使用波动试验测定微生物突变率

该方案可用于微生物的突变率估算。它能够展示生物体所处环境背景如何影响其自发突变的概率。该方案的主要优势在于成本低廉且效率高。

可以并行进行多次突变率的估算。本方案所检测的突变可能与抗生素耐药性相关。因此，该方案可用于研究全球最重大的挑战之一——抗菌药物耐药性。

该方法有助于揭示细胞的生态背景如何影响抗菌耐药性的进化。本方案可估算实验室菌株在单培养条件下的突变率，但我们已将其应用于临床菌株以及两种菌株的共培养，以区分生物中性分子。本方案中使用的最具危害性的试剂是抗生素利福平和甲醇。

因此，在甲醇中溶解利福平（rifampicin）时，务必佩戴防护手套和护目镜。开始该实验步骤时，用接种环从大肠杆菌 K12 甘油菌种中刮取少量冰状菌体，接种至 3 mL 液体 LB（Lysogeny Broth）培养基中。将 LB 培养物在 37 摄氏度、120 rpm 条件下振荡培养约 7 小时。

此后，用生理盐水将培养物稀释2000倍。向每支试管中加入10 mL液体Davis最低限度培养基，每支试管中含有不同浓度的葡萄糖，如图所示。将100 µL稀释后的培养物分别加入三支50 mL带筛帽的锥底聚合物试管中。

按照文本方案中的说明，用含葡萄糖的液体 Davis 最小培养基配制 5 种不同的溶液，每种 22 mL，分别置于 50 mL 离心管中。为制备各环境的接种物，首先测定过夜培养物在 600 纳米处的光密度。用生理盐水稀释培养物，并向每种环境中加入 2200 至 110000 个细胞。

这将确保每毫升环境中的接种物含有1000至5000个细胞。接下来，为196孔深孔板设计一个平行培养的随机布局。根据该布局，将一毫升接种后的培养基加入板中的每个孔中。

然后，用胶带固定板盖，并称量整个板（包括板盖和胶带）的重量。在37°C、250 rpm条件下振荡培养24小时。之后，在培养箱中放置两升蒸馏水，以稳定各实验组之间的蒸发量。

通过将每种接种培养基各取10微升涂布于非选择性TA琼脂平板上，确定接种量。使用无菌L形涂布棒涂布，直至琼脂表面干燥。随后，在六孔板中制备含利福平的选择性TA琼脂平板。

用移液器将5 mL选择性TA琼脂加入六孔板的每个孔中。计数非选择性琼脂平板上的菌落形成单位，并确定接种量大小。在培养24小时后，称量整个深孔板以确定蒸发量，蒸发量可能约为10%。每次检测将三个随机选取的培养物转移至已标记的微量离心管中。

将深孔板中剩余的81个平行培养物接种到含有利福平的选择性TA琼脂平板上。接着，取下选择性琼脂平板的盖子，在无菌条件下敞开放置，使琼脂表面的所有液体完全干燥。通过将微量离心管中的培养物进行五步10倍系列稀释，每步稀释时取100微升培养物与900微升生理盐水混合并涡旋振荡，从而测定菌落形成单位数量。

将最终稀释液各40 µL接种于非选择性TA琼脂平板上，并盖上平板盖。在37°C下过夜培养。当六孔板所有孔中培养液均已清除后，重新盖上盖子。

然后将平板盖上盖子，在37摄氏度下孵育44至48小时。第4天，在非选择性琼脂平板上计数菌落形成单位。第5天，在选择性TA琼脂平板上计数对抗生素具有抗性的菌落数量。

记录特定检测中观察到的突变体数量在平行培养物之间的分布情况。在计算机上打开相应的软件。在假设检验选项卡中，保持各项参数为默认值。

单击浏览并选择包含观察到的突变体分布的文本文件。上传文件后，单击执行测试。在右侧测试结果下方的单样本最大似然检验（One Sample ML-test）部分，查找突变数量。

这是 m，即预期的突变事件数量。然后，按照文本方案中所述，估算特定基因型在特定环境下的突变率。此处展示了 MG1655 在三种不同表型标记——环丝氨酸、利福平和萘啶酸上的突变率。

在葡萄糖浓度为 80 mg/L、125 mg/L 和 250 mg/L 的 Davis 最小培养基中评估突变率。在一种情况下，使用了 1000 mg/L 的葡萄糖浓度。如预期所示，环丝氨酸抗性的突变率最高，萘啶酸抗性的突变率最低，而利福平抗性的突变率居中。

波动试验可明确显示哪种菌株为组成型突变株，哪种菌株具有正常的突变率。由于mutT缺失菌株对萘啶酸耐药的突变率比对照MG1655菌株高出约50倍。在执行本方案时，请确保细胞生长状态良好。

在相同环境下，平行培养物应生长至均匀的密度。该实验流程的一个后续步骤是测定耐药菌落中 rpoB 基因的 DNA 序列，以确定利福平耐药突变谱如何随环境微生物基因型的变化而变化。

20世纪的波动试验揭示了突变相对于环境而言是自发且随机的。如今，这些试验正在进一步阐明突变率如何在遗传、生态甚至社会层面上随环境而变化。