗1至2分钟，共清洗三次，然后将脑组织转移至含15%蔗糖的0.1 M DPBS溶液中，4℃过夜。次日早晨，将脑组织放入含30%蔗糖的0.1 M DPBS溶液中，4℃孵育48小时。孵育结束后，将脑组织转移至预冷至-20℃的冷冻切片机中。

脑组织可保存在密封管中，并在零下80摄氏度条件下储存。进行切片时，将组织样本包埋于最佳切割温度包埋剂中，并固定在样本盘上。随后在冷冻切片机中沿冠状面连续切取30微米厚的切片，每张切片转移至含有冷冻保护液的24孔培养板的独立孔中，以备在零下20摄氏度条件下储存。

为了确定每只脑组织的起始和终止切片，需将形态学特征与标准小鼠脑图谱进行比对。基底前脑（NBM）起始于前囟（bregma）后方 0.0 毫米处，终止于后方 1.6 毫米处。每隔第八个切片选取一次，总共可获得六至七个切片，从而为体积和纤维长度的估算提供适当的误差系数。

进行组织切片的免疫组织化学标记时，先用含0.1% Triton X-100的Tris缓冲盐水配制的10%正常牛血清封闭非特异性结合位点，然后在4°C条件下用目标一抗孵育切片48小时。孵育结束后，用新鲜Tris缓冲盐水洗涤切片，每次3分钟，共洗涤3次，随后在室温下用适当的生物素化二抗孵育1小时。孵育结束后，按前述方法用新鲜Tris缓冲盐水洗涤切片3次，再根据制造商的说明书，使用亲和素-生物素过氧化物酶复合物（Avidin biotin peroxidase complex）和DAB过氧化物酶底物溶液进行显色染色。

洗涤后，将一个脑组织样本的所有切片贴附于一张明胶包被的载玻片上，并让样本自然晾干。为使切片脱水，将样本依次浸入浓度递增的乙醇溶液中，每个浓度浸泡5分钟，重复两次，随后用二甲苯洗涤两次，每次10分钟以透明处理。然后使用适当的封片介质将盖玻片封固于载玻片上。

进行体视学分析时，在软件中新建一项研究。此时将打开研究初始化对话框。填写研究相关信息，并确认已选择基于多级分数的方法。

双击体积以打开体积对话框。命名感兴趣特征，选择区域点计数探针，然后单击下一步。双击长度并为该特征提供名称。

选择球形探针，然后点击下一步。在初始化设置框中，为在研究开始前对组别进行编码，请设置从包含目标区域的第一张切片到最后一张包含目标区域的切片之间的总切片数，并将切片采样间隔设为8。点击下一步，打开探针初始化对话框，系统将自动为区域选择和体积估算设置最低放大倍数，请确认相关设置。

单击预览以检查在选定的较低放大倍数下是否能够识别目标区域。将区域体积分数设置为每点 50,000 立方微米，然后单击预览并完成。在对象高倍放大下，将长度设置为 63X，然后双击长度以打开长度球体对话框。

将此球体的直径设置为 10 微米，然后单击完成。为帧区域、帧高度、防护区和帧间距设置适当的值。然后单击下一步，并按照软件提供的说明进行操作。

插入第一部分时，将切片置于显微镜载物台上，在5倍物镜下点击绿色箭头，在NBM周围绘制任意边界以定义感兴趣区域。点击绿色箭头并选择“完成”，切换至63倍物镜以获取当前部分的纤维测量数据。此时将弹出切片厚度对话框。

使用手动 z 轴调焦旋钮调节切片的上表面和下表面，以测量切片的实际厚度，然后单击“完成”。缓慢移动 z 轴，从切片的上表面至下表面，在虚拟球形探针表面标记所有相交的纤维。当所有纤维均被标记后，单击“下一步”进入下一个位置。

完成所有组分收集后，单击绿色箭头。软件将提示插入下一个部分。使用 5X 物镜将载玻片上下一个样本调整至清晰对焦，并重复如上所述的纤维测量步骤。

当所有切片均完成测量后，软件将生成该病例的误差系数值结果。若误差系数可接受，则继续下一个病例；若误差系数不可接受，软件将提供调整部分参数的建议。

当所有样本均完成分析后，生成每个样本及分组的结果。在此项代表性实验中，携带瑞典突变型β淀粉样前体蛋白的小鼠组相较于野生型 litter mates 显示出显著更短的纤维长度及纤维长度密度。结果还表明，在所分析的两组之间，基底前脑核（NBM）的体积无显著差异。

该技术需要以正确的方向进行适当的采集，并采用合适的染色方法及孵育时间。体视学方案可用于估算任何线性轮廓，例如其他神经纤维、星形胶质细胞突起，甚至血管轮廓。