Name: 使用腺相关病毒-Cas9系统在Vitro建立基因工程的毛因头和颈部癌细胞系 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 45 s
Description: 了解如何使用腺相关病毒-Cas9系统建立基因工程小鼠头颈部癌细胞系。本方案通过酶解消化B6转基因小鼠舌组织，实现原代细胞转化与基因编辑，为肿瘤发生机制研究提供可靠模型。

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我们感谢 Daniel Gitler 博士为我们提供了 pAd Delta 5 Helper 质粒。本研究由以色列科学基金会（ISF，700/16）（资助对象：ME）、美国-以色列双边科学基金会（BSF，2017323）（资助对象：ME 和 MS）、以色列癌症协会（ICA，20170024）（资助对象：ME）、以色列癌症研究基金会（ICRF，17-1693-RCDA）（资助对象：ME）以及关爱基金会（#7895）（资助对象：ME）提供资金支持。博士后奖学金：Alon 奖学金授予 ME，BGU Kreitman 奖学金授予 SJ 和 MP。

本研究经内盖夫本古里安大学动物护理与使用委员会批准。动物实验已获得国际实验动物护理评估与认证委员会（IACUC）的批准（编号：IL.80-12-2015 和 IL.29-05-2018(E)）。本研究中涉及的所有动物实验、饲养及环境条件均符合《实验动物护理与使用指南》13 的要求。
1. 腺相关病毒的制备
<ol>
	<li>第1天：细胞培养
	<ol>
		<li>在每个14.5 cm培养皿中加入15 mL DMEM培养基，接种4 × 106个HEK293T细胞。为使用聚乙烯亚胺（PEI）（1 µg/µL）进行转染，共准备10个培养皿。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第2天：使用PEI转染HEK293T细胞
	<ol>
		<li>转染前1小时，吸除培养基，并更换为预温的DMEM培养基。</li>
		<li>预先将转染试剂和DMEM培养基升温至室温。</li>
		<li>每块培养皿使用10 µg含AAV ITR的感兴趣质粒（AAV pCM109 EFS Cre sg APC sg KRAS sg P53- KRAS HDR）、10 µg AAV 2/9n衣壳质粒（包含AAV2的rep基因和AAV9的cap基因）以及10 µg辅助质粒（pAdDelta F5 helper）（参见材料表）。 
		注意：新一代辅助质粒pAdDeltaF614,15,16也可用于AAV的生产。</li>
		<li>将各质粒溶于每皿1 mL不含血清的DMEM中混合，然后向质粒混合物中加入90 µL聚乙烯亚胺（总质粒与PEI的质量比为1:3），短暂涡旋混匀。</li>
		<li>将PEI-质粒DNA混合物在室温下孵育20分钟。</li>
		<li>将混合物逐滴加入HEK293T细胞培养皿中，随后将培养皿转移至37 °C、5% CO2的细胞培养箱中孵育24小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第3天：转染后换液
	<ol>
		<li>完全吸除旧培养基，每皿加入15 mL新鲜DMEM培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第5天：病毒收获
	<ol>
		<li>准备干冰/乙醇浴。</li>
		<li>使用细胞刮收集细胞，并转移至50 mL离心管中（每管合并2个培养皿的细胞）。</li>
		<li>在室温下以800 × g离心15分钟。</li>
		<li>弃去所有管中的上清液。仅向第一管中加入裂解缓冲液（150 mM NaCl，50 mM Tris-HCl，pH = 8.5）0.5 mL/皿（即10个培养皿共5 mL）。重悬细胞后，将全部液体转移至下一管，依次操作直至最后一管。</li>
		<li>将细胞悬液转移至一个新的50 mL离心管中。使用相同体积的裂解缓冲液（每皿0.5 mL）按照步骤1.4.4所述的转移方法清洗原离心管。</li>
		<li>将细胞悬液在干冰/乙醇浴与37 °C水浴之间进行约10分钟/次的冻融循环，共进行三次。每次解冻后短暂涡旋混匀。</li>
		<li>若当天进行纯化，请将平衡缓冲液和洗脱缓冲液（配方见表1）提前置于室温。</li>
		<li>每皿加入50单位的苯并核酸酶（benzonase），37 °C孵育1.5小时。 
		注意：苯并核酸酶用于降解细胞悬液中宿主生产细胞的残留核酸及质粒DNA。</li>
		<li>在4 °C下以3,000 × g离心15分钟。</li>
		<li>使用18 G钢针头将上清液吸入注射器，并通过0.45 µm滤器过滤至15 mL离心管中，得到粗裂解液。</li>
		<li>粗裂解液可在4 °C保存数周，待后续纯化，或立即进行纯化。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. AAV 纯化
<ol>
	<li>第5天或更晚
	<ol>
		<li>将平衡缓冲液和洗脱缓冲液置于室温。</li>
		<li>用10 mL平衡缓冲液洗涤层析柱。</li>
		<li>向柱中加入每孔0.5 mL的肝素-琼脂糖17，然后加入平衡缓冲液（体积为肝素-琼脂糖的4倍）。通过倒置柱子混合溶液，静置使琼脂糖沉淀。</li>
		<li>通过重力流洗脱柱中的平衡缓冲液。 
		注意：保留少量平衡缓冲液，防止琼脂糖干燥。</li>
		<li>将粗裂解液上样至柱中，4 °C下孵育2小时并持续振荡。将柱子竖直放置，使琼脂糖沉淀。</li>
		<li>通过重力流洗脱粗裂解液。</li>
		<li>用平衡缓冲液洗涤柱子（体积为肝素-琼脂糖的4倍）。</li>
		<li>在柱子下方放置一个100 kDa的离心蛋白滤器，使用洗脱缓冲液（体积为肝素-琼脂糖的3倍）将病毒洗脱至滤器中。 
		注意：洗脱缓冲液体积不应超过15 mL。</li>
		<li>在3,000 x g下离心滤器约30分钟，直至滤器中剩余液体少于1 mL。</li>
		<li>用PBS填充滤器，在3,000 x g下离心约30分钟，直至滤器中剩余液体少于1 mL。重复此步骤2次，以彻底去除盐分。</li>
		<li>通过在3,000 x g下离心，将滤器中的病毒溶液浓缩至尽可能小的体积（小于200 µL）。</li>
		<li>用针头和注射器吸取病毒溶液，并通过0.22 µm滤器转移至离心管中。</li>
		<li>将浓缩的病毒颗粒分装保存。 
		注意：短期储存（4 °C）时分装体积约为20 µL，长期储存（-80 °C）时分装体积约为5 µL。</li>
		<li>按照先前所述方法测定病毒滴度和病毒转导效率14,18,19,20。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 原代细胞的分离与培养
<ol>
	<li>第1天
	<ol>
		<li>处死一只6周龄的雄性或雌性B6;129-Gt(ROSA)26Sor小鼠tm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/CO 通过 J2 窒息或其他经IACUC批准的方案。 
		注意：这些 CRISPR/Cas9 基因敲入小鼠具有 Cre 重组酶依赖性的表达 Cas9 由CAG启动子驱动的内切核酸酶和EGFP。这些小鼠基因组中存在上游的Lox-Stop-Lox（LSL）序列，在无Cre重组酶的情况下可阻止Cas9和EGFP的表达。当与单导向RNA（sgRNAs）及Cre来源联合使用时，可在体内或体外实现对单个或多个小鼠基因的编辑14.</li>
		<li>使用手术剪从安乐死的小鼠中解剖出舌头。</li>
		<li>使用手术刀将舌组织切成非常小的碎片，手动解离组织。将组织碎片收集到含有4.5 mL RPMI基础培养基（无血清）的15 mL离心管中。</li>
		<li>加入三酶混合液（200 µl）（参见 表1 将配方中的成分加入组织碎片中。</li>
		<li>将组织-酶混合物在37 °C孵育30分钟，每隔10分钟轻弹试管，以促进组织的酶解离。</li>
		<li>加入含5%胎牛血清（FBS）的HBSS/PBS至组织-酶混合物中，以终止酶反应。</li>
		<li>通过无菌的70 µm尼龙滤网过滤上述细胞悬液，以分离分散的细胞与较大的组织碎片。</li>
		<li>通过300 x g离心洗涤过滤后的细胞悬液 g 在 HBSS/PBS 中于室温下孵育 5 分钟。</li>
		<li>将沉淀重悬于培养基（含10% FBS的RPMI/DMEM）中，于60 mm培养皿中培养，直至形成明显的细胞克隆。
		<ol>
			<li>将细胞团块接种于含3 mL完全培养基（含10% FBS的RPMI/DMEM）的60 mm培养皿中的滤膜上方进行培养，直至形成细胞集落。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>培养1周后，在显微镜下检查原代细胞是否存在成纤维细胞污染。将由细胞团块和细胞悬液获得的原代细胞用0.25%胰蛋白酶-0.02% EDTA溶液在37 °C处理1分钟，以去除成纤维细胞。 
		注意：通常情况下，细胞聚集体的原代培养所产生的克隆数量多于单细胞悬液。这些克隆来源的细胞在腺相关病毒（AAV）转导中具有更高的转导效率。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 原代细胞的 AAV 转导
<ol>
	<li>第10天
	<ol>
		<li>在6孔板中，每孔接种2 × 105个原代细胞，加入2 mL完全培养基（含10% FBS的RPMI/DMEM）。</li>
		<li>次日，用1012病毒基因组/mL（1010转导单位/mL）的病毒进行细胞转导，并将细胞在含病毒颗粒的培养基中于37 °C孵育48小时。</li>
		<li>移除含病毒颗粒的培养基，用完全培养基更换并继续培养AAV转导的细胞。 
		注意：只有完成转导的细胞才会表达GFP并开始增殖；未成功转导的细胞将在两周内逐渐死亡。</li>
		<li>经过两周的培养扩增后，将细胞接种用于验证实验及体内致瘤性实验。 
		注意：采用标准方案提取AAV转导细胞及来自Cas9小鼠的正常原代细胞的基因组DNA，以验证特定基因组编辑效果。使用基于杂交捕获的下一代测序方法（例如MSK-IMPACT平台）对提取的DNA进行测序和数据分析（表2），具体操作如先前文献所述21。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 使用免疫荧光和蛋白质印迹法验证正常细胞向致瘤性细胞的转化
<ol>
	<li>免疫荧光
	<ol>
		<li>将 2 × 105 个细胞接种于 12 mm 玻璃盖玻片上，放入培养箱中过夜。</li>
		<li>用含 4% 多聚甲醛的 PBS（pH = 7.4）固定细胞，并进行免疫荧光标记处理。</li>
		<li>在湿盒中，用含 1% BSA 或 1% 血清的 PBST 将固定后的细胞与第一抗体在室温孵育 1 小时，或在 4 °C 孵育过夜。所用一抗包括兔单克隆抗 KRT14 抗体、兔单克隆抗 E-钙黏蛋白抗体以及 Cas9 小鼠单克隆抗体。</li>
		<li>用 1× PBS 洗涤细胞 3 次，每次 5 分钟，以去除盖玻片上的第一抗体溶液。</li>
		<li>在避光条件下，用含 5% BSA 的 PBST 中的 Cy3 标记驴抗兔 IgG 和/或 Cy3 标记山羊抗小鼠 IgG 二抗在室温孵育细胞 1 小时。</li>
		<li>去除二抗溶液，按照步骤 5.1.4 所述方法洗涤细胞 3 次。</li>
		<li>用含 DAPI 的封片剂（DAPI Fluoromount）滴加于盖玻片上进行封片。</li>
		<li>避光保存于 4 °C，直至使用荧光显微镜成像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>蛋白质印迹（Western blotting）
	<ol>
		<li>将 1 × 106 个转化细胞接种于 100 mm 培养皿中，放入培养箱中过夜。</li>
		<li>洗涤并刮取转化细胞，重悬于 200 µl 冰冷的 PBS 中。</li>
		<li>将含有细胞悬液的离心管在 4 °C 条件下以 2,000 × g 离心 10 分钟，使细胞沉淀。</li>
		<li>吸除上清液，加入含磷酸酶抑制剂混合物和蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液（见表 1），在 4 °C 裂解 10 分钟。将裂解液在 4 °C 条件下以 10,000 × g 离心 10 分钟，收集澄清的裂解液。</li>
		<li>使用市售的 Bradford 蛋白定量试剂盒，按照制造商说明书测定蛋白浓度。使用 4× 上样缓冲液（500 mM Tris pH = 6.8，40% 甘油，8% SDS，20% H2O，0.02% 溴酚蓝）将蛋白样品调整至 0.5 或 1 µg/µL。在 96 °C 煮沸 5 分钟。 
		注意：样品可保存于 -80 °C，或待进行 Western 印迹分析时使用。</li>
		<li>取等量总裂解液（30 µg）进行 10% 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），确保染料迁移至凝胶底部。通过半干转印法在 25 V 条件下转印 30 分钟，将蛋白转移至尼龙膜上。</li>
		<li>将 5% BSA 溶于 TBS-0.1% Tween（TBST）中，覆盖膜表面，室温封闭 1 小时。随后在 4 °C 过夜孵育一抗（抗 Cre、抗 Cas9、抗 GFP、抗 β-catenin、抗 p53、抗磷酸化 ERK 和抗 β-actin，均用 5% BSA TBST 稀释）。</li>
		<li>孵育结束后，用 1× TBST 洗涤膜 10 分钟，确保溶液完全覆盖膜表面，重复洗涤 3 次，然后加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗（用 5% BSA TBST 1:10,000 稀释），室温孵育 1 小时。</li>
		<li>孵育结束后，用 1× TBST 洗涤膜 10 分钟，确保溶液完全覆盖膜表面，重复洗涤后进行化学发光成像（见材料表），并相应采集图像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在免疫健全小鼠中验证转化细胞的致瘤潜能 
	注意：小鼠的饲养与处理均遵循内盖夫本-古里安大学的机构指南。体内实验使用 NOD.CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd（NOD.SCID）和 C57BL/6 小鼠。小鼠饲养于带空气过滤装置的层流柜中，光照/黑暗循环为 12 小时，自由摄食饮水。
	<ol>
		<li>选用 6–8 周龄的雌性 NOD.CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd（NOD.SCID）和 C57BL/6 小鼠进行实验。</li>
		<li>用胰蛋白酶消化 AAV-Cas9 转化的细胞，加入预热至 37 °C 的 DMEM 终止消化，并收集至 50 mL 离心管中。</li>
		<li>在室温下以 800 × g 离心 10 分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于不含 FBS 的 DMEM 培养基中。再次离心后，将细胞沉淀重悬于 1× PBS 中。 
		注意：避免细胞在 1× PBS 中停留过久。始终将细胞悬液置于冰上，以防止细胞聚集。</li>
		<li>使用自动细胞计数仪计数细胞，并用 1× PBS 将细胞稀释至所需浓度（2.5 × 107 个细胞/mL）。通过皮下注射将 AAV-Cas9 转化的细胞悬液（每只 NOD.CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd（NOD.SCID）小鼠注射 2 × 106 个细胞）注入小鼠右侧 flank 区。为建立同系小鼠的原位模型，将 0.5 × 106 个原代细胞或 AAV-Cas9 转化的细胞注射至 C57BL/6 免疫健全小鼠的舌部。</li>
		<li>注射后 2 周，采用 CO2 窒息法处死动物，解剖处死小鼠的肿瘤组织，用于免疫组织化学分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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M.S. 担任生物科学研究所的顾问委员会成员，Menarini Ricerche 已从 Puma Biotechnology、Daiichi-Sankio、Targimmune、Immunomedics 和 Menarini Ricerche 获得研究经费。M.S. 还是 Medendi Medical Travel 的联合创始人，在过去两年中，曾从 Menarini Ricerche 和 ADC Pharma 获得酬金。其他所有作者均无任何利益冲突需要披露。

此前已有多种方法用于转化培养中的原代细胞，但成功率各不相同25,26,27,28。这些方法大多使用小鼠成纤维细胞进行转化14,17,18,19，或使用4-硝基喹啉-1-氧化物（4-NQO）等致癌剂21,22来建立小鼠细胞系模型。基因敲除和转基因小鼠模型的应用也极大地加深了我们对调控头颈部癌（HNC）发生与分化的各种分子通路的理解。具有独特遗传模式的小鼠口腔上皮细胞系的使用无疑将补充这些研究，其后续的生化检测将有助于...

头颈部癌（HNC）是全球范围内常见的恶性肿瘤1。目前，HNC肿瘤发生的建模研究正处于一个科学上的转折点2。尽管已在HNC中鉴定出多种基因突变2,3,4（例如 TP53、PIK3CA、NOTCH1、FAT1 和 RAS），但诱导HNC发生所必需的基因组改变的具体组合仍不明确。
目前人源HNC细胞系的应用已显著帮助阐明了与发病机制及治疗相关的各种机制3。然而，在免疫缺陷型小鼠模型中研究人源细胞系存在局限性，因为这些模型无法反映体内肿瘤发生过程、特定基因突变的作用，以及在免疫微环境中的治疗反应。因此，建立具有特定遗传改变的小鼠细胞系对于研究不同基因在转化过程中的作用，以及在免疫健全小鼠中测试基于新分子的治疗方法具有重要意义。
生物医学研究中的基因功能研究已因DNA编辑技术的进步而受到显著影响，例如通过引入双链断裂（DSBs）5。这些技术包括锌指核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶以及成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR/Cas9）系统，能够在其基因座上对任何目的基因进行操控。最新的CRISPR/Cas9系统由一条引导RNA（gRNA）组成，该RNA可引导Cas9核酸酶在基因组的特定位点产生双链断裂。该系统已在任何细胞或靶组织中修饰内源性基因方面获得广泛认可，甚至在传统上最难处理的生物体中也取得了成功5。由于其简便性、快速性和高效性，该系统相较于其他技术具有多种优势。
在肿瘤学领域，CRISPR/Cas9 技术已成功实现了对癌细胞的有效模拟。为了在头颈部癌（HNC）中建立该系统，我们对强效的 KRAS 癌基因以及两个重要的抑癌基因 APC 和 p536进行了操作。根据 GENIE 数据库7，这种基因组合在头颈部癌中较为罕见。RAS 基因突变（HRAS、NRAS 和 KRAS）仅存在于约 7% 的头颈部癌患者中。这类肿瘤通常对治疗具有耐药性8,9。
通过使用AAV或慢病毒进行病毒转导，可实现Cas9及其gRNA的递送。由于重组AAV具有高滴度、较弱的免疫反应、能够转导多种细胞类型以及整体安全性较高等优点，常被作为将基因递送至靶细胞的首选方法。利用AAV系统，研究人员已成功构建了多种组织特异性的小鼠细胞系，并且新的细胞系仍在不断开发中10,11,12。然而，目前仍缺乏一种高效的基因组编辑系统，用于生成小鼠头颈部癌（HNC）细胞系模型。在本研究中，我们旨在建立一种基于体外AAV-Cas9的系统，将原代小鼠舌细胞转化为具有致瘤性的状态。该独特的CRISPR/Cas9转化方案以及所建立的肿瘤细胞系，可用于更深入地理解由多种基因组改变所诱导的HNC生物学特性。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;抗体&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 HRP</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-035-146</td><td></td></tr><tr><td>抗兔 HRP</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-035-152</td><td></td></tr><tr><td>Cas9 小鼠单克隆抗体</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>14697</td><td></td></tr><tr><td>Cre</td><td>BioLegend</td><td>900901</td><td></td></tr><tr><td>Cy3-AffiniPure 山羊抗小鼠 IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-165-062</td><td></td></tr><tr><td>Cy-AffiniPure 山羊抗兔 IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-165-144</td><td></td></tr><tr><td>GFP</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-9996</td><td></td></tr><tr><td>磷酸化-p44/42 MAPK (Erk1/2)</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>4370</td><td></td></tr><tr><td>兔单克隆抗E钙黏蛋白</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>3195S</td><td></td></tr><tr><td>兔单克隆抗KRT 14</td><td>Abcam</td><td>AB-ab181595</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta; 肌动蛋白</td><td>MP Biomedicals</td><td>691001</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta; 连环蛋白</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9582S</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;细胞系&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK93T</td><td>ATCC</td><td>&lt;a href=&quot;https://www.atcc.org/en/Products/All/CRL-3216.aspx&quot; target=&quot;_blank">CRL-3216&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;培养基、化学试剂与试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bradford 试剂</td><td>Bio-Rad</td><td>30015484</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Amresco</td><td>0332-TAM-50G</td><td></td></tr><tr><td>DAPI 氟封片剂</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-20</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd.</td><td>01-055-1A</td><td></td></tr><tr><td>ECL（Westar Supernova 和 Westar Nova 2.0）</td><td>Cyanagen</td><td>XLS3.0100 和 XLS071.0250</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd.</td><td>04-127-1A</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Sigma</td><td>H6648</td><td></td></tr><tr><td>肝素-琼脂糖</td><td>Sigma</td><td>H6508</td><td></td></tr><tr><td>Isolate II 基因组DNA试剂盒</td><td>Bioline</td><td>BIO-52066</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Panreac AppliChem</td><td>300283</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Bio Lab Ltd</td><td>1903059100</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd.</td><td>02-023-1A</td><td></td></tr><tr><td>PEI</td><td>Polysciences</td><td>23966-1</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液</td><td>Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd.</td><td>03-031-1B</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>30525-89-4</td><td></td></tr><tr><td>磷酸酶抑制剂混合液</td><td>Biotool</td><td>B15001A/B</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合液</td><td>MilliporeSigma</td><td>P2714-1BTL</td><td></td></tr><tr><td>Tris 缓冲液</td><td>MERCK Millipore</td><td>648311-1KG</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;酶&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>苯甲酸酶</td><td>Sigma</td><td>E1014</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶IV</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17104019</td><td></td></tr><tr><td>DNA酶</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18047019</td><td></td></tr><tr><td>透明质酸酶</td><td>MilliporeSigma</td><td>H3506</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd.</td><td>03-050-1B</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;玻璃器皿&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>Bar Naor</td><td>BNCB00130RA1</td><td></td></tr><tr><td>载玻片</td><td>Bar Naor</td><td>BN9308C</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;小鼠品系&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6</td><td>Envigo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>B6;129-Gt(ROSA)26Sor&lt;sup&gt;tm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh&lt;/sup&gt;/J</td><td>Jackson labs</td><td>24857</td><td></td></tr><tr><td>NOD.CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd（Nod.Scid）</td><td>Envigo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;质粒&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AAV pCM109 EFS Cre sg APC sg Kras sg P53- Kras HDR</td><td>麻省理工学院布罗德研究所</td><td></td><td>由美国马萨诸塞州剑桥市麻省理工学院和哈佛大学布罗德研究所 Randall J Platt 博士和 Joseph Rosenbluh 博士惠赠</td></tr><tr><td>AAV 2/9 衣壳载体</td><td>Addgene</td><td>112865</td><td></td></tr><tr><td>pAD Delta F5 辅助质粒</td><td>内盖夫本-古里安大学</td><td></td><td>由以色列贝尔谢巴内盖夫本-古里安大学健康科学学院生理与细胞生物学系及兹洛托夫斯基神经科学中心 Daniel Gitler 博士提供</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;塑料器皿&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amicon-ULTRA 100 KDa 滤膜</td><td>Millipore</td><td>UFC910024</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &amp;micro;m 无菌滤器，4 mm</td><td>Millex</td><td>SLGV004SL</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &amp;micro;m 无菌滤器，13 mm</td><td>Millex</td><td>SLHV013SL</td><td></td></tr><tr><td>培养板</td><td>Greiner Bio-One</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Falcon 管</td><td>Greiner Bio-One</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

利用腺相关病毒-cas9系统体外建立基因工程小鼠头颈部癌细胞系

In Vitro Establishment of a Genetically Engineered Murine Head and Neck Cancer Cell Line using an Adeno-Associated Virus-Cas9 System

利用原代正常上皮细胞，结合基于成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）的基因组编辑技术，在小鼠中引入癌基因和抑癌基因的特定突变，可重复地诱导细胞转化所需的基因组改变。该技术使我们能够利用小鼠精确模拟人类癌症中发生的遗传变异。通过对小鼠原代细胞进行遗传转化，可更深入地研究癌症的发生、发展、治疗及诊断。在本研究中，我们使用可由Cre诱导表达Cas9的小鼠舌上皮细胞，实现在体外利用腺相关病毒（AAV）进行基因组编辑。具体而言，通过对正常舌上皮细胞中的KRAS、p53和APC基因进行修饰，我们在体外建立了一株具有致瘤性的鼠源头颈部癌（HNC）细胞系，该细胞系可在同源小鼠中形成肿瘤。本文详细描述了如何构建具有特定基因组改变的HNC细胞系，并阐述了其在预测同源小鼠中肿瘤进展方面的适用性。我们预期，这一具有前景的方法将有助于头颈部癌的肿瘤生物学研究与治疗探索。

利用 AAV 系统转化正常的 Cas9 细胞 
图 1 提供了本研究中所用 AAV 转基因质粒的详细载体图谱。图 2 概述了基于 AAV-Cas9 系统的设计与工作原理。为产生病毒颗粒，采用 PEI 转染法将 HEK293T 细胞与 AAV 转基因载体及其他病毒包装载体共同转染。转染后，收集含病毒的细胞并进行裂解，通过肝素-琼脂糖纯化流程对病毒颗粒进行纯化与浓缩（图 2A）。这些纯化的病毒颗粒用于体外转化从 Cas9 小鼠中分离的原代细胞，以检测其有效性。在本系统中，AAV 转基因表达盒通过同源重组插入到小鼠细胞内的 Cre 依赖性 Cas9 Rosa26 靶向模板中，该模板包含普遍性 CAG 启动子（pCAG）、LoxP-Stop-LoxP 结构（LSL）、Cas9 核酸酶基因、自剪切 P2A 肽段以及由两个同源臂包围的...

为了理解头颈部肿瘤的发生机制，需要建立具有头颈部癌症患者特定基因突变的小鼠模型。本文介绍了一种利用腺相关病毒-Cas9系统在体外转化小鼠原代舌细胞的实验方案，以构建具有特定基因组改变的小鼠头颈部癌细胞系。

利用腺相关病毒-Cas9系统体外建立基因工程小鼠头颈部癌细胞系

使用原代正常上皮细胞可重复地诱导细胞转化所需的基因组改变，通过……

本方案实现了具有特定基因组操作的头颈部癌症模型的建立，显著推动了我们对特定基因突变在肿瘤发生过程中作用的理解。该技术的主要优势在于，几乎可以从任何器官轻松建立细胞系。本实验操作将由我实验室的研究生 Manu Prasad 进行演示。首先使用手术剪从一只六周龄的雄性或雌性 B6 转基因小鼠中取出舌头。用手术刀将组织切碎成非常小的片段，并将碎片收集到含有 4.5 毫升无血清 RPMI 基础培养基的 15 毫升离心管中。向管中加入 200 微升三酶混合液，在 37 摄氏度孵育 30 分钟，每隔 10 分钟轻弹管壁一次，以促进组织的酶解离。 孵育结束后，加入含5% FBS的PBS终止反应，并通过70微米细胞筛过滤细胞悬液，以分离细胞与较大的组织碎片。离心收集细胞，将沉淀重悬于3毫升完全培养基中。随后，每16毫米培养皿中加入3毫升完全培养基进行细胞接种。将滤膜上保留的细胞团块转移至另一个16毫米的培养皿中，并加入3毫升完全培养基。将两个培养皿均置于培养箱中，直至形成明显的细胞克隆。培养一周后，通过显微镜检查原代细胞培养物中是否存在成纤维细胞污染，用含0.2%EDTA的25%胰蛋白酶在37摄氏度处理细胞1分钟，去除任何成纤维细胞。在培养的第10天，使用含0.2% EDTA的25%胰蛋白酶，在37°C条件下作用3至5分钟，从细胞悬液或细胞聚集体培养物中消化收获细胞，并将2 × 10⁵个原代细胞加入含2毫升培养基的6孔板每孔中。次日，用每毫升含1 × 10¹²病毒基因组的病毒颗粒转导细胞，并在37°C条件下继续在含病毒颗粒的培养基中孵育48小时。孵育结束后，将每孔培养上清更换为2毫升新鲜完全培养基，并将细胞放回细胞培养箱中继续培养。经过两周的培养扩增后，将细胞接种用于验证及体内成瘤实验。使用AAV CAS9载体，每毫升病毒含1×10¹²个病毒基因组，按照本实验方案操作，可有效将原代甲基化细胞转化为具有成瘤能力的MAPs。经转导的细胞表达Cre、CAS9和绿色荧光蛋白。将五次10的5次方个经AAV转导的原代MAPs细胞注射到NOD SCID小鼠的舌、唇和皮肤中，会导致这些动物形成肿瘤，而注射未经转导的原代MAPs细胞则不会诱导肿瘤形成。可通过免疫荧光和蛋白质印迹法确认原代舌上皮细胞的致瘤性转化。对转化细胞中分离的DNA进行深度测序的基因组分析，可证实AAV CAS9系统对肿瘤蛋白53（TP53）和APC基因实现了有效的基因编辑和移码突变。此外，转化后的舌细胞在野生型C57黑六小鼠体内能高效形成肿瘤。对肿瘤细胞进行免疫组织化学分析，结果显示上皮细胞标志物E-Cadherin和Keratin 14均在细胞质中表达。在进行该实验操作时，务必注意过度剪切或酶消化时间过长会导致细胞活力下降，从而降低病毒感染效率。通过该实验流程，可对细胞系进行遗传学改造，从而深入了解来自任何目标组织的癌细胞的致瘤性和转移潜能。

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癌症研究

使用腺相关病毒-Cas9系统在Vitro建立基因工程的毛因头和颈部癌细胞系

本文全面概述了构建口腔癌小鼠模型的技术，以及通过多光子显微镜对标记细胞进行舌内肿瘤侵袭的定量监测方法。该系统可作为评估抗侵袭性化合物分子机制及药物疗效的有用平台。...

多光子成像技术在口腔鳞状细胞癌原位小鼠模型中对肿瘤细胞侵袭的观察

来源：Prasad, M. et al. 利用腺相关病毒-Cas9系统体外建立基因工程小鼠头颈部癌细胞系。J. Vis. Exp.

利用病毒-Cas9系统在体外建立小鼠肿瘤细胞系

在本视频中，我们介绍了从小鼠舌头中分离上皮细胞的方法。这些细胞可进一步培养以形成细胞克隆。...

小鼠舌上皮细胞的分离与培养：一种从小鼠模型中分离和培养舌上皮细胞的操作方法

本方案描述了一种新建立的将病毒递送至小鼠前列腺的方法。该技术可通过CRISPR/Cas9技术、基因过表达或Cre重组酶递送，实现基因表达的原位调控，并建立一种新型的小鼠前列腺癌模型。...

病毒递送CRISPR向导RNA至小鼠前列腺以实现基因改造

在此，我们介绍一种利用腺病毒报告系统对活细胞中TGF-β/Smad3信号活性进行活体成像的实验方案。该系统可实时追踪转录活性，适用于单个细胞以及细胞群体的研究。 体外 在活体动物中模型...

活细胞成像观察TGF-β/Smad3信号通路 体外 和 在体 内 使用腺病毒报告系统

本文描述了利用CRISPR/Cas9系统对小鼠造血干细胞和祖细胞（HSPC）进行高效基因组编辑的实验方案，以快速构建具有造血系统特异性基因修饰的小鼠模型系统。...

慢病毒CRISPR/Cas9介导的基因组编辑用于疾病模型中造血细胞的研究

本文介绍一种快速、直接的体内CRISPR/Cas9筛选方法，该方法通过超声引导下的子宫内胚胎慢病毒注射，同时评估多个基因在免疫功能健全小鼠皮肤和口腔中的功能。...

利用体内CRISPR/Cas9筛选技术同时评估小鼠皮肤和口腔中的基因功能

此处，我们介绍一种针对胚胎致死基因敲除的实验方案 体内 在基因工程小鼠模型来源的肿瘤中进行基因敲除，随后评估该敲除对肿瘤生长、增殖、存活、迁移、侵袭以及转录组的影响 体外 和 体内.

通过肿瘤发生中定义基因功能 离体 恶性周围神经鞘瘤细胞中 floxed 等位基因的敲除

本方案描述了携带目的基因缺失的小鼠尿路上皮类器官的生成与表征过程。方法包括小鼠尿路上皮细胞的获取、 离体 使用带有CMV启动子驱动Cre表达的腺病毒进行转导，以及 体外 以及 体内...

Ex Vivo 腺病毒-Cre 介导的小鼠尿路上皮细胞基因删除的类器官模型

为了更深入地研究造血干细胞生物学及血液系统恶性肿瘤，有必要建立能够真实模拟造血干细胞和祖细胞（HSPCs）中体细胞突变的新型策略。本文介绍了一种结合使用CRISPR/Cas9与双rAAV供体转导技术，在HSPCs中模拟杂合功能获得性突变的实验方案。...

在人类造血干细胞和祖细胞中构建致癌性杂合功能获得突变

了解如何使用腺相关病毒-Cas9系统建立基因工程小鼠头颈部癌细胞系。本方案通过酶解消化B6转基因小鼠舌组织，实现原代细胞转化与基因编辑，为肿瘤发生机制研究提供可靠模型。

利用腺相关病毒-Cas9系统体外建立基因工程小鼠头颈部癌细胞系

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