测量细菌和化学物质对肠道通透性的影响 秀丽隐杆线虫

该方法将有助于开展与肠道微生物群和肠道健康之间相互作用相关的基础生物学研究。此外，本方案可用于筛选潜在的益生菌和营养保健品，以治疗肠漏综合征和炎症性肠病等肠道健康问题。本方案采用高通量成像系统，能够对经不同细菌和化学物质处理的秀丽隐杆线虫（C.elegans）的肠道通透性进行快速而精确的定量分析。

建议不熟悉该技术的研究人员限制样本数量，以避免标签错误及其他失误。本实验流程包含多个需要视觉演示的步骤，例如将线虫转移至96孔板，以及使用Operetta仪器和Harmony软件。首先配制500毫升无菌LB培养基。

将铜绿假单胞菌（P.aeruginosa）的单个菌落接种至培养基中，在37摄氏度、150 rpm振荡条件下培养14至15小时。次日，将菌液均匀分装至两个500毫升离心管中，在4摄氏度、3,220 ×g条件下离心30分钟。弃去上清液，每管保留25毫升，总体积共50毫升，然后重悬菌体沉淀。

将细菌培养物在 4 摄氏度下保存，直至准备使用。为检测细菌对秀丽隐杆线虫肠道通透性的影响，从冰箱中取出培养物，充分涡旋混匀。向每块新的 NGM 平板中加入总共 800 µL，然后在 20 摄氏度的培养箱中静置过夜，使平板干燥。

制备DIM平板时，将50毫升NGM琼脂培养基加入含有NGM肉汤的DIM瓶中，充分混匀。然后将20毫升培养基倒入每个90 mm × 15 mm的培养皿中。制备DMSO平板时，向每个培养皿中加入20毫升含NGM培养基的DMSO，并在室温下静置至少3小时，使其凝固。

将800微升涡旋混匀的大肠杆菌（E.coli）或铜绿假单胞菌（P.aeruginosa）培养物涂布于每块新鲜的NGM平板上，置于20摄氏度培养箱中过夜干燥。用S缓冲液洗涤同步化年龄的L4期幼虫，将约500条线虫转移至含有不同细菌和化学物质的NGM平板上。随后，将平板在20摄氏度下培养48小时。

通过将两毫升热灭活的大肠杆菌（E.coli）与四毫克异硫氰酸荧光素标记的葡聚糖（FITC-dextran）混合，制备添加FITC-葡聚糖的培养皿。将100微升该混合物加入20个新的NGM琼脂平板中，置于洁净的实验台上干燥一小时。处理48小时后，用S缓冲液清洗线虫，将其转移至添加FITC-葡聚糖的平板以及不含FITC-葡聚糖的NGM平板中，并在其中过夜孵育。

第二天，用 S 缓冲液清洗线虫，并将其转移至新鲜的 NGM 琼脂平板上爬行 1 小时。向黑色 96 孔平底板的每个孔中加入 50 µL 的 4% 多聚甲醛，然后将约 50 条线虫转移至每个孔中。1 至 2 分钟后，吸除所有多聚甲醛，再向每个孔中加入 100 µL 封片介质。

甲醛是一种有毒化学物质，应小心操作。为获取荧光图像，请在成像软件中按下“打开盖子”图标，然后将培养板插入仪器中。点击“设置”，选择培养板类型，并添加明场和EGFP通道。

调整布局时，请进入布局选择并选择“Track”。将第一张图片设置为一微米，平面数设置为10，距离设置为一微米。在“运行实验”部分中选择一个处理孔和一个捕获视野，然后按“测试”。

如果图像满意，返回至“设置”部分，然后按下“重置”图标。接着，选择所有目标孔以及适当数量的捕获视野。进入“运行实验”，输入板名称，然后按下“开始”。

为了测量荧光强度，请进入图像分析部分，导入图像，并通过选择EGFP通道和方法B来找到细胞。根据论文中的说明调整参数，并选择“平均值”作为输出结果。点击应用图标以保存设置。进入评估部分，获取热图和数据表，并调整读出参数，然后开始评估。

与另外两种细菌菌株相比，秀丽隐杆线虫（C.elegans）在与铜绿假单胞菌（P.aeruginosa）共孵育后，FITC-葡聚糖荧光显著增强，表明铜绿假单胞菌对肠道上皮屏障造成了更严重的损伤，并增加了肠道通透性。活的铜绿假单胞菌与热灭活的铜绿假单胞菌对秀丽隐杆线虫肠道通透性的影响截然不同。热灭活后，荧光图像和统计数据分析均表明，铜绿假单胞菌对线虫未引发任何毒性作用。

与DIM共处理48小时后，显著降低了暴露于铜绿假单胞菌的线虫肠道内FITC-葡聚糖的荧光强度，这表明DIM可被视为一种治疗由细菌感染引起的肠道通透性功能障碍的良好天然产物。需要注意的是，在制备FITC-葡聚糖包被平板时，应尽量减少光照，因为FITC-葡聚糖对光敏感。该技术可用于通过检测肠道细菌及其活性成分（包括细菌本身及其化学组成）来确定其致病或益生作用。