Name: 第四组病毒SSHHPS使用体外和西里科方法的分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: 了解第四组病毒SSHHPS的体外与计算机分析方法。本研究利用蛋白质BLAST和蛋白酶活性检测技术，识别病毒多蛋白中的宿主同源短序列，揭示病毒如何通过靶向切割免疫相关蛋白逃逸宿主防御，为抗病毒药物开发提供新靶点。

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本工作由美国国防威胁降低局（DTRA）项目编号 CB-SEED-SEED09-2-0061 和 CBCall4-CBM-05-2-0019 资助，部分由美国国立卫生研究院国家转化科学促进中心（NCATS, NIH）的院内/院外研究计划（XH）以及美国海军研究实验室基本经费资助。

此处表达的观点仅为作者个人观点，不代表美国海军、美国陆军、美国国防部或美国政府的立场。

由外源序列引导、针对特定序列的蛋白质或核酸的降解，在生物学中仅见于少数情况。图1所示的机制是防御性机制，可保护宿主免受病毒侵害，或保护病毒免受宿主攻击。
利用生物信息学方法，我们可以鉴定出这些系统所破坏的靶标。在对 SSHHP 序列的分析中，我们发现其中许多序列存在于参与启动固有免疫应答所需的关键蛋白中。某些靶标具有明确的功能，例如 MAVS 和 TRIF（含 TIR 结构域的干扰素-β 诱导接头蛋白），而另一些则通过更为复杂的机制与免疫相关（例如组蛋白 H3、SFRP1、FOXG1）8,9。储存在 SSHHP 序列中的靶标信息，有望帮助识别对这些病毒具有抗病毒作用的信号通路。体内的抗病毒应答通常具有病毒特异性26,43。例如，特定亚群的 TRIM 蛋白对不同病毒具有抗病毒效应43,44,45，其中一些是病毒限制因子（例如 HIV 与 TRIM5α）。目前已鉴定出约 70 种 TRIM 蛋白，其特异性仍在深入研究中44,45。SSHHPS 中的信息可能有助于我们理解这些病毒逃逸固有免疫应答的机制。随着更多 SSHHPS 被分析，可能还会发现其他模式和相关性。
在我们的分析中，物种特异性差异显而易见（图2，图10）。已知这些病毒对某些物种的影响大于其他物种。有关宿主范围、宿主易感性以及宿主防御机制的信息可能存在于SSHHPS中。例如，马是马脑炎病毒最易感的物种，但其缺乏人类TRIM14中被VEEV nsP2蛋白酶短暂切割的区域。人类极少因VEEV感染而死亡，但可被感染24。人类TRIM14蛋白携带一个nsP2蛋白酶切割序列6。切割位点的存在提示人类可能具有针对这些病毒的防御机制。鸟类被认为可能是这些病毒的潜在储存宿主46。鸡TRIM14蛋白中的相应SSHHPS序列与人类及其他物种中的序列不同。此类细微差异可能使靶标宿主蛋白无法被切割或更易被切割。Aguirre等人16研究表明，在登革病毒（Dengue virus）感染后，不能被切割的突变型STRING蛋白可诱导更高水平的干扰素（IFN），且小鼠天然携带一种不会被登革病毒ns2B3蛋白酶切割的STING蛋白变体。小鼠STING蛋白也不会被ZIKV蛋白酶切割47。在我们的SSHHPS分析中，当比较人类与啮齿类动物的蛋白时，也观察到ZIKV蛋白酶切割位点序列的差异6（图10D）。在用于研究第IV组病毒的动物模型中，重现宿主蛋白的物种特异性蛋白水解切割可能具有重要意义。抑制宿主蛋白的切割也对开发第IV组病毒蛋白酶抑制剂具有启示意义。在我们之前的研究中，已证明可使用CA074甲酯抑制VEEV nsP2蛋白酶对TRIM14的切割6。该结果提示，这些蛋白酶的小分子抑制剂可能能够调节先天免疫应答，从而有效抑制病毒感染6,31。
同一物种内的遗传变异也可能导致蛋白水解切割的差异。密码子使用的细微差异可能影响核糖体的暂停48。由于某些IV组病毒蛋白酶嵌在内质网膜中，如果切割过程是共翻译发生的，则这些暂停的差异可能影响对底物的切割。我们鉴定出的部分切割位点位于预测的信号肽序列中（例如 SFRP1），而其他位点则位于内部。
SSHHPS 分析可产生与其他宿主蛋白分析方法不同的信息。SSHHPS 分析成本低廉且易于实施。利用细菌表达系统，可在无需哺乳动物细胞培养的情况下测试哺乳动物序列的短片段（约 25 个氨基酸）。我们发现，CFP-YFP 底物能够耐受所有测试的人源蛋白序列；然而，表达产量存在差异。在类似实验中，包含长达 63 个氨基酸的人源蛋白序列的底物已成功表达、纯化，并用于动力学分析和抑制剂筛选49,50,51。由于非连续性检测仅需少量底物，因此可同时探索大量靶标。该系统的一个优势在于，CFP/YFP 底物既可用于 SDS-PAGE 分析，也可用于更复杂的动力学分析（如 IC50、Ki、Km、Vmax）。在药物发现中，抑制性化合物可能在荧光检测中产生假象。因此，结合非连续性检测与连续性检测可确认底物的切割或抑制切割效应。非连续性 SDS-PAGE 检测的样品可直接从 96 孔板中取出。CFP/YFP 底物已用于化合物文库筛选52。然而，仍需进一步分析以确定底物是否适用于高通量筛选，例如计算 Z 因子53。
设计底物时的一个挑战是确定蛋白酶结合并识别的剪切键周围区域。在本示例中，我们从以剪切键为中心的12个残基序列开始。通过分析切割位点的序列比对发现，VEEV蛋白酶对剪切键N端的残基具有同源性，而ZIKV蛋白酶则对若干C端残基具有同源性。可通过底物对接的计算机模拟模型来设计定点突变实验，以探究底物的结合位点。由于底物和酶的序列均位于质粒上，因此可对其中任意一个进行突变，以验证计算机模拟模型或各个亚位点的耐受性。当无法获得结合态底物的晶体结构时，该方法具有明显优势。
SSHHPS 分析还可能提供有关病毒酶产生病毒诱导表型机制的新信息。寨卡病毒（ZIKV）的一个靶点 SFRP1 是 Wnt 信号通路的一部分，在大脑和眼睛发育以及免疫应答中均发挥作用36,37,54,55,56,57。我们发现，其他可被 ZIKV ns2B/ns3 蛋白酶切割的蛋白质序列也存在于参与大脑和眼睛发育的蛋白质中；这两种器官的异常在先天性寨卡综合征中已被观察到，并被认为是病毒诱导表型的一部分58。
宿主与病原体相互作用的可预测性可被用于多种应用：靶向特异性的溶瘤病毒疗法；降低减毒活病毒疫苗的风险；优化、预测或筛选动物模型；预测宿主范围或易感性；预测人畜共患病事件；以及预测宿主防御机制。由于所描述的方法基于序列分析，未来可能具有整合到软件中的价值。

在多种基因组中均可发现病毒与宿主之间或宿主与病毒之间发生水平基因转移的证据1,2,3,4。病毒内源化的一个实例是细菌宿主基因组中发现的CRISPR间隔序列4。最近，我们发现了宿主蛋白序列嵌入于正链单股RNA第四组病毒（(+)ssRNA Group IV viruses）非结构多聚蛋白中的证据。这些位于病毒基因组编码区内的序列可代代传递。在病毒和宿主中均能发现较短的同源宿主-病原体蛋白序列片段（SSHHPS）5,6。SSHHPS是病毒蛋白酶识别的保守切割位点基序序列，其与特定宿主蛋白具有同源性，这些序列可指导特定宿主蛋白的降解。
在我们之前发表的研究6中，我们整理了所有被病毒蛋白酶靶向的宿主蛋白，并发现这些靶点的分布并非随机（表1）。其中呈现出两个明显趋势。首先，切割宿主蛋白的病毒蛋白酶绝大多数属于IV组病毒（25个案例中有24个涉及IV组病毒蛋白酶），仅有一种属于(+)ssRNA的VI组逆转录病毒（HIV，人类免疫缺陷病毒）7。其次，被病毒蛋白酶切割的宿主蛋白靶点通常参与天然免疫反应的启动，表明这些切割作用旨在抑制宿主的免疫应答。被病毒蛋白酶靶向的宿主蛋白中，有一半是已知参与诱导干扰素（IFN）和促炎性细胞因子产生的信号级联中的组分（表1）。其余蛋白则参与宿主细胞的转录8,9,10或翻译过程11。有趣的是，Shmakov 等人4发现，许多CRISPR前间隔序列对应于参与质粒接合或复制的基因4。
第四组包括但不限于 黄病毒科，小RNA病毒科，冠状病毒科，杯状病毒科 和 披膜病毒科属于第四组的多种新发和再发传染病病原体包括寨卡病毒（ZIKV）、西尼罗病毒（WNV）、基孔肯雅病毒（CHIKV）、严重急性呼吸综合征病毒（SARS）和中东呼吸综合征病毒（MERS）。正链单股RNA（(+)ssRNA）基因组本质上相当于一段mRNA。为了产生基因组复制所需的酶，该正链单股RNA基因组必须首先进行翻译。在甲病毒属及其他第四组病毒中，复制所需的酶以单一多聚蛋白的形式产生（例如，VEEV中的nsP1234）。非结构多聚蛋白（nsP）通过nsP2蛋白酶进行蛋白水解加工（nsP1234 → nsP1、nsP2、nsP3、nsP4），从而生成具有活性的酶。12 (图1）。nsP2蛋白酶对多聚蛋白的切割对于病毒复制至关重要；通过删除nsP2蛋白酶活性位点的半胱氨酸或对其进行定点诱变，已证实了这一点。13,14值得注意的是，病毒蛋白的翻译早于基因组复制事件。例如，nsP4含有复制（+）ssRNA基因组所需的依赖RNA的RNA聚合酶。基因组复制过程中可产生双链RNA（dsRNA）中间体；这些中间体可触发宿主的天然免疫反应。因此，这些病毒可能在感染早期切割宿主的天然免疫反应相关蛋白，以抑制其功能。15,16,17.
基因沉默可在DNA、RNA和蛋白质水平上发生。图中所示的各种沉默机制的共同之处是什么？ 图1 使用短的外源DNA、RNA或蛋白质序列来引导特异性靶标的降解，从而抑制其功能。这种沉默机制类似于 &#34;搜索并删除&#34; 用三种不同语言编写的程序。短的切割位点序列类似于一个 &#34;关键词&#34;每个程序都含有一种酶，能够识别短序列（即 &#34;关键词&#34;）以及一个词在 &#34;文件&#34; 将被删除的序列。一旦找到匹配位点，酶就会切断（&#34;删除&#34;）较大的目标序列。图中所示的三种机制 图1 用于保护宿主免受病毒感染，或保护病毒免于宿主免疫系统的攻击。
病毒蛋白酶识别长度约为2-11个氨基酸的短切割位点基序序列；以核苷酸计，这相当于6-33个碱基。作为对比，CRISPR间隔序列约为26-72个核苷酸，RNAi序列约为20-22个核苷酸18,19。尽管这些序列相对较短，但仍可被特异性识别。由于氨基酸的多样性更高，对于识别6-8个或更长氨基酸序列的病毒蛋白酶而言，发生随机切割事件的概率相对较低。宿主蛋白中SSHHPS的预测在很大程度上取决于所研究病毒蛋白酶的特异性。如果蛋白酶具有严格的序列特异性要求，则发现切割位点序列的概率为1/206 = 6400万分之一，或1/208 = 256亿分之一；然而，大多数蛋白酶在各个亚位点具有一定容忍性（例如，在S1位点可容忍R或K）。因此，并不要求宿主与病毒中发现的序列之间具有完全一致的序列同一性。对于序列要求较宽松的病毒蛋白酶（例如属于Picornaviridae科的蛋白酶），在宿主蛋白中发现切割位点的概率可能更高。表1中的许多条目均来自Picornaviridae科病毒。
Schechter &amp; Berger 记号法20常用于描述蛋白酶底物中的残基及其结合的亚位点，本文全程采用此记号法。底物中位于可切割肽键N端的残基记为P3-P2-P1，位于C端的残基记为P1'-P2'-P3'。蛋白酶中相应结合这些氨基酸残基的亚位点分别为S3-S2-S1和S1'-S2'-S3'。
为了确定哪些宿主蛋白被靶向，我们可以通过鉴定病毒多聚蛋白切割位点中的SSHHP序列，并搜索含有这些序列的宿主蛋白。本文概述了利用已知病毒蛋白酶切割位点序列来鉴定SSHHP的方法。所描述的生物信息学方法、蛋白酶检测以及计算机模拟方法应与基于细胞的实验联合使用。
对病毒蛋白酶靶向的宿主蛋白进行序列比对，揭示了这些短切割位点序列中存在物种特异性差异。例如，委内瑞拉马脑炎病毒（VEEV）的nsP2蛋白酶被发现可切割人源TRIM14，一种三结构域（TRIM）蛋白6。某些TRIM蛋白是病毒限制因子（例如TRIM5α21），大多数被认为具有泛素E3连接酶活性。TRIM14缺乏RING（really interesting new gene）结构域，因此不被认为是一种E3连接酶22。已有研究提出TRIM14可能是线粒体抗病毒信号体（MAVS）中的接头蛋白22，但也可能具有其他抗病毒功能23。对来自不同物种的TRIM14序列进行比对显示，马缺乏该切割位点，并携带一种截短形式的TRIM14，缺失其C末端的PRY/SPRY结构域。该结构域包含一个多泛素化位点（图2）。在马中，这些病毒感染具有高度致死性（约20–80%死亡率），而在人类中，仅有约1%因VEEV感染死亡24。PRY/SPRY结构域的切割可能暂时中断MAVS信号级联反应。该级联反应可由双链RNA（dsRNA）触发，进而诱导干扰素和促炎性细胞因子的产生。因此，SSHHPS序列的存在可能有助于预测哪些物种对特定IV组病毒具有防御系统。
在第四类病毒中，干扰素拮抗机制被认为具有多重冗余性25。宿主蛋白的切割在感染过程中可能是瞬时的，其浓度可能随时间恢复。我们发现在转染编码蛋白酶的质粒（巨细胞病毒启动子驱动）后6小时，即可在细胞中检测到TRIM14的切割产物。然而，在更长时间后，这些切割产物则无法被检测到。在病毒感染的细胞中，动力学过程有所不同，切割产物可在感染后6至48小时之间被检测到6。其他研究者也曾报道，在感染后3至6小时即可观察到宿主蛋白切割产物的出现9,11。
细胞内的蛋白水解活性通常难以捕捉；其切割产物在溶解度、浓度、稳定性和寿命方面可能存在差异。在基于细胞的检测中，不能假定切割产物会在细胞内累积，也不能认为切割与未切割蛋白的条带强度会呈现此消彼长的补偿性变化，因为被切割的蛋白可能迅速降解，在预期分子量（MW）处的Western印迹中无法被检测到（例如，含有表位的区域可能被宿主其他蛋白酶切割，或发生泛素化修饰）。如果病毒蛋白酶的底物是天然免疫应答蛋白，则其浓度在感染过程中可能发生改变。例如，某些天然免疫应答蛋白在病毒感染前即已存在，并在干扰素作用下进一步诱导表达26。因此，目标蛋白的浓度在感染期间可能波动，导致未感染与感染细胞裂解液之间的比较难以解释。此外，并非所有细胞都会被均一转染或感染。相比之下，使用从大肠杆菌（E. coli）中纯化的蛋白进行的体外蛋白酶检测所涉及的变量较少，且此类检测可采用SDS-PAGE而非免疫印迹进行。在CFP/YFP底物蛋白纯化的早期步骤中，可抑制污染性蛋白酶的活性，同时可纯化突变的病毒蛋白酶作为对照，以确定切割是否由病毒蛋白酶本身引起，还是由污染的细菌蛋白酶所致。
体外蛋白酶检测的一个局限性在于其缺乏哺乳动物细胞的复杂性。酶要切割其底物，二者必须共定位于同一区域。IV组病毒蛋白酶在结构和定位上各不相同。例如，寨卡病毒（ZIKV）蛋白酶嵌入内质网（ER）膜中并朝向细胞质，而委内瑞拉马脑炎病毒（VEEV）nsP2蛋白酶则是存在于细胞质和细胞核中的可溶性蛋白27。在ZIKV SSHHPS分析中发现的一些切割位点序列位于信号肽中，提示某些靶标的切割可能在翻译过程中同时发生。因此，在这些分析中还需考虑蛋白酶与底物在细胞内的具体定位。
基于细胞的检测方法可用于确定已鉴定的宿主蛋白在病毒感染中的作用。通过添加蛋白酶抑制剂6或对宿主靶蛋白引入突变16等手段阻断病毒蛋白酶对宿主蛋白的切割，可用于研究这些干预对病毒复制的影响。过表达靶向蛋白也可能影响病毒复制28。可通过空斑实验或其他方法对病毒复制进行定量分析。

<table><tbody><tr><td>250 mL 锥形瓶</td><td>VWR</td><td>89000-362</td><td></td></tr><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>Acros Organics (Fisher)</td><td>125472500</td><td>危险：急性毒性。请在通风橱中打开瓶盖，避免吸入蒸气。</td></tr><tr><td>4 L Pyrex 广口带螺口盖量筒式锥形瓶</td><td>Millipore Sigma</td><td>CLS49954L-1EA</td><td></td></tr><tr><td>AKTA Prime Plus</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0729-01</td><td></td></tr><tr><td>AKTA XK 16/20 层析柱</td><td>GE Healthcare</td><td>28988937</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-0.5 离心过滤单元</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC501096</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 离心过滤单元</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC901096</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4 离心过滤单元</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC801024</td><td></td></tr><tr><td>氨苄青霉素</td><td>Sigma</td><td>A0166</td><td>危险：可能引起过敏反应（皮肤或呼吸系统）。</td></tr><tr><td>Chelating Sepharose Fast Flow</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0575-02</td><td>树脂经 0.2 M 硫酸镍平衡后，文中称为镍柱。用水洗涤后柱子呈绿色，用缓冲液平衡后呈蓝色。</td></tr><tr><td>氯霉素</td><td>RPI</td><td>C61000</td><td>危险：可能致癌。</td></tr><tr><td>Corning 50 mL 离心管</td><td>Corning</td><td>430828</td><td>建议：聚丙烯管在超声处理时比聚乙烯管更不易破裂</td></tr><tr><td>Corning 96 孔半面积微孔板，非结合表面</td><td>Corning</td><td>3993</td><td></td></tr><tr><td>透析袋夹</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI68011</td><td></td></tr><tr><td>一次性 PD-10 脱盐柱</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0851-01</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Sigma</td><td>DN25-1G</td><td></td></tr><tr><td>DTT（DL-二硫苏糖醇）</td><td>RPI</td><td>D11000-50.0</td><td>警告：急性经口毒性；对皮肤和眼睛有刺激性</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>S311-500</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 带透明盖培养皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Acros Organics (Fisher)</td><td>15892-0010</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Millipore Sigma</td><td>H4034-1KG</td><td></td></tr><tr><td>咪唑</td><td>Acros Organics</td><td>301870010</td><td>危险：有毒，具刺激性</td></tr><tr><td>IPTG（异丙基 &amp;beta;-D-硫代半乳糖吡喃糖苷）</td><td>Calbiochem (Millipore Sigma)</td><td>420291</td><td>避免吸入粉尘。避免接触眼睛和皮肤。</td></tr><tr><td>Laemmli 上样缓冲液</td><td>BIO-RAD</td><td>1610737</td><td></td></tr><tr><td>LB 琼脂</td><td>Fluka (Millipore Sigma)</td><td>L3027-1KG</td><td>建议：液体中放入磁力搅拌子一同高压灭菌，并在冷却过程中持续搅拌。待瓶壁温度降至手可无痛握住30秒时，再加入抗生素。</td></tr><tr><td>LB 培养基</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP1426-2</td><td></td></tr><tr><td>溶菌酶</td><td>Sigma</td><td>L4919-5g</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra 垂直电泳槽</td><td>BIO-RAD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Oak Ridge 高速聚丙烯离心管</td><td>Nalgene (Thermo Scientific)</td><td>3119-0050</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>New Brunswick Innova 42R 摇床培养箱</td><td>Eppendorf</td><td>M1335</td><td></td></tr><tr><td>六水合硫酸镍（晶体/ACS认证），Fisher Chemical</td><td>Fisher Scientific</td><td>N73-500</td><td>危险：吞咽或吸入有害，对皮肤和眼睛有刺激性</td></tr><tr><td>One Shot BL21(DE3) 化学感受态 &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt;</td><td>Invitrogen (Thermo Fisher)</td><td>C600003</td><td>吸入或吞咽可能有害。对敏感人群可能引起皮肤和眼睛刺激。</td></tr><tr><td>One Shot BL21(DE3) pLysS 化学感受态 &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt;</td><td>Invitrogen (Thermo Fisher)</td><td>C606003</td><td>吸入或吞咽可能有害。对敏感人群可能引起皮肤和眼睛刺激。</td></tr><tr><td>pet15b 质粒 DNA</td><td>Novagen (Millipore Sigma)</td><td>69661</td><td>商业DNA合成由 GenScript Inc. 完成。pet15b 质粒用于 CFP/YFP 底物的构建。</td></tr><tr><td>pet32b</td><td>Novagen (Millipore Sigma)</td><td>69016-3</td><td>pet32b 质粒用于半胱氨酸蛋白酶的构建。</td></tr><tr><td>Pierce 蛋白酶抑制剂小片剂，不含EDTA</td><td>Thermo Fisher</td><td>A32955</td><td>警告：皮肤腐蚀/刺激；眼睛损伤</td></tr><tr><td>酶标仪</td><td>Molecular Devices</td><td>Model M5</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Protein All Blue 预染蛋白标准品</td><td>BIO-RAD</td><td>161-0373</td><td></td></tr><tr><td>蛋白提取试剂</td><td>Novagen (Millipore Sigma)</td><td>70584-4</td><td>可使用 BugBuster 或 Bper（目录号 #78248，ThermoFisher）</td></tr><tr><td>Q-Sepharose Fast Flow</td><td>G.E. Healthcare</td><td>17-0510-01</td><td>阴离子交换树脂</td></tr><tr><td>RunBlue（12%）17孔预制聚丙烯酰胺凝胶</td><td>Expedeon</td><td>BCG01227</td><td>可使用任何12%的预制聚丙烯酰胺凝胶</td></tr><tr><td>RunBlue 20x SDS 电泳缓冲液</td><td>Expedeon</td><td>NXB50500</td><td>取50 mL加去离子水稀释至1000 mL，得到1x工作液</td></tr><tr><td>RunBlue 即用型蓝色凝胶染色液</td><td>Expedeon</td><td>ISB1L</td><td>无需稀释，按说明使用</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Fisher Chemical</td><td>S271-10</td><td></td></tr><tr><td>Sonifier Cell Disrupter 450 超声破碎仪</td><td>Branson Ultrasonics (VWR)</td><td>Model No. 101-063-346R</td><td>超声仪使用档位为5</td></tr><tr><td>Spectra/Por 6-8 kD 截留分子量透析袋</td><td>Spectrum Labs</td><td>132645T</td><td>透析袋</td></tr><tr><td>SP-Sepharose Fast Flow</td><td>G.E. Healthcare</td><td>17-0729-01</td><td>阳离子交换树脂</td></tr><tr><td>牛血浆凝血酶</td><td>Sigma</td><td>T6634-500UN</td><td></td></tr><tr><td>Tris 碱</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-500</td><td>注意：对眼睛/皮肤有刺激性</td></tr></tbody></table>

利用体外与计算机模拟方法分析第四组病毒sshhps

Analysis of Group IV Viral SSHHPS Using In Vitro and In Silico Methods

甲病毒的酶以单一多肽形式合成。非结构多蛋白（nsP）通过其nsP2半胱氨酸蛋白酶进行加工，产生对病毒复制至关重要的活性酶。病毒蛋白酶具有高度特异性，可识别保守的切割位点基序序列（约6-8个氨基酸）。在多种IV组病毒中，nsP蛋白酶的切割位点基序序列可在参与先天免疫应答的特定宿主蛋白中找到，某些情况下，这些被靶向的蛋白似乎与病毒诱导的表型相关。这些病毒利用宿主与病原体蛋白之间短段同源序列（SSHHPS）实现对宿主蛋白的靶向降解。为鉴定SSHHPS，可将病毒蛋白酶切割位点基序序列输入BLAST程序，并对宿主基因组进行搜索。初步切割实验可使用纯化的nsP病毒蛋白酶及在E. coli中制备的荧光共振能量转移（FRET）底物进行。FRET底物包含青色和黄色荧光蛋白以及切割位点序列（CFP-序列-YFP）。该蛋白酶检测既可在酶标仪中连续进行，也可在SDS-PAGE凝胶中非连续进行。可通过计算机模拟生成肽底物结合模型，以指导底物筛选和定点突变研究。CFP/YFP底物还被用于筛选蛋白酶抑制剂。这些体外和计算机模拟方法可与基于细胞的检测相结合，以确定被靶向的宿主蛋白是否影响病毒复制。

对寨卡病毒（ZIKV）ns2B/3蛋白酶进行SSHHPS分析，鉴定出4种宿主蛋白靶点：FOXG1、SFRP1、来自视网膜cDNA文库的Gsα亚基，以及NT5M线粒体5',3'-核苷酸酶（图10）6。值得注意的是，其他方法均未预测到这些蛋白可能是ZIKV蛋白酶的靶点。FOXG1基因的突变与一种先天性综合征相关，其特征为发育障碍及小头畸形等脑结构异常。SFRP1是一种分泌型卷曲相关蛋白（SFRP）；这类可溶性受体可通过竞争性结合Wnt配体，拮抗并抑制Wnt信号通路。Wnt信号通路参与调控黄病毒（Flavivirus）感染期间的干扰素（IFN）反应36。SFRP1的切割预计将增强黄病毒的复制。此外，SFRP1还参与Th17细胞的分化过程37。SSHHPS的序列比对显示，不同物种在切割位点序列上存在特异性差异（图10D）。SFRP1的切割位点序列在人类和鸡中完全相同；而寨卡病毒可在鸡胚中引起死亡和小头畸形38。在啮齿类动物中，高度保守的P1位点（K/R）R↓G被甘氨酸（RGG）取代。免疫功能健全的小鼠品系通常对寨卡病毒感染和疾病具有抗性39。
可以使用酶标仪中的连续检测方法测定病毒多蛋白序列和宿主蛋白序列的稳态动力学参数及抑制常数31,40,41（图11A）。对于定性切割信息，例如特定序列的切割或不同化合物对蛋白酶的抑制作用，可采用非连续检测方法（图11B）。
可能需要优化CFP与YFP之间的残基数。可使用计算机模拟方法构建底物结合模型。图9展示了nsP1/nsP2连接区的一个代表性对接模型。对于VEEV nsP2蛋白酶，已有报道表明其可切割一段12个氨基酸的Semliki Forest Virus（SFV）序列（Km = 0.58 mM）33。将底物序列延长至19、22和25个残基，并降低缓冲液的离子强度，可显著降低Km值。对VEEV nsP2晶体结构及其晶格堆积的分析还显示，其中一个连接区的部分结构以螺旋构象与蛋白酶结构域紧密堆积。因此，较长的VEEV底物可能由于能够识别二级结构模体而实现更有效的结合。
对于TRIM14，我们获得的Km值为21 µM6,33。该底物携带宿主蛋白序列的Km值与含有病毒多聚蛋白切割位点序列的底物Km值相近（Km(V12) = 12 µM，Km(V34) = 21 µM）。nsP1/nsP2、nsP2/nsP3和nsP3/nsP4连接处的切割位点序列被切割的效率各不相同。在细胞内，这被认为有助于多聚蛋白的依次切割42。
解释阴性结果时应谨慎。若未发生切割，可能是切割位点过短，或纯化的蛋白酶无活性。对于被切割的底物，还需进一步实验以确认全长蛋白的切割情况或在病毒感染细胞中的切割现象。应选择适当的后续实验，也可检测靶蛋白过表达或沉默对病毒复制的影响。
<img alt="图1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig1a.jpg" /> 
图1：基因沉默的三种机制。 基因沉默可在DNA、RNA或蛋白质水平上发生。这些“搜索并删除”机制各自利用一个“关键词”来引导对含有该词的文件进行切割。本图改编自Morazzani等人的研究32及其所引文献。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig2a.jpg" /> 
图2：不同物种间切割位点序列的特异性差异。 图示为TRIM14同源蛋白C端的PRY/SPRY结构域比对结果。通过灰色高亮的保守基序可识别PRY/SPRY结构域。人源TRIM14被VEEV nsP2半胱氨酸蛋白酶在QEAGA↓G位点切割。SSHHP序列以颜色标示。绿色标记的残基为P1'位残基；蓝色为P4位残基；红色为切割位点基序序列中其他保守残基。马源TRIM14为截短形式，缺失PRY/SPRY结构域。青色高亮的赖氨酸可发生多聚泛素化，对MAVS信号体的组装具有重要作用。C端PRY/SPRY结构域可能在急性病毒感染期间被nsP2蛋白酶短暂切割，从而在细胞内抑制宿主的抗病毒反应。而在马源中，该结构域始终缺失。这提示TRIM14的PRY/SPRY结构域可能在抵抗VEEV感染中发挥保护作用。本图改编自Morazanni等6 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看本图的放大版本。</a>
<img alt="图3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig3a.jpg" /> 
图3：利用BLAST鉴定SSHHPS序列。 VEEV nsP1/nsP2连接处的切割位点基序序列与宿主蛋白TRIM14中的SSHHP序列比对。绿色标注的残基为P1'残基；蓝色标注的是P4残基；红色标注的是切割位点基序中的其他保守残基。大多数比对结果仅显示在保守切割位点基序区域之外存在同源性，或未包含P1/P1'可切割键的残基。TRIM14显示出连续6个残基的匹配，其中包括P1和P1'残基。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig4a.jpg" /> 
图4：VEEV nsP2 半胱氨酸蛋白酶底物 CFP-V12-YFP 的蛋白质和DNA序列。 NdeI（CATATG）和 XhoI（CTCGAG）限制性酶切位点以大写字母显示。红色部分为病毒多聚蛋白中位于 nsP1 与 nsP2 之间的切割位点序列。绿色标记的残基为切割位点的 P1' 位残基，蓝色标记的为 P4 位残基。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig5a.jpg" /> 
图5：Trx-VEEV-nsP2 半胱氨酸蛋白酶构建体的蛋白序列。 硫氧还蛋白（Trx）以黄色显示。凝血酶切割位点和 His标签以青色显示。Cys-His 二联体以红色标注。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig6a.jpg" /> 
图6：MOE中的肽段结构。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig7a.jpg" /> 
图7：使用 PyRx/AutoDock 进行底物肽的分子对接。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig7large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig8a.jpg" /> 
图8：在Biowulf集群上运行的作业。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig8large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig9a.jpg" /> 
图9：含nsP1/nsP2连接处切割位点序列的VEEV P12底物模型。 Cys-477/His-546催化二联体以蓝色显示。该图使用Pymol软件（https://pymol.org）制作。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig9large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig10a.jpg" /> 
图10：寨卡病毒ns2B/ns3蛋白酶的SSHHPS分析。（A）ZIKV ns2B/ns3蛋白酶预测的宿主蛋白靶点。红色残基匹配单一切割位点序列。绿色残基在亚位点处可被耐受，并与其他切割位点的残基相匹配。SFRP1在连续顺序中含有相同残基的数量最多。（B）表达并纯化了含有来自各宿主蛋白（人源）预测SSHHPS序列的CFP-底物-YFP蛋白（约50–60 kDa）。ZIKV蛋白酶切割了人源FOXG1、SFRP1、NT5M以及从视网膜cDNA文库中分离的Gsα亚基。切割产物大小约为28–30 kDa。底物序列信息见Morazzani等6。（C）尽管ns2B/ns3蛋白酶可切割SFRP1，但不能切割其同源蛋白（SFRP2和SFRP4）。（D）不同动物物种间切割位点的比对可能有助于为第四类病毒选择合适的动物模型。请注意，在SFRP1中，人类与啮齿类之间的保守R↓G序列存在差异。图示转载自Morazzani等6 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig10large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig11a.jpg" /> 
图11：使用连续和非连续检测方法进行稳态动力学分析。 （A）将表5中所示的动力学数据使用GraFit软件作图。插图为Lineweaver-Burk图。（B）SDS-PAGE凝胶显示CFP-V12-YFP底物的切割产物。泳道1为“未切割”底物（48 kDa）。泳道2为“已切割”底物（31 kDa和27 kDa）。在泳道3-9中加入了不同化合物以测试其抑制活性。泳道4包含共价抑制剂E64d。这些反应在室温下孵育过夜，约17小时。样品需经煮沸处理才能获得清晰的条带模式。在含有酶的反应中可见nsP2蛋白酶条带（56 kDa），而泳道1中未见。泳道1为“无酶”对照。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig11large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

我们提出了一种通用方案，用于识别嵌入病毒多聚蛋白中的宿主-病原体蛋白短序列同源区（SSHHPS）。多种第四组病毒可利用病毒蛋白酶识别SSHHPS，并靶向降解特定的宿主蛋白。

利用体外与计算机模拟方法分析第四组病毒SSHHPS

甲病毒的酶以单一多肽形式合成。非结构多蛋白（nsP）由其nsP2半胱氨酸蛋白酶切割，产生……

我们已发现，IV组病毒基因组编码了宿主蛋白质序列的短片段。这些序列可位于病毒蛋白酶切割位点内，用于靶向破坏宿主蛋白，通常是参与免疫反应生成的蛋白。使用蛋白酶检测方法的一个主要优势在于，它能够排除细胞的复杂性，直接验证病毒蛋白酶是否能够切割特定序列。因此，当我们分析寨卡病毒SSHHPS序列时，发现该蛋白酶能够切割参与免疫反应的蛋白质中的序列，且其中一些蛋白质还在大脑和眼睛的发育过程中发挥作用。首次进行该技术操作时，应当注意：如果未观察到切割现象，可能由多种因素导致，例如蛋白酶本身的活性问题。演示该实验步骤的是来自我实验室的技术员 Jaimee Compton。首先打开蛋白质 BLAST，输入切割位点周围 20 个氨基酸以及病毒多聚蛋白序列，选择“非冗余蛋白序列”，然后输入待搜索的宿主基因组。如有需要，选择 PHI-BLAST 并输入模式序列，其中方括号表示括号内的任一氨基酸均可位于该取代位置，然后点击 BLAST。根据与切割位点序列匹配的连续相同或可容忍残基的数量，对BLAST结果进行排序。从列表中选择包含六个或更多相同或相似残基的蛋白质，用于蛋白酶活性检测分析。构建一个编码青色荧光蛋白、最多25个氨基酸的切割序列以及黄色荧光蛋白的质粒。接下来，通过在四个四升烧瓶中各接种25毫升过夜培养物来制备CFP和YFP底物。在37°C下振荡培养，并通过紫外-可见分光光度法在600纳米处每小时监测一次生长情况。当细菌的吸光度达到约1时，向每个烧瓶中加入0.5毫升1摩尔的IPTG以诱导蛋白表达，然后将振荡培养箱的温度降至17°C，继续诱导表达17至20小时。第二天，于4摄氏度下以7000 × g离心10分钟，使细菌沉淀。弃去上清液，将沉淀物保存于-80摄氏度，或立即进行细胞裂解。为裂解细胞，根据文稿说明配制100毫升裂解缓冲液，将沉淀物重悬于缓冲液中，并将25至25毫升的悬液分装至50毫升一次性锥形管中。将试管放入盛有冰水的塑料烧杯中，然后将超声破碎仪的探头插入管内，使探头距离管底约1厘米，对裂解液进行10至20次超声处理，直至液体变得流动且完全液化。超声处理结束后，将裂解液转移至高速离心管中，在4摄氏度条件下以20,500 × g离心30分钟。将上清液转移至洁净的容器中，弃去沉淀物。将裂解液上样至镍柱，然后用两倍柱体积的缓冲液A洗涤柱子，接着用五倍柱体积的20%缓冲液B洗涤。洗涤过程中，随着杂质从柱子中洗脱，280纳米处的吸光度会升高。继续洗涤直至A280恢复至基线水平。随后用两到三倍柱体积的100%缓冲液B洗脱蛋白，收集10毫升的洗脱组分，并确保测定每管组分的A280值。根据手稿说明配制八种反应混合液，每种取45微升加入至黑色半面积96孔板每行的前三个孔中。设置酶标仪以固定的光电倍增管参数，同时在两个波长下检测荧光信号。将读数程序设定为20至30分钟，每分钟读数一次，并选择需要检测的孔位。将酶标板放入仪器中，开始读取数据，并随时间监测发射光比率。对含有未切割底物的酶标板进行终点读数。取出酶标板，向每孔加入五微升酶溶液。可将第一列保存为未切割的对照。然后再次读取酶标板，持续 20 至 30 分钟，并确保酶标仪设置为输出绝对值。读板完成后，用封板膜密封酶标板以防止蒸发，并在室温下放置过夜，使酶能够完全切割底物。24 小时后，移除薄膜并对培养板进行终点读数。计算发射比率的平均值，并将其记录为切割值。使用 SDS-PAGE 确认底物的切割情况。将分子量标记物加入第一或最后一泳道，然后从未切割反应开始，将每种反应混合物各5 µL加入凝胶的泳道中。将凝胶槽的电极连接至电源，以110伏电压电泳60分钟。使用撬片工具将凝胶从玻璃夹心中取出，并将其浸入5至10 mL染色液中。孵育1至24小时后，去除多余的染料，将凝胶浸入水中。然后使用凝胶成像仪拍摄凝胶图像。为准备蛋白质结构，将蛋白质PDB文件载入MOE中。单击“选择”和“溶剂”，然后删除溶剂。从顶部菜单栏的“计算”中打开“结构准备”面板，通过单击“校正”自动修正所有结构项。通过单击“3D质子化”对结构进行质子化。通过打开“部分电荷”面板，选择 AMBER 99 并根据需要调整氢原子和孤对电子，为蛋白质添加部分电荷。然后保存结构文件。要构建底物肽和 TRIM14 的结构，请打开“蛋白质构建器”面板，输入底物序列，并选择“自动重排”。接下来，将几何构型设置为扩展（Extended），然后点击构建（Build）。最后对结构进行最小化处理，并将其保存为PDB文件。使用PyRx AutoDock 4.2软件将底物肽段对接至VEEV-nsP2。加载蛋白质，右键点击其名称，然后选择“生成大分子”以准备 PDBQT 分子对接文件。接着加载底物分子并选择“生成配体”以准备配体对接文件。在底部的对接面板上启动 AutoDock 向导，并选择已准备好的配体和蛋白质文件。通过手动调整网格尺寸来定义蛋白质结合口袋，然后运行 AutoGrid。接着运行 AutoDock，并选择拉马克遗传算法（Lamarckian genetic algorithm）方法。单击“对接参数”（Docking Parameters），将遗传算法运行次数（GA runs）设置为 50，然后单击“下一步”（Forward）以开始对接运行。当 AutoDock 完成后，打开“分析结果”面板并检查所有预测的结合构象。选择具有最低预测结合能且 cis-477 与切割位点处底物之间存在合理结合相互作用的最佳模型，并将其保存为 PDB 文件，用于后续的分子动力学（MD）模拟。在使用 AutoDock 读取结合构象后，重要的是进行对接后分析，以确定可用于分子动力学（MD）模拟优化的合理结合模型。本方案用于在寨卡病毒ns2B/3蛋白酶中寻找宿主-病原体蛋白序列的短同源片段（SSHHPS）。共鉴定出四种宿主蛋白靶点：FOXGS、SFRP1、来自视网膜cDNA文库的Gsalpha亚基以及NT5M线粒体5'3'核苷酸酶。SSHHPS的序列比对揭示了不同物种在切割位点序列上的特异性差异。SFRP1序列在人类和鸡中完全相同，这一点值得注意，因为寨卡病毒可在鸡胚中引发死亡和小头畸形。连续检测法用于测定病毒多蛋白序列的稳态动力学参数和抑制常数，而非连续检测法用于获取定性的切割信息，例如特定序列的切割情况或不同化合物对蛋白酶的抑制作用。利用计算机模拟方法构建了委内瑞拉马脑炎病毒nsP1-nsP2连接区的模型。对于nsP2蛋白酶，延长底物序列并降低缓冲液的离子强度，可显著降低对塞姆利基森林病毒序列切割反应的米氏常数。在进行该实验操作时，必须同时运行对照实验。在进行SSHHPS序列分析之前，应先测试含有病毒蛋白酶切割位点序列的底物。若观察到宿主蛋白被切割，则应进行后续实验，以确认该宿主蛋白是否影响病毒复制。可通过过表达或沉默该蛋白，然后检测其对病毒复制的影响来实现。第四组包含大量新出现和正在出现的病原体。SSHHPS序列以高度可预测的方式将特定宿主蛋白和通路与病毒蛋白酶关联起来。

analysis-of-group-iv-viral-sshhps-using-in-vitro-and-in-silico-methods

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

第四组病毒SSHHPS使用体外和西里科方法的分析

我们描述了一种用于鉴定宿主信号分子在模式疱疹病毒——γ疱疹病毒68（γHV68）裂解性复制中关键作用的实验方案。通过利用基因修饰小鼠品系和胚胎成纤维细胞进行γHV68的裂解性复制，该方案可同时实现对病毒-宿主相互作用的表型特征分析和分子水平研究。...

解析模型疱疹病毒裂解复制中的宿主-病毒相互作用

单病毒基因组学（SVG）是一种用于分离和扩增单个病毒颗粒基因组的方法。通过流式细胞术将混合病毒悬液分选到含有琼脂糖的载玻片微孔中，从而捕获单个病毒颗粒，并在后续处理过程中减少基因组剪切。利用多重置换扩增（MDA）实现全基因组扩增，获得适用于测序的基因组材料。...

单病毒基因组学用于单个病毒颗粒的分离与基因组分析

本视频演示了一种用于筛选抗病毒化合物的病毒吸附实验。通过使用基因修饰的丙型肝炎病毒和荧光素酶，检测化合物对病毒吸附的抑制作用，表现为共处理孔中的发光强度低于仅用病毒处理的对照孔。...

一种用于抗病毒化合物筛选的病毒吸附实验

本视频展示了一种用于评估靶向病毒进入宿主细胞及与内体融合特定步骤的抗病毒药物的检测方法。将细胞在低温下孵育，随后用丙型肝炎病毒（HCV）感染。低温条件允许病毒与宿主细胞结合，但通过内吞作用抑制其内化。via...

一种用于评估受试化合物对宿主细胞中病毒进入和融合影响的检测方法

体外检测病毒复制的实验方法已因表达荧光素酶或其他可产生生物发光的酶的重组RNA病毒的发展而得到显著改进。本文详细介绍了一种高通量筛选流程，该流程结合了麻疹病毒和基孔肯雅病毒的此类重组毒株，用于从化合物库中筛选广谱抗病毒药物。...

广谱RNA病毒化学抑制剂的高通量筛选

本文介绍了一种用于研究病毒进入特定步骤的实验方案，以鉴定和评估新型抗病毒药物。...

早期病毒进入检测法用于抗病毒化合物的鉴定与评价

本文介绍了一种利用高通量RNA干扰筛选来发现可被调控以增强溶瘤病毒治疗效果的宿主靶点的实验方案，特别是针对弹状病毒和痘苗病毒治疗，但该方法也可轻松适用于其他溶瘤病毒平台，或用于发现普遍调控病毒复制的宿主基因。...

全基因组RNA干扰筛选鉴定调控溶瘤病毒治疗的宿主因子

本文介绍了用于鉴定以下两类分子的实验方案：1）促进节肢动物传播病毒（arbovirus）复制的病毒编码免疫调节因子；2）限制节肢动物传播病毒复制的真核宿主因子。这些基于荧光和发光的检测方法使研究人员能够在信号-背景比低的简单实验体系中，快速获得节肢动物传播病毒复制的定量结果。...

利用虫媒病毒感染作为筛选工具鉴定病毒免疫调节因子和宿主抗病毒因子

本实验方案的目的是展示与病毒进入相关的不同检测方法，这些方法可用于鉴定候选的病毒进入抑制剂。...

利用病毒进入检测与分子对接分析鉴定柯萨奇病毒A16型抗病毒候选药物

本方案描述了一种 体外 用于建模的系统 从头合成...

建立与定量 从头合成 游离型卡波西肉瘤相关疱疹病毒对细胞的裂解性感染

本文介绍了利用荧光素酶报告系统制备SARS-CoV-2假病毒颗粒的方法及其在筛选病毒进入抑制剂中的应用。本方案以两种不同的进入抑制剂为例进行演示：重组人ACE2-Fc融合蛋白和小分子化合物阿比多尔。...

使用基于MLV的假病毒鉴定SARS-CoV-2进入抑制剂作为潜在抗病毒药物的实验方案

了解第四组病毒SSHHPS的体外与计算机分析方法。本研究利用蛋白质BLAST和蛋白酶活性检测技术，识别病毒多蛋白中的宿主同源短序列，揭示病毒如何通过靶向切割免疫相关蛋白逃逸宿主防御，为抗病毒药物开发提供新靶点。

利用体外与计算机模拟方法分析第四组病毒SSHHPS

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