Name: 用于小型细胞处理的自动逆流离心系统 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 49 s
Description: 了解用于小型细胞制造的自动化逆流离心缓冲交换与浓缩技术。该方法实现高回收率和小体积浓缩产物，为细胞制造提供高效可靠的封闭式处理方案。

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本工作由维多利亚州政府运营基础设施支持计划以及经济发展、就业、交通和资源部提供的维多利亚州政府技术代金券资助。RL 获得国家健康与医学研究理事会职业发展研究员资助。AL 获得澳大利亚研究生奖资助。

1. 缓冲液置换所需试剂和细胞的准备
<ol>
	<li>在 II 级生物安全柜中配制缓冲液（参见材料表）。使用注射器和针头组件，从 500 mL 生理盐水袋中抽出 50 mL 生理盐水，然后加入 50 mL 20% 人血清白蛋白（HSA），配制成含 2% HSA 的生理盐水，作为洗涤缓冲液。</li>
	<li>从培养容器中收集细胞，并通过台盼蓝染色排除法进行细胞计数，以确定起始细胞数量和细胞活力。将细胞转移至转接袋中。 
	注意：本实验中，Jurkat 细胞在 RPMI 培养基中培养，MSCs 在 DMEM:F12 培养基中培养。两种培养基均添加 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 抗生素-抗真菌溶液。细胞在 37 °C、5% CO2 条件下培养。对于 MSCs 或贴壁细胞，需向培养容器中加入消化酶（如胰蛋白酶）以使细胞脱落，待细胞脱落后用培养基终止消化。本实验使用转接袋是因为细胞在培养容器中进行了扩增。然而，若细胞直接在细胞培养袋中培养，则可通过无菌管路焊接将培养袋直接连接至一次性使用套件。本实验中，每次运行使用 3 × 107 个 Jurkat 细胞或 1 × 107 个 MSCs，细胞悬浮于 40 mL 培养基中。
	<ol>
		<li>若具备无菌管路焊接仪，可使用注射器和针头组件将细胞加载至转接袋（参见材料表），以便将转接袋与一次性使用处理套件连接。</li>
		<li>或者，使用已灭菌的剪刀剪断连接管，保留约 10 cm 管路连接在转接袋上，并在管路末端安装一个雌性鲁尔接头。用注射器吸取细胞和培养基后，将注射器连接至鲁尔接头，并将细胞注入转接袋中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将含有细胞的袋子、步骤 1.1 中配制的含 500 mL 洗涤缓冲液的缓冲液袋、废液袋以及收集用注射器连接至一次性使用套件（图 1B）。 
	注意：各袋子的连接位置取决于程序设置。本实验中，我们将废液袋连接至 A 位，洗涤缓冲液袋连接至 B 位，细胞袋连接至 D 和 F 位，收集注射器连接至 H 位（图 1C）。</li>
</ol>
2. 自动化缓冲液置换程序
<ol>
	<li>打开设备的图形用户界面（GUI），在笔记本电脑或平板电脑上点击 &#34;START&#34; 按钮。然后 &#34;Open&#34; 现有协议，或点击 &#34;New&#34; 创建新协议。</li>
	<li>使用 &#34;Forward&#34; 和 &#34;Backward&#34; 按钮浏览每一步操作，选择需要打开/关闭的阀门、离心速度、泵速、泵的方向以及动作触发条件。各步骤的设置详见 Table 1。然后保存该协议。</li>
</ol>
3. 设置仪器
<ol>
	<li>将一次性使用处理套件放置在机器上，并相应悬挂连接的袋子。按下红色的&#34;停止/重置&#34;按钮，将所有阀门重置为默认关闭状态。 
	注意：当关闭机门时，机器将执行检测，以确保套件已正确安装且所有阀门正常工作。</li>
	<li>将图形用户界面（GUI）连接至处理设备，并按下&#34;连接&#34;按钮。然后下载已保存的程序。当绿色的&#34;运行&#34;按钮亮起时，表示该程序已准备就绪，可以开始运行。</li>
	<li>打开转移袋管路的手动夹具。 
	注意：如果操作人员忘记打开夹具，设备将停止运行并出现压力传感器警告。请按下&#34;停止&#34;按钮以重置设备，打开夹具后重新开始操作。</li>
</ol>
4. 自动化缓冲液置换
<ol>
	<li>按下&#34;开始&#34;以启动缓冲液置换程序。 
	注意：如需手动调整自动化流程，可在到达&#34;触发&#34;之前按下&#34;下一步&#34;按钮进入下一步，或按下&#34;暂停&#34;以暂停流程。此时细胞将在装置内循环，仅保持阀门 J 和 K 开放（图 1C）。</li>
	<li>在自动化步骤 6（表 1）结束时，当已排空的袋中进入空气并触发气泡传感器时，流程将暂停。若袋子确实已空，请按下&#34;下一步&#34;继续进入下一阶段；若传感器是因管路中的气泡而触发，则可按下&#34;暂停&#34;以恢复处理。</li>
</ol>
5. 细胞的收集与取样
<ol>
	<li>自动化流程结束后，关闭所有管路夹。打开设备门，取出一次性套件。断开注射器以收集细胞，用于后续操作。取少量收集的细胞进行细胞计数和活力检测（见步骤6.2）。</li>
</ol>
6. 工艺验证
<ol>
	<li>使用手动缓冲液置换方案进行对照实验。
	<ol>
		<li>将细胞悬液在200 × g 条件下离心5分钟。弃去上清液，并用30 mL细胞洗涤缓冲液重悬细胞。再次在200 × g 条件下离心5分钟。弃去上清液，并用10 mL细胞洗涤缓冲液重悬细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过台盼蓝排斥法进行细胞计数，使用自动细胞计数仪评估细胞活力。</li>
	<li>进行MTS实验，以在2、24和48小时定量细胞增殖。
	 
	注意：MTS实验按照制造商说明书在96孔组织培养板上进行。缓冲液置换后，每孔接种100 µL细胞培养基（含10,000个Jurkat细胞或1,500个细胞）。在每个时间点，向每孔加入20 µL MTS试剂，在37 °C孵育2小时。使用酶标仪在490 nm处测定吸光度。</li>
	<li>进行功能实验，比较自动化流程与手动流程对Jurkat细胞和MSC功能的影响。
	<ol>
		<li>将Jurkat细胞以1 × 106 个细胞/mL的密度接种于96孔板中，在含10%胎牛血清（FBS）的DMEM:F12培养基中，加入50 ng/mL佛波酯12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯（PMA）和1 µg/mL离子霉素（细胞刺激混合物）刺激，培养24小时。将细胞置于37 °C、5% CO2条件下孵育。</li>
		<li>根据制造商说明书，使用基于微球的ELISA法检测培养上清液中白细胞介素-2的产生（参见材料表）。</li>
		<li>将MSC以10,000个细胞/cm2的密度接种于12孔板中，在含10% FBS并补充50单位/mL干扰素-γ的1 mL DMEM:F12培养基中培养48小时。收集上清液进行犬尿氨酸浓度检测，以测定MSC的吲哚胺2,3-双加氧酶（IDO）酶活性，方法如前所述21。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Lopes, A. G., Sinclair, A., Frohlich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cost+Analysis+of+Cell+Therapy+Manufacture%3A+Autologous+Cell+Therapies%2C+Part+1%5BTitle%5D)+AND+%22BioProcess+International%22%5BJournal%5D)">Cost Analysis of Cell Therapy Manufacture: Autologous Cell Therapies, Part 1.</a> BioProcess International. 16 (3), (2018).</li>
<li>Hampson, B., Ceccarelli, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factories+of+the+future%3A+Can+Patient-Specific+Cell+Therapies+Get+There+from+Here%3F%5BTitle%5D)+AND+%22BioProcess+International%22%5BJournal%5D)">Factories of the future: Can Patient-Specific Cell Therapies Get There from Here?</a> BioProcess International. 14 (4), (2016).</li>
<li>Preti, R., Daus, A., Hampson, B., Sumen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+success+for+commercial+cell+therapy+manufacturing%5BTitle%5D)+AND+%22BioProcess+International%22%5BJournal%5D)">Mapping success for commercial cell therapy manufacturing.</a> BioProcess International. 13 (9), 33-38 (2015).</li>
<li>Heathman, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+translation+of+cell-based+therapies%3A+clinical+landscape+and+manufacturing+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">The translation of cell-based therapies: clinical landscape and manufacturing challenges.</a> Regenerative Medicine. 10 (1), 49-64 (2015).</li>
<li>Lipsitz, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+roadmap+for+cost-of-goods+planning+to+guide+economic+production+of+cell+therapy+products%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">A roadmap for cost-of-goods planning to guide economic production of cell therapy products.</a> Cytotherapy. 19 (12), 1383-1391 (2017).</li>
<li>Lopes, A. G., Sinclair, A., Frohlich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cost+Analysis+of+Cell+Therapy+Manufacture%3A+Autologous+Cell+Therapies%2C+Part+2%5BTitle%5D)+AND+%22BioProcess+International%22%5BJournal%5D)">Cost Analysis of Cell Therapy Manufacture: Autologous Cell Therapies, Part 2.</a> BioProcess International. 16 (4), 12-19 (2018).</li>
<li>Hanley, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+manufacturing+of+therapeutic+mesenchymal+stromal+cells+with+the+use+of+the+Quantum+Cell+Expansion+System%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Efficient manufacturing of therapeutic mesenchymal stromal cells with the use of the Quantum Cell Expansion System.</a> Cytotherapy. 16 (8), 1048-1058 (2014).</li>
<li>Leong, W., Nakervis, B., Beltzer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automation%3A+what+will+the+cell+therapy+laboratory+of+the+future+look+like%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Gene+Therapy+Insights%22%5BJournal%5D)">Automation: what will the cell therapy laboratory of the future look like?</a> Cell Gene Therapy Insights. 4 (9), 679-694 (2018).</li>
<li>Galipeau, J., Sensebe, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+Stromal+Cells%3A+Clinical+Challenges+and+Therapeutic+Opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal Stromal Cells: Clinical Challenges and Therapeutic Opportunities.</a> Cell Stem Cell. 22 (6), 824-833 (2018).</li>
<li>Salmikangas, P., Kinsella, N., Chamberlain, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+Antigen+Receptor+T-Cells+%28CAR+T-Cells%29+for+Cancer+Immunotherapy+-+Moving+Target+for+Industry%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">Chimeric Antigen Receptor T-Cells (CAR T-Cells) for Cancer Immunotherapy - Moving Target for Industry?</a> Pharmaceutical Research. 35 (8), 152(2018).</li>
<li>James, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+short-term+gain+can+lead+to+long-term+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Gene+Therapy+Insights%22%5BJournal%5D)">How short-term gain can lead to long-term pain.</a> Cell Gene Therapy Insights. 3 (4), 271-284 (2017).</li>
<li>Rafiq, Q. A., Thomas, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolving+role+of+automation+in+process+development%2C+manufacture+of+cell%2C+gene-based+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Gene+Therapy+Insights%22%5BJournal%5D)">The evolving role of automation in process development, manufacture of cell, gene-based therapies.</a> Cell Gene Therapy Insights. 2 (4), 473-479 (2016).</li>
<li>Rafiq, Q. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+Automated+Approaches+for+Cell+and+Gene+Therapy+Manufacture%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Gene+Therapy+Insights%22%5BJournal%5D)">Emerging Automated Approaches for Cell and Gene Therapy Manufacture.</a> Cell Gene Therapy Insights. 4 (9), 911-914 (2018).</li>
<li>Contreras, T. J., Jemionek, J. F., French, J. E., Shields, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Granulocyte+Isolation+by+Continuous+Flow+Centrifugation+Leukapheresis+and+Counterflow+Centrifugation+Elutriation+%28CFCL%2FCCE%29%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Human Granulocyte Isolation by Continuous Flow Centrifugation Leukapheresis and Counterflow Centrifugation Elutriation (CFCL/CCE).</a> Transfusion. 19 (6), 695-703 (1979).</li>
<li>Berger, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+elutriation+of+monocytes+within+a+closed+system+%28Elutra%E2%84%A2%29+for+clinical-scale+generation+of+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Efficient elutriation of monocytes within a closed system (Elutra™) for clinical-scale generation of dendritic cells.</a> Journal of Immunological Methods. 298 (1), 61-72 (2005).</li>
<li>Chen, Y., Hoecker, P., Zeng, J., Dettke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+Cobe+AutoPBSC+and+Gambro+Elutra+as+a+platform+for+monocyte+enrichment+in+dendritic+cell+%28DC%29+therapy%3A+Clinical+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Apheresis%22%5BJournal%5D)">Combination of Cobe AutoPBSC and Gambro Elutra as a platform for monocyte enrichment in dendritic cell (DC) therapy: Clinical study.</a> Journal of Clinical Apheresis. 23 (5), 157-162 (2008).</li>
<li>Whitford, W. G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWhitford%2C+WG+%22Continuous+Processing+in+Pharmaceutical+Manufacturing%22">Continuous Processing in Pharmaceutical Manufacturing</a>. Subramanian, G. , (2014).</li>
<li>Scinogy. SMALL BATCH CELL SEPARATION, WASH & CONCENTRATION. , https://www.scinogy.com/projects (2019).</li>
<li>Yu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+Jurkat+T+Lymphocyte+Leukemia+Cells+by+an+Engineered+Interferon-Alpha+Hybrid+Molecule%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Physiology+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Targeting Jurkat T Lymphocyte Leukemia Cells by an Engineered Interferon-Alpha Hybrid Molecule.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 42 (2), 519-529 (2017).</li>
<li>Moharram, S. A., Shah, K., Kazi, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+Acute+Lymphoblastic+Leukemia+Cells+Display+Activation+of+Different+Survival+Pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">T cell Acute Lymphoblastic Leukemia Cells Display Activation of Different Survival Pathways.</a> Journal of Cancer. 8 (19), 4124(2017).</li>
<li>Ling, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+use+IDO+to+regulate+immunity+in+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells use IDO to regulate immunity in tumor microenvironment.</a> Cancer Research. 74 (5), 1576-1587 (2014).</li>
<li>Tanzeglock, T., Soos, M., Stephanopoulos, G., Morbidelli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+mammalian+cell+death+by+simple+shear+and+extensional+flows%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Induction of mammalian cell death by simple shear and extensional flows.</a> Biotechnology and Bioengineering. 104 (2), 360-370 (2009).</li>
<li>Aguado, B. A., Mulyasasmita, W., Su, J., Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+viability+of+stem+cells+during+syringe+needle+flow+through+the+design+of+hydrogel+cell+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Improving viability of stem cells during syringe needle flow through the design of hydrogel cell carriers.</a> Tissue engineering. Part A. 18 (7-8), 806-815 (2012).</li>
<li>Zhu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroxyethyl+starch+as+a+substitute+for+dextran+40+for+thawing+peripheral+blood+progenitor+cell+products%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Hydroxyethyl starch as a substitute for dextran 40 for thawing peripheral blood progenitor cell products.</a> Cytotherapy. 17 (12), 1813-1819 (2015).</li>
<li>Schwandt, S., Korschgen, L., Peters, S., Kogler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cord+blood+collection+and+processing+with+hydroxyethyl+starch+or+non-hydroxyethyl+starch%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Cord blood collection and processing with hydroxyethyl starch or non-hydroxyethyl starch.</a> Cytotherapy. 18 (5), 642-652 (2016).</li>
<li>Stroncek, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counter-flow+elutriation+of+clinical+peripheral+blood+mononuclear+cell+concentrates+for+the+production+of+dendritic+and+T+cell+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Counter-flow elutriation of clinical peripheral blood mononuclear cell concentrates for the production of dendritic and T cell therapies.</a> Journal of Translational Medicine. 12, 241(2014).</li>
<li>Mfarrej, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-clinical+assessment+of+the+Lovo+device+for+dimethyl+sulfoxide+removal+and+cell+concentration+in+thawed+hematopoietic+progenitor+cell+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Pre-clinical assessment of the Lovo device for dimethyl sulfoxide removal and cell concentration in thawed hematopoietic progenitor cell grafts.</a> Cytotherapy. 19 (12), 1501-1508 (2017).</li>
<li>Abonnenc, M., Pesse, B., Tissot, J. D., Barelli, S., Lion, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+washing+of+thawed+haematopoietic+progenitor+cell+grafts%3A+a+preclinical+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Vox+Sanguinis%22%5BJournal%5D)">Automatic washing of thawed haematopoietic progenitor cell grafts: a preclinical evaluation.</a> Vox Sanguinis. 112 (4), 367-378 (2017).</li>
<li>Panes, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanded+allogeneic+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells+%28Cx601%29+for+complex+perianal+fistulas+in+Crohn%27s+disease%3A+a+phase+3+randomised%2C+double-blind+controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Expanded allogeneic adipose-derived mesenchymal stem cells (Cx601) for complex perianal fistulas in Crohn's disease: a phase 3 randomised, double-blind controlled trial.</a> Lancet. 388 (10051), 1281-1290 (2016).</li>
<li>Lim, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First-In-Human+Administration+of+Allogeneic+Amnion+Cells+in+Premature+Infants+With+Bronchopulmonary+Dysplasia%3A+A+Safety+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">First-In-Human Administration of Allogeneic Amnion Cells in Premature Infants With Bronchopulmonary Dysplasia: A Safety Study.</a> Stem Cells Translational Medicine. 7 (9), 628-635 (2018).</li>
</ol>

SW、IF 和 DJ 分别是 Scinogy Pty. Ltd. 的首席运营官、首席技术官和首席执行官。Scinogy 还提供了对 CFC 设备的使用权限。

所述的自动化缓冲液置换方案简单且易于操作。然而，该方案中仍有几个关键步骤至关重要，需特别注意。根据我们的经验，在处理较大的细胞（如间充质干细胞MSCs，平均直径为10–15 µm）时，每次运行应至少包含1 × 107个细胞，以实现最佳的细胞回收率（图4B）。处理较小的细胞（如Jurkat细胞，平均直径约10 µm）时，则需要约3 × 107个细胞才能形成稳定的流化细胞床（图4B）。当细胞数量过少时，细胞更容易从流化床中被冲出，从而影响最终的细胞回收率。此外，我们在保持离心速度恒定的条件下，比较了不同泵速下的细胞损失率。结果发现，随着流速增加，细胞损失也随之增加（图6），这是由于在较高流速下流化床的不稳定性增强所致。然而，当腔室中加载的细胞数量增加至10倍时，细胞损失百分比有所降低，这表明在处理较多细胞时可采用更高的泵速，从而加快处理速度。在操作步骤第...

基因与细胞治疗（GCT）领域的最新进展正迅速改变现代医学的格局。作为转化研究中发展最快的领域之一，GCT 行业也面临着独特且前所未有的挑战。除了需要稳健的临床效果外，高效且具有成本效益的生产工艺对于 GCT 的商业化成功至关重要，而在小规模生产中实现这一点尤为困难1。当每批细胞仅能为一名患者生产少数几剂，而非数百或数千剂时，时间、人力和质量保证的成本将显著增加。与生产工艺更类似于抗体和重组蛋白生产的同种异体细胞治疗不同，自体细胞治疗通常以小规模方式进行生产1。作为生物制药生产中相对较新的现象2，目前可用于小规模细胞处理的方案仍然十分有限。
缓冲液置换对于细胞制造至关重要。这是下游工艺中的一个步骤，通过该步骤将细胞从培养基中分离并浓缩，用于冷冻保存或输注。目前，小规模细胞制造通常采用类似于学术研究环境中的工艺，并依赖专用的洁净室来维持无菌状态3。手动的下游工艺通常使用台式离心机对细胞进行沉淀和重悬，以实现体积缩减和缓冲液置换。这些开放式操作成本较高（例如人力和洁净室维护），且生产能力有限，不适合商业化生产2,3。
已有研究提出，实施自动化是提高生产效率并实现商业化规模生产的解决方案2。基于细胞的产品无法通过生物制剂常用的传统方法（如γ射线辐照或终端过滤）实现无菌，因此需采用自动化封闭系统，以降低污染风险，并减少操作人员对洁净室维持无菌环境的依赖4。工艺自动化还可通过并行运行多个系统（横向扩展）或提升单个设备的处理能力（纵向扩展）来解决可扩展性问题，从而最大限度地减少操作人员之间的差异性。此外，对自体疗法的成本建模分析表明，自动化可能降低生产成本5,6。然而，在一项使用自动化生产平台的自体干细胞临床试验中，并未发现成本优势7，这表明自动化的成本效益可能取决于具体的生产工艺。
在现有生产工艺中引入自动化的策略有多种。这可以通过实施完全集成的平台或基于模块的加工链来实现。目前市面上已有多种用于自体细胞生产的完全集成化平台，例如 CliniMACS Prodigy（Miltenyi Biotec）、Cocoon（Octane Biotech）和 Quantum（Terumo BCT）。这些集成化平台常被称为“&#34;GMP-in-a-box&#34;”，对基础设施要求较低，且操作简便。然而，完全集成系统的生产能力可能受限于其配套的培养箱。例如，Prodigy 的培养容量受限于其 400 mL 培养腔8，而 Quantum 培养盒的表面积上限为 2.1 m2（相当于 120 个 T175 培养瓶）7，对于需要更高细胞剂量的患者而言可能不足9,10。此外，Prodigy 和 Quantum 均存在一个共同局限：在细胞扩增期间，操作单元被单一批次的细胞全程占用，从而限制了每个单元可生产的批次数量11。自动化的模块化方法则是构建由多个模块化单元组成的生产链，以模拟商业化生产工艺12,13。该方法将细胞培养装置与细胞清洗装置分离，从而可最大化生产效率。理想的加工设备应具备适应性和可扩展性，以满足不同的生产需求12。
逆流离心（CFC）技术始于20世纪70年代，在细胞处理领域已有悠久历史14。该技术通过平衡离心力与逆流力实现细胞的浓缩和分离。通常情况下，细胞悬液在恒定流速下从离心腔的狭窄端进入，同时受到离心力作用（图1A）。流体流动方向与离心力方向相反，这种力被称为逆流力，其在细胞腔内形成梯度。随着离心腔从锥形末端向宽端扩展，逆流力逐渐减小。密度较高、直径较大的细胞沉降速率更高，因此在靠近锥形细胞腔末端的位置达到受力平衡。较小的颗粒可能在腔体基部达到平衡，或因过小而无法在腔内滞留，最终被冲洗出去。CFC技术最广为人知的应用是血液分离产品的处理，例如用于树突状细胞治疗的单核细胞分离15,16。在缓冲液置换方面，CFC技术目前仅应用于大规模生产17，尚未用于自体细胞治疗的小规模生产。
为满足小规模细胞生产对合适设备的需求，近期开发了一种自动化的逆流离心装置（参见材料表）18。该自动化细胞处理装置采用逆流离心技术，可去除细胞碎片并实现缓冲液置换。该装置通过一次性使用的套件进行缓冲液置换，并可无菌连接至细胞转移袋，从而在无菌、封闭的系统中完成细胞处理。本文研究了在自动化操作流程中使用逆流离心装置对哺乳动物细胞培养物进行缓冲液置换的方法。在本研究中，我们分别采用Jurkat细胞和间充质基质细胞（MSCs）作为非贴壁型和贴壁型细胞的模型，测试了缓冲液置换方案。Jurkat细胞是一种永生化的T细胞，常用于急性T细胞白血病的研究19,20。MSCs是成体干细胞，已在针对多种疾病的中国台湾人体临床试验中得到广泛研究9。

<table><tbody><tr><td>20 ml 鲁尔锁式注射器</td><td>BD</td><td>302830</td><td></td></tr><tr><td>20% 人血清白蛋白（HSA）</td><td>CSL Behring</td><td>AUST R 46283</td><td></td></tr><tr><td>4-(二甲氨基)苯甲醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>156477-25g</td><td></td></tr><tr><td>500 ml 静脉输液盐水袋</td><td>Fresenius Kabi</td><td>K690521</td><td></td></tr><tr><td>抗生素-抗真菌剂</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15240112</td><td></td></tr><tr><td>自动细胞计数仪（Countess）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>细胞计数腔载玻片</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>细胞刺激混合液（500倍浓缩）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>00-4970-93</td><td></td></tr><tr><td>细胞转移袋</td><td>Terumo</td><td>T1BBT060CBB</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter AQueous 一步法细胞增殖检测试剂盒（MTS）</td><td>Promega</td><td>G3582</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>DMEM:F12 培养基</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11320082</td><td></td></tr><tr><td>EnVision 酶标仪</td><td>Perkin Elmer</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10099141</td><td></td></tr><tr><td>人白细胞介素 2（IL2）检测试剂盒</td><td>Perkin Elmer</td><td>Al221C</td><td></td></tr><tr><td>鲁尔接头（雌性）</td><td>CPC</td><td>LF41</td><td></td></tr><tr><td>PC 笔记本电脑或 PC 平板设备</td><td>ASUS</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>酶标仪（SpectraMax i3）</td><td>Molecular Device</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>重组人干扰素-&amp;gamma;</td><td>PeproTech</td><td>300-02</td><td></td></tr><tr><td>Rotea 逆流离心细胞处理装置</td><td>Scinogy</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Rotea 一次性使用处理套件</td><td>Scinogy</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 培养基</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11875119</td><td></td></tr><tr><td>手术剪刀</td><td>ProSciTech</td><td>420SS</td><td></td></tr><tr><td>三氯乙酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6399-250g</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝染液</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶消化酶（TrypLE Express 酶）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12604013</td><td></td></tr></tbody></table>

用于小规模细胞处理的自动逆流离心系统

Automated Counterflow Centrifugal System for Small-Scale Cell Processing

基因和细胞治疗产品的成功商业化需要具备成本效益且可放大的生产工艺。缓冲液置换和产物浓缩是大多数生产工艺中必不可少的环节。然而，在产品开发的早期阶段，这些步骤通常依赖手动操作。采用手动终端离心法进行缓冲液置换劳动强度大、成本高，且难以放大。封闭式自动化系统可有效消除这一繁琐步骤，但其实施往往面临挑战。本文介绍了一种新开发的细胞处理装置，适用于小到中等规模的细胞处理，旨在填补手动操作与大规模自动化之间的空白。通过调整流速和离心速度，该方案可轻松适用于多种细胞类型和工艺流程。与手动操作相比，本方案实现了更高的细胞回收率和更短的处理时间。经自动化处理回收的细胞仍保持其原有的增殖能力。该装置可作为封闭式生产工艺中的模块化组件，用于实现缓冲液置换、细胞制剂制备和冷冻保存等步骤。

在本方案中，我们采用Jurkat细胞和MSCs作为代表性示例，以演示自动化的缓冲液置换过程。在此过程中，Jurkat细胞和MSCs的处理步骤相同，仅在离心力和控制流速的泵速上有所差异（表1）。图2展示了摄像头拍摄到的流化细胞床在缓冲液置换过程中可能呈现的典型图像。通常情况下，流化细胞床的形态类似于图2A所示，细胞聚集在锥形腔室的中部及前部，腔室尖端留有少量空隙，此处无细胞聚集，且细胞加样入口的开口清晰可见。当引入黏度或密度不同的新缓冲液时，流化细胞床可能会被压缩（图2B）。在本方案中，洗涤步骤开始时，泵速从30–35 mL/min降低至20 mL/min；一旦腔室被新缓冲液充满，泵速即恢复至正常水平，以防止细胞在腔室尖端形成沉淀。较高的流速（图2C）可用于富集活细胞，...

自动化是细胞制造中扩大规模和成本管理的关键。本文描述了一种逆流离心细胞处理装置在小规模生物加工中用于自动完成缓冲液置换和细胞浓缩步骤的应用。

基因和细胞治疗产品的成功商业化需要具备成本效益且可放大的生产工艺。缓冲液置换和……

本方案为小规模细胞生产提供了封闭式自动缓冲液置换与浓缩的解决方案。重要的是，该缓冲液置换可实现高回收率，并递送极小体积的浓缩产物。新用户在遵循全部自动化步骤时可能会遇到困难。练习编程这些步骤，并使用培养基进行测试运行，是熟悉该设备的良好方法。在开始缓冲液置换之前，在II级层流罩中，使用注射器和针头组件从500毫升生理盐水袋中取出50毫升生理盐水溶液。用50毫升20%人血清白蛋白替代该体积，并从培养容器中收获目标细胞。计数后，使用注射器将细胞加载到转移袋中，并使用鲁尔锁扣将转移袋连接至一次性处理试剂盒。然后将先前准备好的洗涤缓冲液袋连接到一次性处理试剂盒。为设置自动缓冲液交换，在设备的图形用户界面中打开程序并点击启动按钮。单击“新建”以创建新方案，单击“控制”以选择需要打开和关闭的阀门、离心机和泵的转速、泵的运转方向以及动作触发条件。设置完所有参数后，单击“保存”。将连接好的相应袋体悬挂在设备上，并将一次性使用处理套件安装到机器上。然后点击连接按钮并下载已保存的程序。当播放按钮亮起时，表示该程序已准备就绪，可以开始运行。要执行自动缓冲液置换，请打开转移袋管路的手动夹具，然后点击开始以启动缓冲液置换程序。在自动化步骤六结束时，由于空袋中的空气触发了气泡传感器，流程将暂停。如果袋子确实已空，请按“下一步”以继续进入下一操作步骤。当自动化流程完成后，关闭所有管路夹，并打开设备的门。然后从设备上取下单次使用套件，并断开注射器，以便收集细胞用于后续分析。通常情况下，流化细胞层会呈现如此图所示的形态：细胞聚集在锥体中部及前部，腔室尖端处有一小段无细胞聚集的空隙，以及细胞加样入口内可见的开口。当引入黏度或密度不同的新缓冲液时，流化细胞层可能会被压缩。可通过施加高流速来筛选活细胞，因为死细胞体积更小、质量更轻，增加流速可将其强制冲出腔室。缓冲液置换的自动化处理时间比手动缓冲液置换更短。在本分析中，手动和自动化处理过程对所测试的两种细胞的回收率相似，且任一过程均未影响细胞活力。回收的细胞表现出相似的增殖速率、细胞因子产生能力以及免疫活性，且不受处理方式的影响。需要注意的是，本方案仅作为指导性规程，因此使用者应根据自身细胞类型和缓冲液条件设置流速和离心速度。缓冲液置换是细胞制备过程中的一个中间步骤，可能在细胞培养扩增或冷冻保存与制剂之后进行。目标是开发出将整个过程封闭起来的方法。逆流离心是一种非常通用的平台。未来的研究将探索其在细胞筛选中的应用，例如从绒毛膜产物中去除死细胞以及分离单核细胞。

automated-counterflow-centrifugal-system-for-small-scale-cell

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

用于小型细胞处理的自动逆流离心系统

我们开发了一种用于微尺度细胞刺激实验的自动化细胞培养与检测平台。该平台在培养和刺激少量细胞群体以及回收裂解液用于分子分析方面，具有操作简便、功能多样和控制精确的优点。该平台非常适合使用珍贵细胞和/或试剂的研究。...

一种用于微尺度细胞刺激实验的多功能自动化平台

本方案描述了一种利用微流控装置实现小体积（0.15–1.5...

用于精确小体积样品处理的微流控平台及其在声学微装置中按尺寸分离生物颗粒的应用

本文介绍了一种利用微流控平台分离和培养单细胞的实验方案，该平台采用了一种新型的微孔设计概念，可实现高效的单细胞分离和长期克隆培养。...

一种用于高通量单细胞分离与培养的微流控平台

本方案描述了一种基于惯性微流控的缓冲液置换策略，用于纯化经微/纳米颗粒工程化的细胞，并高效去除未结合的颗粒。...

用于无干扰微/纳米颗粒细胞工程的微流控缓冲液置换

本方案描述了使用离心淘析法将原代急性淋巴细胞白血病细胞按不同细胞周期时相进行分离的方法。...

通过离心淘析法分离处于不同细胞周期阶段的原代急性淋巴细胞白血病细胞

本文介绍了一种构建和操作低成本、多通道灌注细胞培养系统的方法，用于测量细胞过程中溶质分泌和吸收速率的动力学变化。该系统还可使细胞暴露于动态刺激条件下。...

集成出口分流功能的多通道灌注生物反应器用于动态细胞培养

本方案通过优化空气喷雾喷嘴尺寸、鞘液压力、样品流压力、电压、增益和触发阈值等参数，提供了一种快速且基于尺寸特异性的外泌体小细胞外囊泡分离方法。...

优化流式细胞分选参数以实现小细胞外囊泡的高通量分离与纯化

本文介绍了一种利用逆流离心系统以封闭式半自动化方式从多层培养瓶中收获贴壁细胞的实验方案。通过少量修改现有步骤，该方案也可适用于从其他细胞扩增平台收获贴壁细胞和悬浮细胞。...

用于临床应用的封闭式半自动化人源间充质干细胞制备流程

细胞外囊泡在生物医学应用中具有巨大潜力，但目前的分离方法耗时较长，且难以适用于临床。在本研究中，我们介绍了一种微流控装置，可对大量生物流体进行连续、步骤极少的细胞外囊泡直接分离。...

利用分流式A4F微流控芯片单步分离大体积样品中的细胞外囊泡

本方案介绍了一种经济高效、可加速质粒DNA提取的方法。通过使用与标准摆动桶式板转子兼容的定制3D打印支架，研究人员可同时处理多达48个带盖离心柱或多达116个无盖离心柱，与手动微型离心法相比，显著缩短了操作时间。...

使用24孔板的中通量柱法DNA提取

了解用于小型细胞制造的自动化逆流离心缓冲交换与浓缩技术。该方法实现高回收率和小体积浓缩产物，为细胞制造提供高效可靠的封闭式处理方案。

用于小规模细胞处理的自动逆流离心系统

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