使用Confetti小鼠进行克隆遗传示踪以研究矿化组织

通过使用荧光蛋白对单个细胞进行遗传标记并随时间追踪这些细胞，Confetti 小鼠模型使研究人员能够揭示多种生物过程的新见解。我们的实验方案最大限度地缩短了组织采集与成像之间的延迟时间，可应用于任何矿化或非矿化组织，并且能够将荧光信号保存数年。只要存在合适的 Cre 品系，该方法即可用于不同的细胞群体，研究其命运及动力学特征，因此在再生医学和发育生物学的各个领域均具有重要应用价值。

我们的分步说明将演示如何区分不同荧光蛋白发出的荧光信号，这是最具挑战性的步骤。首先准备用于成像的小鼠组织。对于软组织以及45天龄以内小鼠的矿化胫骨和股骨，将组织置于预冷的3.7%甲醛PBS溶液中固定，并在4摄氏度下于旋转仪上轻轻滚动孵育六小时。

对于45天龄以上小鼠的胫骨和股骨等矿化组织，用氢氧化钠将1升10% EDTA溶液的pH值调节至8.05，并用该溶液将甲醛稀释至3.7%。将组织置于3.7%甲醛PBS溶液中，在4摄氏度下固定过夜。次日，将组织转移至预冷的甲醛-EDTA溶液中，在4摄氏度下旋转孵育48小时，并确保在孵育期间更换溶液三次。

然后将组织放入预冷的30%蔗糖溶液中，确保容器完全装满，并在4°C下轻轻旋转过夜。次日早晨，用镊子将组织从蔗糖溶液中取出，在5毫升的最佳切割温度化合物（OCT）中冲洗数秒钟。用预先标记好的冷冻模具装满OCT，迅速将组织置于模具底部，操作过程要快速，避免样品在室温下放置过久。

将模具置于干冰上，使OCT包埋剂凝固，从而固定样本。若样本不立即使用，可于-20°C保存。从模具中取出组织块。

在样本块顶部与样品台之间涂抹OCT包埋剂，并在冷冻切片机中冷却至少五分钟，或直至OCT完全凝固。将样本架和刀片架预冷至零下20摄氏度，然后将样本放入样品台夹持器中，将刀片放入刀片夹持器中，并静置数分钟使其达到温度平衡。对于出生后生长板的分析，制备厚度为30至160微米的切片。

使用冷冻切片机修整组织块，并将组织切片切成合适的厚度，然后将切片收集到载玻片上。随后在室温下将载玻片空气干燥，直至完全干燥，并于-20摄氏度保存，最长可保存36个月。当准备使用载玻片时，将其从冷冻箱中取出，并在载玻片架中恢复至室温。

为了去除OCT，使用巴斯德吸管将PBS轻轻滴加到载玻片上。对于160微米厚的切片，将载玻片孵育15分钟，吸去液体后更换新鲜PBS，再继续孵育5分钟。在室温下，将载玻片置于75%硫代二乙醇溶液中，并用长度为60毫米的盖玻片封片。

首先，在通道选项卡中点击选择RFP通道，这将导致该通道的详细信息显示在光路选项卡中。然后勾选T-PMT旁边的复选框。将载玻片放入载玻片 holder 中，并将目标组织直接置于光路与物镜之间。

为了定位组织，取消选择通道选项卡中“轨道”标题下的 YFP 和 CFP 复选框。在“轨道”标题下选择 T-PMT 通道，然后点击采集选项卡中的“实时”按钮，并增加 T-PMT 通道的增益，以便在屏幕上观察到组织的选择区域。调整载玻片的位置以定位目标区域，并使用显微镜相应的调焦旋钮进行聚焦。

然后在采集选项卡中点击停止，以关闭激光曝光。根据文稿说明设置成像参数，并在必要时调整针孔大小。检查设置，确保记录的信号不发生重叠，然后在通道选项卡中选择所有三个通道，按下拍摄按钮。

在结果图像中，通过点击“维度”选项卡中每个通道上方的蓝色高亮框来切换显示通道，并在屏幕上手动检查各通道之间的信号重叠情况。如果信号存在重叠，请重新调整参数，直至各信号能够彼此区分。本实验方案用于标记骺板软骨中的软骨细胞，并可视化其随年龄增长的克隆扩增过程。

通过观察交叉韧带和近端胫骨生长板中的克隆，确定了中央区域，并对这些克隆进行了成像。在给予他莫昔芬后，表达Col2阳性并被Confetti荧光蛋白标记的单个细胞经历了克隆扩增，并随后保留在生长板中。荧光信号可在长期保存后仍被观察到。

部分切片在制备和成像前已储存超过三年。三维重建通过图像分析软件自动完成，并导出为视频。其中一片在冷冻切片过程中发生断裂，其上存在重组水平极高的区域，将阻碍克隆分析，这体现了本实验方案中常见的问题之一。

根据您的研究问题，使用能够特异性标记目标细胞的Cre品系可能非常重要。因此，我们建议在重组完成后尽快检测这些细胞的荧光信号。使用可诱导型Cre品系至关重要，因为在非诱导型Cre品系中持续发生的DNA重组可能会改变被标记细胞的荧光特征，从而阻碍克隆分析。

该方案可与功能干扰方法结合使用，例如基因操作菌株、药物处理、手术干预，以及制备切片的免疫荧光染色。