Name: 牵引显微镜与微流体集成，用于化学集体迁移 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: 了解牵引显微镜与微流体集成技术，用于量化细胞集体迁移过程中的力学变化。该方法可研究生化梯度引导下的细胞运动机制，为伤口愈合和癌症转移研究提供新工具。

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本研究由韩国国家研究基金会（NRF）资助，该基金会由韩国政府（MSIP）提供资金支持（项目编号：NRF-2017R1E1A1A01075103）、韩国大学资助项目以及BK 21 Plus项目支持。同时获得美国国立卫生研究院（U01CA202123、PO1HL120839、T32HL007118、R01EY019696）资助。

注意：SU-8掩模版（厚度 = 250 μm）和微通道部件（厚度 = 150 μm）的光刻、玻璃刻蚀（深度 = 100 μm）以及浇铸制备均通过将使用计算机辅助设计软件绘制的设计图发送给制造商进行外包加工。
1. 聚二甲基硅氧烷（PDMS）模板与微通道的制备
<ol>
	<li>设计掩膜版和微通道的微图案。</li>
	<li>在硅晶圆（直径 4"）上制备或外包 SU-8 模具（掩膜版厚度约为 250 μm，微通道厚度约为 150 μm）。</li>
	<li>按 10:1 的比例将基础弹性体与固化剂混合，制备 PDMS 混合物。
	<ol>
		<li>将 15 mL 基础弹性体加入 50 mL 锥形管中，再加入 1.5 mL 固化剂。共制备两份。</li>
		<li>将 PDMS 混合物涡旋振荡 5 分钟。在 196 x g 条件下离心 1 分钟以去除气泡。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备 PDMS 掩膜版时，将约 1 mL PDMS 混合物倒在晶圆上，避开 SU-8 图案区域，使 PDMS 接触 SU-8 柱的侧面，但不覆盖 SU-8 图案的顶部。
	<ol>
		<li>将晶圆置于平坦表面，在室温（RT）下静置超过 30 分钟。随后在 80 °C 干燥烘箱中固化 PDMS 超过 2 小时。</li>
		<li>小心地将 PDMS 从 SU-8 模具上剥离，并使用 14 mm 空心打孔器修剪出薄 PDMS 膜。用粘性胶带清除 PDMS 片表面的灰尘，并对 PDMS 掩膜版进行高压灭菌处理。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备 PDMS 微通道时，将约 30 mL PDMS 混合物倾倒覆盖在 SU-8 模具上。
	<ol>
		<li>在真空腔中脱气 30 分钟，并在 80 °C 干燥烘箱中固化 PDMS 超过 2 小时。</li>
		<li>小心地将 PDMS 从 SU-8 模具上剥离，并将 PDMS 切割成 24 mm × 24 mm 的尺寸。在每块 PDMS 上使用 1 mm 活检打孔器制作一个出口和三个入口。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 准备带有聚丙烯酰胺（PA）凝胶的底部玻璃
<ol>
	<li>通过切割和蚀刻玻璃，制造或外包矩形载玻片（24 mm × 24 mm × 1 mm），其上带有矩形微孔（6 mm × 12 mm，深度100 μm29）。</li>
	<li>对底面玻璃表面进行硅烷化处理30。
	<ol>
		<li>通过将200 mL去离子水（DIW）、80 μL乙酸和50 µL 3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基甲基丙烯酸酯（TMSPMA）混合并搅拌1小时，制备结合用硅烷溶液。 
		警告：TMSPMA为易燃液体。请遵循材料安全数据表中的建议。仅可在化学通风橱中使用。</li>
		<li>使用粘性胶带去除玻璃表面的灰尘，并对玻璃进行高压灭菌处理。</li>
		<li>在底面玻璃的蚀刻表面上覆盖100 μL结合硅烷溶液，并在室温下静置1小时。</li>
		<li>用去离子水冲洗玻璃3次，并在室温空气中自然干燥或用气流吹干。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备用于PA凝胶的凝胶溶液31。
	<ol>
		<li>通过将5 mg过硫酸铵（APS）溶解于1 mL去离子水中，配制新鲜的0.5 %（w/v）过硫酸铵（APS）溶液。</li>
		<li>配制PA凝胶溶液：包含138 µL 40%丙烯酰胺溶液、101 µL 2%双丙烯酰胺溶液、5 µL荧光微粒溶液（0.2 μm）以及655 µL去离子水。 
		警告：丙烯酰胺和双丙烯酰胺溶液具有毒性。请佩戴防护手套、防护服和护目设备。避免含荧光微粒的PA凝胶溶液暴露于光照下。 
		注意：在移液前需涡旋震荡荧光微球溶液，以确保每批溶液中荧光微球数量均匀。</li>
		<li>加入100 μL APS溶液和1 μL四甲基乙二胺（TEMED）后，将10 µL混合凝胶溶液转移至矩形微孔中，并在其上方放置一个圆形盖玻片（18 mm）。 
		注意：为使定制玻璃中的PA凝胶无气泡填充，请在底面玻璃的凹槽中加入足量凝胶溶液，小心地将盖玻片滑过凝胶表面，并去除多余的凝胶。 
		警告：凝胶约需40分钟缓慢固化。后续的凝胶离心操作应尽快进行。</li>
		<li>将定制玻璃、凝胶溶液与盖玻片的组装体翻转，然后在96 x g条件下离心10分钟，使荧光微粒迁移至PA凝胶的顶层。</li>
		<li>从离心机中取出组装体，并将其放置于平整表面上，使盖玻片朝下。 
		注意：从步骤2.3.6开始，应在生物安全柜中操作样品。</li>
		<li>30分钟后，将组装体翻转并放入35 mm培养皿中，加入2 mL去离子水，并用镊子轻轻将盖玻片向一侧滑动移除。 
		注意：固化后的PA凝胶可在去离子水中保存1个月。然而，一旦在PA凝胶上包被胶原蛋白，则应在1天内用于实验。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在PA凝胶上包被胶原蛋白。
	<ol>
		<li>将1 mg/mL的磺基琥珀酰亚胺基-6-(4'-叠氮-2'-硝基苯氨基)己酸酯（sulfo-SANPAH）溶于温热的50 mM HEPES缓冲液中。取200 µL该溶液滴加至凝胶表面，并用紫外光（波长365 nm）照射激活10分钟。 
		注意：sulfo-SANPAH需避光保存。</li>
		<li>用0.1 M [4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸；HEPES]缓冲液冲洗凝胶2次，再用PBS冲洗1次。</li>
		<li>在4 °C条件下，用胶原蛋白溶液（100 μg/mL PBS溶液，大鼠尾部I型胶原蛋白）包被PA凝胶过夜。次日用PBS洗涤3次。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 细胞岛的微图形化
<ol>
	<li>配制F-127（材料表）溶液［2% (w/v) 溶于PBS中］，并将经高压灭菌的PDMS模板浸入F-127溶液中。置于37 °C培养箱中孵育1小时。</li>
	<li>在细胞培养基中制备细胞悬液（2 × 106 个细胞/mL），培养基成分为：含10%胎牛血清（FBS）和1%抗生素-抗真菌素（AA）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）。</li>
	<li>用PBS清洗PDMS模板3次，并吸除PDMS模板和PA凝胶表面的液体。将PDMS模板放置于PA凝胶上，并向模板中加入PBS。</li>
	<li>通过轻柔移液去除PDMS模板孔洞中的气泡。去除气泡后，吸除PDMS模板表面的PBS。</li>
	<li>在PDMS模板上加入200 µL细胞悬液后，将PA凝胶置于培养箱中孵育1小时，使细胞贴附于PA凝胶表面。</li>
	<li>用细胞培养基轻柔冲洗去除未贴附的细胞悬液，移除PDMS模板，再加入新鲜细胞培养基。在显微镜下观察细胞岛的形成情况。</li>
</ol>
4. 带有PDMS微通道的PA凝胶组装
<ol>
	<li>使用粘性胶带去除PDMS微通道上的灰尘，然后进行高压灭菌。</li>
	<li>用氧气等离子体（80 W，50 kHz）处理PDMS微通道表面30秒。</li>
	<li>除去装有PA凝胶的底部玻璃片上的任何液体后，将PDMS微通道置于底部玻璃片上，并将组件放置在定制的玻璃支架上。</li>
	<li>用细胞培养基填充微通道。 
	注意：务必用移液器轻轻冲洗温热的培养基，以去除通道中被困住的所有气泡。同时，在去除气泡时，确保不要使微图案化的细胞岛脱落。</li>
</ol>
5. 集成化微流控系统
<ol>
	<li>连接管路。
	<ol>
		<li>通过剪切针头（18 G）的尖端并将其弯曲90°来制备连接器。</li>
		<li>准备三条进样管路和一条出样管路。
		<ol>
			<li>对于进样管路，将剪切后的针头与一段30 cm的微量管路通过三通旋塞连接。共准备三条。</li>
			<li>对于出样管路，将剪切后的针头与一段75 cm的微量管路通过三通旋塞连接。准备一条。</li>
			<li>用已预热1小时的培养基填充管路。 
			注意：务必使用注射器缓慢冲洗温热的培养基，以彻底清除管路中滞留的所有气泡。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>通过移除注射器的活塞并将进样管路连接至注射器，制备储液器。</li>
		<li>将各管路的针头连接器插入微流控装置的三个进样口和一个出样口中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向每个储液器中加入3 mL新鲜培养基或条件培养基。
	<ol>
		<li>进行梯度测试时，在左侧进样口储液器中加入含20 ng/mL HGF的细胞培养基。</li>
		<li>为可视化浓度梯度，向左侧进样口储液器中加入200 µg/mL的荧光染料（罗丹明B-葡聚糖，70 kDa）。</li>
		<li>将出样管路连接至注射泵。 
		注：注射泵的工作模式为&#34;抽吸&#34;。流速需根据注射器的容量和注射泵的运行速度进行调整。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将集成的微流控系统放置在常规落射荧光显微镜的载物台上。 
	注意：为在微流控通道中形成平缓的HGF梯度，流速应尽可能缓慢，控制在0.1 µL/min。该流速极为敏感，需稳定运行2小时，并在实验过程中避免任何物理扰动。</li>
</ol>
6. 图像采集
<ol>
	<li>使用放置在培养箱内的自动显微镜，每10分钟拍摄一次图像，持续最长24小时。在每个时间点，使用4倍物镜在三个不同通道中拍摄一组图像，包括用于观察细胞迁移的相差图像、用于观察嵌入PA凝胶中荧光微球的绿色荧光图像，以及用于观察化学物质浓度梯度的红色荧光图像。&#160;</li>
	<li>拍摄完延时图像后，向微通道中注入0.25%的胰蛋白酶-EDTA溶液，使细胞从PA凝胶上脱离。待细胞完全从凝胶上移除后，拍摄一张绿色荧光图像，作为牵引力显微镜分析的参考图像。</li>
</ol>
7. 数据分析
注意：数据分析使用 MATLAB 编写了自定义代码，相关细节已在其他文献中描述32,33,34,35,36。
<ol>
	<li>对于相位图像分析，使用粒子图像测速法36计算两幅连续相位图像中的位移。</li>
	<li>对于傅里叶变换牵引力显微镜分析，将每幅绿色荧光图像与参考图像进行比较，并使用粒子图像测速法36计算每幅图像中的位移；根据这些位移，利用傅里叶变换牵引力显微镜33,34,37重建细胞在PA凝胶上产生的牵引力。</li>
	<li>根据牵引力数据，基于有限元方法，使用单层应力显微镜32,34,38计算细胞岛单层内的应力。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性财务利益。

组成细胞的集体迁移是在发育和再生过程中一个重要的过程，迁移方向通常由生长因子的化学梯度引导4,23。在集体迁移过程中，细胞持续与邻近细胞及底层基质相互作用。这类机械相互作用会引发诸如硬度趋向性（durotaxis）42、压力趋向性（plithotaxis）33和空隙趋向性（kenotaxis）43等涌现现象。然而，此前的研究通常仅使用单一浓度的生长因子（如胎牛血清中的成分）进行。为填补这一空白，本实验方案描述了一种新的实验平台，可用于测量细胞在化学梯度条件下进行集体迁移时的机械相互作用。
该新平台结合了三种广泛应用的实验系统：微图形化技术、牵引力显微镜技术和微流控技术。首先，对细胞岛进行微图形化处理，以实现集体迁移。其次，采用牵引力显微镜和单层细胞应力显微镜对迁移中的细胞进行力学测量。最后，利用微流控平台在迁移细胞上建立化学...

生物系统中的细胞迁移是一种基本现象，参与组织形成、免疫反应和伤口愈合1,2,3。细胞迁移在某些疾病（如癌症）中也具有重要作用4。细胞通常以群体形式而非单个细胞进行迁移，这被称为集体细胞迁移4,5。为了实现集体移动，细胞对微环境的感知至关重要6。例如，细胞感知理化刺激，并通过改变运动性、细胞-基质相互作用以及细胞-细胞相互作用作出响应，从而沿化学梯度实现定向迁移7,8,9,10。基于这一关联，能够构建精确可控化学微环境（如趋化因子梯度）的芯片实验室技术已取得快速进展11,12,13。尽管基于芯片实验室的微流控技术此前已被用于研究细胞群体或细胞球体的趋化性14,15,16,17,，但其主要应用仍集中于单细胞迁移研究18,19,20,21。目前，细胞群体对化学梯度响应的潜在机制仍不甚清楚14,22,23,24,25,26。因此，开发一种能够实现可溶性因子时空控制并同时原位观察细胞生物物理行为的平台，将有助于揭示集体细胞迁移背后的机制。
本文开发并描述了一种多通道微流控系统，该系统能够生成可溶性因子的浓度梯度，从而调控图案化细胞簇的迁移行为。在本研究中，选用肝细胞生长因子（HGF）来调节Madin-Darby犬肾（MDCK）细胞的迁移行为。已知HGF可减弱细胞间连接的完整性，并增强细胞的运动能力27,28。该微流控系统还集成了傅里叶变换牵引力显微镜和单层应力显微镜，可用于分析细胞在HGF浓度梯度刺激下所产生的运动性、收缩力以及细胞间张力。在同一细胞岛内，位于HGF高浓度区域附近的细胞比低浓度侧的细胞迁移更快，且表现出更低的细胞间应力水平。结果表明，这一新型实验系统适用于进一步研究各类可溶性因子化学梯度下集体细胞迁移的相关科学问题。

<table><tbody><tr><td>0.25% 胰蛋白酶-EDTA (1X)</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES 缓冲液</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>1 mm 活检打孔器</td><td>Integra Miltex</td><td>33-31AA-P/25</td><td></td></tr><tr><td>100 mm 培养皿</td><td>SPL</td><td>10100</td><td>直径 100 mm，高度 15 mm</td></tr><tr><td>14 mm 空心打孔器</td><td>ILJIN</td><td>124-0571</td><td></td></tr><tr><td>18 mm &amp;Oslash; 盖玻片</td><td>Marienfeld-Superior</td><td>111580</td><td>圆形 18 mm，厚度 1 号 (0.13 至 0.16 mm)</td></tr><tr><td>2% 双丙烯酰胺溶液</td><td>Bio-Rad</td><td>1610142</td><td>佩戴防护手套、防护服和护目用具。</td></tr><tr><td>3-(三甲氧基硅基)丙基甲基丙烯酸酯 (TMSPMA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440159-500ML</td><td></td></tr><tr><td>三通旋塞阀</td><td>Hyupsung</td><td>HS-T-61N</td><td>注意：若已开封则不得使用。请勿重复灭菌或重复使用</td></tr><tr><td>30 cm 最小容积管路（用于儿科）</td><td>Hyupsung</td><td>HS-MV-30</td><td>注意：若已开封则不得使用。请勿重复灭菌或重复使用</td></tr><tr><td>35 mm 细胞培养皿</td><td>Corning</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>40% 丙烯酰胺溶液</td><td>Bio-Rad</td><td>1610140</td><td>佩戴防护手套、防护服和护目用具。</td></tr><tr><td>75 cm 最小容积管路（用于儿科）</td><td>Hyupsung</td><td>HS-MV-75</td><td>注意：若已开封则不得使用。请勿重复灭菌或重复使用</td></tr><tr><td>乙酸</td><td>J.T. Baker</td><td>JT9508-03</td><td></td></tr><tr><td>过硫酸铵 (APS)</td><td>Bio-Rad</td><td>1610700</td><td></td></tr><tr><td>抗生素-抗真菌剂</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>底部玻璃芯片</td><td>MicroFIT</td><td></td><td>24 x 24 x 1 mm，定制，矩形凹槽 (6 x 12 mm，深度：100 &amp;mu;m)</td></tr><tr><td>Ⅰ型胶原蛋白，大鼠尾部来源</td><td>Corning</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>定制玻璃支架</td><td>Han-Gug Mechatronics</td><td>custom-made</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基 (DMEM)</td><td>Welgene</td><td>LM 001-11</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科磷酸盐缓冲液 (PBS)</td><td>Biowest</td><td>L0615-500</td><td>不含镁、钙</td></tr><tr><td>胎牛血清 (FBS)</td><td>Gibco</td><td>26140-179</td><td></td></tr><tr><td>FluoSpheres 胺基修饰微球</td><td>Invitrogen</td><td>F8764</td><td>0.2 &amp;micro;m，黄绿色荧光 (505/515)</td></tr><tr><td>肝细胞生长因子 (HGF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1404-5UG</td><td>重组人源</td></tr><tr><td>JuLI stage 活细胞成像系统</td><td>NanoEnTek In</td><td></td><td>自动 X-Y-Z 载物台及荧光成像，可兼容培养箱（37 &amp;deg;C 和 5% CO2）</td></tr><tr><td>Madin-Darby 犬肾 (MDCK) 细胞</td><td></td><td></td><td>Ⅱ型</td></tr><tr><td>氧气等离子体系统</td><td>Femto Science</td><td>CUTE-MPR</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443-250G</td><td></td></tr><tr><td>罗丹明B异硫氰酸酯&amp;ndash;葡聚糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R9379-100MG</td><td>70 kDa，用于估算微流控通道中 HGF 的时空分布</td></tr><tr><td>无菌皮下注射针头 18 G</td><td>KOVAX</td><td></td><td>剪去针尖并弯折 90 度，用于连接进出液口与容积管路</td></tr><tr><td>粘性胶带</td><td>3M/Scotch</td><td>810D</td><td>33 m x 19 mm</td></tr><tr><td>SU-8 母模</td><td>MicroFIT</td><td></td><td>直径 4&amp;rdquo;，定制</td></tr><tr><td>磺基琥珀酰亚胺基 6-(4&amp;rsquo;-叠氮-2&amp;rsquo;-硝基苯胺基)己酸酯 (Sulfo-SANPAH)</td><td>Thermo Scientific</td><td>22589</td><td>于 -20&amp;deg;C 保存。需避光防潮保存。</td></tr><tr><td>Sylgard 184 弹性体试剂盒</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>PDMS</td></tr><tr><td>注射泵</td><td>Chemyx Inc.</td><td>model fusion 720</td><td>用于吸取液体</td></tr><tr><td>注射器</td><td>KOVAX</td><td></td><td>1、3、5、10 或 50 cc，用于进样储液池或出样注射泵</td></tr><tr><td>四甲基乙二胺 (TEMED)</td><td>Bio-Rad</td><td>1610800</td><td>佩戴防护手套、防护服和护目用具。</td></tr><tr><td>紫外 (UV) 灯</td><td>UVP LLC</td><td>95-0248-02</td><td>波长 365 nm</td></tr></tbody></table>

牵引力显微镜与微流控技术结合用于趋化性集体迁移

Traction Microscopy Integrated with Microfluidics for Chemotactic Collective Migration

细胞会因化学刺激（包括刺激物的浓度梯度）而改变其迁移模式。细胞沿化学梯度方向的迁移行为被称为趋化性，在发育过程、免疫应答、伤口愈合以及癌症转移中发挥着重要作用。尽管趋化性在体内可调控单个细胞以及细胞群体的迁移，但体外研究主要集中在单细胞趋化性，部分原因是缺乏合适的实验工具。为填补这一空白，本文介绍了一种独特的实验系统，该系统结合微流控技术和微图形化技术，用于展示化学梯度对细胞集体迁移的影响。此外，该系统还整合了牵引力显微镜和单层应力显微镜，以表征细胞在基底上的作用力以及相邻细胞之间作用力的变化。作为概念验证，检测了微图形化圆形岛状Madin-Darby犬肾（MDCK）细胞在肝细胞生长因子（HGF，一种已知的散射因子）浓度梯度下的迁移行为。结果发现，在细胞岛内，靠近HGF高浓度一侧的细胞比另一侧的细胞迁移更快。在同一细胞岛内，两侧的细胞牵引力相似，但高浓度HGF一侧的细胞间应力显著更低。这种新型实验系统为研究细胞群体趋化性迁移的力学机制提供了新的机会。

为了研究化学梯度下的集体迁移，将微流控系统与牵引力显微镜技术相结合（图1）。构建该集成系统时，将聚丙烯酰胺（PA）凝胶浇铸在定制切割的玻璃上，并利用PDMS模板在微图案化区域中接种MDCK细胞。本实验中构建了十二个MDCK细胞岛（四行三列，直径约700 μm）。待细胞贴附于PA凝胶后，移除PDMS模板以启动集体迁移。将预先制备的微流控通道置于PA凝胶上方，从而在细胞岛区域上方形成微流控通道（图1A）。
为了在微流控通道内建立浓度梯度，将左侧入口连接至含有荧光染料溶液的供液储液池。同时，将中间和右侧入口连接至仅含有培养基的供液储液池。随后，将出口连接至注射泵，以从微流控通道中移除液体。将定制切割的玻璃夹层与微流控通道安装到自行搭建的显微镜载物台上。样品与自动荧光显微镜一同置于培养箱中进行活细胞成像。整个实验过程中，细胞保持在5% CO2 和37 °C的环境中。在0.125 - 2 µL/min的流速下，荧光染料...

在发育、伤口愈合和癌症转移过程中，集体细胞迁移通常由生长因子或信号分子的浓度梯度所引导。本文介绍了一种将牵引力显微镜与微流控系统相结合的实验体系，并演示了如何在生化梯度条件下定量分析集体迁移的力学机制。

细胞会因化学刺激（包括刺激物的浓度梯度）而改变其迁移模式。细胞朝化学刺激物浓度梯度方向的迁移行为……

集体细胞迁移通常由信号分子的浓度梯度引导。在本视频中，我们演示如何量化由生化梯度引导的集体迁移过程中的细胞受力。我们将微流控芯片与牵引力显微镜技术相结合，利用微流控芯片生成生化梯度，并通过牵引力显微镜测量细胞施加的力。我实验室的博士后姜焕锡（Dr. Hwanseok Jang）将演示该操作步骤。按十比一的比例混合基础弹性体与固化剂，配制PDMS溶液。取15毫升基础弹性体置于50毫升锥形管中，加入1.5毫升固化剂。准备两个这样的离心管。将PDMS混合物涡旋振荡五分钟，然后在196 ×g条件下离心一分钟以去除气泡。为了制备PDMS模板，将约一毫升PDMS混合物倒入晶圆上，注意避开SU-8图案区域，使PDMS接触SU-8柱的侧面，但不覆盖SU-8图案的顶部。将晶圆置于平坦表面，在室温下静置超过30分钟，然后在80摄氏度的干燥烘箱中固化PDMS超过两小时。小心地将PDMS从SU-8模具上剥离，使用14毫米空心打孔器修剪薄PDMS膜。在对PDMS模板进行高压灭菌前，用粘性胶带去除PDMS片表面的灰尘。制备PDMS微通道时，将约30毫升PDMS混合物倒入SU-8模具中。在真空腔内脱气30分钟，然后在80摄氏度的干燥烘箱中固化PDMS超过两小时。小心地将PDMS从SU-8模具上剥离，并将PDMS切割成24毫米×24毫米的尺寸。使用1毫米活检打孔器在每个PDMS块上制作一个出口和三个入口。按照文本方案所述方法制备并硅烷化玻璃片。在底部玻璃片的边缘表面覆盖100微升结合硅烷溶液。将玻片在室温下放置一小时后，用去离子水冲洗玻片三次。然后在室温空气中自然晾干，或用压缩空气吹干。按照文本方案中的描述配制聚丙烯酰胺凝胶溶液。然后将10 µL混合凝胶溶液转移至矩形微孔中，并在其上方放置一个圆形盖玻片。用胶带将定制玻璃片、凝胶溶液和盖玻片的组装体固定在六孔板的盖子上，并将其翻转。随后在96 ×g 条件下离心10分钟，使荧光微粒迁移至聚丙烯酰胺凝胶的顶层。从离心机中取出组装件，将其放置在平坦表面上，盖玻片朝下。30分钟后，翻转组装件并放入35毫米的培养皿中。向培养皿中加入2毫升去离子水。用镊子轻轻将盖玻片向一侧滑动，小心移除。为在聚丙烯酰胺凝胶上交联胶原蛋白，将每毫升含1毫克的 sulfo-SANPAH 溶解于温热的50毫摩尔 HEPES 缓冲液中。取200微升该溶液滴加至凝胶表面，并用紫外光照射10分钟进行活化。紫外光活化后，用 0.1 摩尔 HEPES 缓冲液冲洗凝胶两次，再用 PBS 冲洗一次。将聚丙烯酰胺凝胶在 4 摄氏度下用胶原溶液孵育过夜。次日，用 PBS 洗涤凝胶三次。将灭菌后的PDMS模板浸入F-127溶液中，置于37摄氏度培养箱中孵育一小时。用PBS清洗PDMS模板三次，并将PDMS模板和聚丙烯酰胺凝胶上的液体去除。然后将PDMS模板放置在聚丙烯酰胺凝胶上，并向模板中加入PBS。通过轻柔移液去除PDMS模板孔洞中的气泡。去除气泡后，清除PDMS模板表面的PBS。现在将200微升细胞溶液加入PDMS模板上，并将凝胶置于培养箱中孵育1小时，使细胞贴附于聚丙烯酰胺凝胶表面。孵育结束后，用细胞培养基轻轻洗去细胞溶液，再加入新鲜的细胞培养基。移除PDMS模板，在显微镜下观察细胞岛的形成情况。接下来，将PDMS微通道表面用氧气等离子体处理30秒。去除填充了聚丙烯酰胺凝胶的底部玻璃片上的任何液体后，将PDMS微通道置于底部玻璃片上方，并将组装件放置在定制的玻璃支架上。用细胞培养基填充微通道。为准备集成微流控系统的进样管路，将一根截短的针头与一段30厘米长的微型管路通过一个三通旋塞连接。准备三套此类装置。对于出样管路，将一根截短的针头与一段75厘米长的微型管路通过一个三通旋塞连接。将已预热一小时的培养基注入管路中。通过从注射器上取下活塞并连接进液管路来准备储液器。将每根管路的针头连接器插入微流控装置的三个入口和一个出口中。向每个储液池中加入三毫升新鲜培养基或条件培养基。进行梯度测试时，在左侧入口储液池中加入含20纳克/毫升肝细胞生长因子（HGF）的细胞培养基。为可视化浓度梯度，向左侧入口储液池中添加200微克/毫升的荧光染料。将出口管路连接至注射泵。将集成的微流控系统放置在常规落射荧光显微镜的载物台上。使用置于培养箱内的自动化显微镜，每10分钟拍摄一次图像，持续最长24小时。在每个时间点，使用 4X 物镜在三个不同通道中拍摄一组图像，包括用于观察细胞迁移的相差图像、用于观察凝胶中嵌入的荧光微球的绿色荧光图像，以及用于观察化学物质浓度梯度的红色荧光图像。拍摄完延时图像后，向微通道中注入 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 溶液，使细胞从聚丙烯酰胺凝胶上脱离。待细胞完全从凝胶上移除后，拍摄一张绿色荧光图像，作为牵引力显微镜分析的参考图像。按照文中的实验方案进行数据分析。为了测量收缩力和细胞间应力，将牵引力显微镜技术与单层细胞应力显微镜技术结合微流控通道使用。应力图谱以极坐标形式绘制，其中向外的牵引力用暖色调表示，向内的牵引力用冷色调表示。在零时刻，所有微岛均表现出相似的牵引力分布，边缘区域具有较强的向内牵引力，岛内区域则呈现波动状态。在施加HGF梯度10小时后，尽管各列微岛的扩张程度有所不同，但牵引力分布与零时刻基本相似。平均牵引力在10小时内未发生显著变化。然而，在计算单层细胞应力时，各组显示出不同的趋势。在HGF浓度较低的情况下，细胞岛内的平均张力在10小时内维持在约200帕斯卡。而在HGF浓度较高的情况下，细胞岛内的平均张力在10小时内从230帕斯卡逐渐下降至100帕斯卡，与先前结果一致。当微岛左侧的HGF浓度较高而右侧较低时，平均张力维持在约150帕斯卡。填充微流控通道时必须轻柔操作。在去除通道中被困气泡的同时，避免扰动微亲本细胞岛至关重要。通过使用该集成系统，可以研究细胞集体如何在机械上响应各种化学梯度，例如趋化因子或生长因子。该平台将有助于我们进一步探索化学梯度下集体细胞迁移的力学机制，这对于理解组织再生、癌症转移和发育过程至关重要。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

牵引显微镜与微流体集成，用于化学集体迁移

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海洋微生物对微尺度营养层的趋化响应

使用微流控技术研究细菌趋化性——访谈

本方案描述了一种用于在化学效应物的稳定浓度梯度中研究细菌趋化性的微流控装置的开发。...

一种用于在稳定浓度梯度下定量细菌趋化性的微流控装置

介绍了一种用于研究癌症干细胞迁移的分区化微流控装置。该新型平台可构建可存活的细胞微环境，并实现对活细胞运动的显微可视化观察。通过分离出高迁移活性的癌细胞，可用于研究其侵袭性浸润的分子机制，有望为未来开发更有效的治疗策略提供依据。...

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来源：Scheidweiler, D., et al. 结合微流控装置与显微镜和流式细胞术研究多孔介质中跨空间尺度的微生物迁移。 J. Vis. Exp.

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细胞迁移是人类发育和生命活动的重要组成部分。为了理解可能改变细胞迁移的机制，我们介绍一种平面梯度扩散系统，用于在三维胶原基质中研究趋化性，该系统能够克服现有检测方法中传统扩散室的局限性。...

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