Name: 使用纸屑小鼠研究矿化组织的克隆遗传追踪 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-23T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 41 s
Description: 了解使用R26R-Confetti小鼠模型对矿化组织进行克隆遗传追踪的完整实验方案。该方法通过荧光蛋白标记单个细胞，实现软骨细胞长期可视化追踪，适用于再生医学与发育生物学研究。

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感谢 Evgeny Ivashkin 博士提供的方法学建议。本工作获得了瑞典研究理事会（A.S.C.）、俄罗斯科学基金会（项目号 #19-15-00241，授予 A.S.C.）、卡罗林斯卡学院（A.S.C.）、卡罗林斯卡学院战略再生项目（StratRegen KI）和古斯塔夫五世国王八十周年基金会（Stiftelsen Konung Gustaf V:s 80-årsfond）（A.S.C.）、共济会儿童之家基金会（Stiftelsen Frimurare Barnhuset）和儿童护理协会（Sallskapet Barnavard）（P.T.N.）、中国国家留学基金管理委员会（B.Z.）的资助。共聚焦显微镜由克努特和爱丽丝·瓦伦贝里基金会资助购置。

所有小鼠实验均经动物实验伦理委员会（斯德哥尔摩北部委员会/北动物伦理审查委员会）批准，并依照瑞典动物管理局关于动物实验的规定与指南进行。
1. 小鼠繁殖
<ol>
	<li>为构建该品系，将 R26R-Confetti 小鼠与目标 Cre 小鼠品系进行杂交。在仔鼠21日龄时断奶。 
	注意：小鼠通常自约8周龄起可用于繁殖，或根据当地指南执行。可在断奶时采集组织样本进行基因型鉴定（本文未描述具体方法）。断奶时间可根据当地指南适当调整。</li>
</ol>
2. 五彩标记
注意：该标记策略适用于他莫昔芬诱导型 Cre 品系。
<ol>
	<li>在玻璃瓶中配制浓度最高为 2.5 mg/mL 的他莫昔芬玉米油溶液。将溶液置于 37 °C 烤箱中加热最多 60 分钟，并每隔 5 分钟使用涡旋振荡器振荡，直至粉末完全溶解。 
	注意：若需提高他莫昔芬剂量，可采用此方法配制浓度最高达 20 mg/mL 的溶液。</li>
	<li>避光，4 °C 条件下保存，最长可保存 3 个月。</li>
	<li>于出生后第一天（P1）通过腹腔注射 50 µL 浓度为 2.5 mg/mL 的他莫昔芬玉米油溶液，以诱导重组。 
	注意：原则上，他莫昔芬可在任何年龄给予，最早可至 F1 代。他莫昔芬的剂量应根据 Cre 表达水平、小鼠年龄及实验用途进行调整。更多相关信息请参见讨论部分。经相同处理的 Cre 阴性小鼠可作为 Confetti 荧光信号的阴性对照。 
	警告：务必提醒动物操作人员注意他莫昔芬的使用，并确保按照当地环境与安全指南处置笼具材料。</li>
</ol>
3. 组织采集
<ol>
	<li>在出生后第27天（P27），通过逐渐向容纳小鼠的空间中充入二氧化碳，使其体积浓度至少达到80%，并维持该浓度3分钟，以实施安乐死。随后进行颈椎脱位。在解剖其他动物期间，将小鼠置于冰上保存。</li>
	<li>解剖出目标组织。以下为采集近端胫骨和远端股骨生长板以及膝关节关节软骨的方案，适用于出生后6个月以内的小鼠。
	<ol>
		<li>使用锋利的剪刀和有齿镊子，将后肢周围的皮肤从足部开始去除。</li>
		<li>用锋利的剪刀粗略修剪腿部的肌肉和脂肪组织。 
		注意：无需将骨骼彻底清理干净，因为周围组织在切片时可提供一定的结构支撑，但需确保完全去除皮肤。</li>
		<li>使用解剖刀，在腿部顶端与身体连接处切开软组织，直至可见股骨头，然后切断髋关节内的韧带以取下整条腿。 
		注意：若无法找到股骨头，可改用强力剪刀在靠近髋部的位置剪断股骨。</li>
		<li>使用解剖刀或锋利的剪刀将足部从腿部其余部分分离。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 组织固定与处理
注意：根据感兴趣的组织类型，采用下述两种方案之一（4.1 节适用于软组织，4.2 节适用于约 45 天龄以上的矿化小鼠组织，具体如下所述）。两种方法均需在解剖其余动物时，将已解剖的样品置于冰上的 3.7% 甲醛/磷酸盐缓冲液（PBS）溶液中保存。
<ol>
	<li>对于约 P45 年龄以内的软组织以及矿化胫骨和股骨，将组织置于预冷的 3.7% 甲醛/PBS 中固定 6 小时，在 4 °C 下于旋转仪上轻柔滚动。使用的液体体积至少应为组织体积的 10 倍。随后直接进入步骤 4.3。</li>
	<li>对于矿化组织（包括约 P45 年龄以上的胫骨和股骨），需要进行脱钙步骤。
	<ol>
		<li>配制 1 L 的 10% EDTA/dH2O 溶液，用氢氧化钠调节 pH 至 8.05。然后用此溶液将甲醛稀释至 3.7%。EDTA 的工作浓度为 9%。</li>
		<li>将组织放入预冷的 3.7% 甲醛/PBS 中过夜固定，在 4 °C 下于旋转仪上轻柔滚动。</li>
		<li>将组织转移至预冷的 3.7% 甲醛/9% EDTA/dH2O 溶液（pH 8.05）中，在 4 °C 下以至少为组织体积 10 倍的液体体积轻柔旋转。在接下来的 48 小时内，更换新鲜的预冷 3.7% 甲醛/9% EDTA/dH2O 溶液，重复此步骤 3 次。 
		注意：此短期脱钙足以对小鼠年龄不超过 6 个月的股骨和胫骨进行切片。对于矿化程度更高的组织，可能需要进一步脱钙以改善组织学切片质量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将组织转移至预冷的 30% 蔗糖/dH2O 溶液中。确保容器完全装满，并在 4 °C 下轻柔旋转过夜。使用的液体体积至少应为组织体积的 10 倍。组织刚放入该溶液时常会漂浮，至次日早晨通常会沉至瓶底。</li>
	<li>为去除残留的蔗糖溶液，用镊子将组织从蔗糖溶液中取出，短暂清洗，并用约 5 ml 的最佳切割温度化合物（OCT）完全覆盖样本数秒钟。</li>
	<li>在预先标记的冷冻模具中填充 OCT，并将组织置于底部。操作需迅速，以避免样本在室温下放置过久。 
	注意：应将样本以利于切片的方向放置。为了在使用 Col2CreERT:Confetti 示踪后提高切到完整生长板细胞列的概率，可参考股骨头方向，使内侧朝下，并尽可能使样本平放于模具底部。</li>
	<li>将模具置于干冰上，使 OCT 完全固化，从而完成样本包埋。应尽可能将冷冻模具平放，以防止组织在模具内移动或滑动。完成后，若不立即使用，应将样本储存于 -20 °C。 
	注意：建议在 12 周内使用，因为随着时间推移，包埋块会变得越来越难切片。</li>
</ol>
5. 切片
注意：使用适合硬组织的冷冻切片机和一次性刀片进行冷冻切片。任何标准的冷冻切片机均可使用。
<ol>
	<li>将组织块从模具中取出，并在组织块顶部与卡盘之间涂抹OCT，然后置于-20 °C冷冻切片机中冷却至少5分钟，直至OCT完全凝固，以固定组织块。</li>
	<li>预先将样本架和刀片架冷却至-20 °C，随后将带有样本的卡盘放入卡盘架，刀片放入刀片架，平衡数分钟。 
	注意：具体温度可根据所用冷冻切片机型号及目标组织类型在数度范围内调整。</li>
	<li>使用冷冻切片机修整组织块，并切取适当厚度的组织切片，以便在目标组织中观察克隆结构。
	<ol>
		<li>对于出生后生长板的分析，制备30−160 µm厚度的切片，并将其收集于载玻片上。某些型号的冷冻切片机可能仅在修整模式下支持厚切片的收集。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在室温下将载玻片自然风干，直至完全干燥。 
	注意：此步骤所需时间取决于组织特性及切片厚度，室温也会影响干燥速度。</li>
	<li>将载玻片在-20 °C条件下保存，最长可保存36个月；若立即进行后续处理，则进入步骤6.2。</li>
</ol>
6. 载玻片制备与封片
<ol>
	<li>从冷冻箱中取出载玻片，使用载玻片架水平放置至室温。待任何冷凝水蒸发完毕。</li>
	<li>使用巴斯德吸管将室温的磷酸盐缓冲液（PBS）轻轻滴加到载玻片上以去除OCT包埋剂。切片越厚，所需时间越长。对于160 µm厚的切片，进行两次洗涤：先孵育15分钟并吸去液体，再加入新鲜PBS孵育5分钟，随后吸去液体。 
	注意：此步骤旨在去除OCT包埋剂，可根据组织特性及切片厚度适当调整。室温可能影响该步骤的进行速度。</li>
	<li>将载玻片置于含75% 2,2-硫代二乙醇/dH2O的溶液中，室温下用60 mm长的盖玻片封片。 
	注意：载玻片可在成像前立即制备，若避光保存于4 °C的湿盒中，荧光信号可稳定维持1−2周。</li>
</ol>
7. 共聚焦显微镜成像
<ol>
	<li>设置显微镜。
	<ol>
		<li>打开显微镜并启动软件，点击 Start System 按钮。</li>
		<li>在 Acquisition 选项卡下，首先点击 Smart Setup，然后在 Dye 标题下选择对应于红色荧光蛋白（RFP）、黄色荧光蛋白（YFP）和青色荧光蛋白（CFP）的三个通道。点击 Best signal，然后点击 Apply 以选择相应的激光器。 
		注意： Acquisition 选项卡中的内容见 Supplementary file 1A。如果所需通道不存在，请使用 Dye 标题下的“+”按钮添加。三种Confetti荧光蛋白所对应的激光器、激发波长以及记录的发射波长范围信息见 Supplementary file 1B-D。</li>
		<li>在 Acquisition Mode 选项卡的 Objective 标题下选择20倍物镜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>定位生长板或其他感兴趣的组织。
	<ol>
		<li>为获得清晰视野，首先在 Channels 选项卡中点击RFP通道的名称以选中该通道，此时RFP通道的详细信息将显示在 Light Path 选项卡中。勾选 T-PMT 旁边的复选框。 
		注意：T-PMT通道显示的是非反射的激光光，用于观察组织中非荧光部分的结构。</li>
		<li>将载玻片放入载物台夹持器中，并将生长板或其他感兴趣的组织精确置于光路与物镜之间。</li>
		<li>为简化组织定位，在 Channels 选项卡的 Tracks 标题下取消勾选YFP和CFP通道。</li>
		<li>在 Tracks 标题下点击T-PMT通道的名称以选中该通道。在 Acquisition 选项卡中点击 Live，并提高T-PMT通道的 Gain (Master)，以便在屏幕上以灰度图像显示组织切片。</li>
		<li>使用操纵杆移动载玻片位置以定位感兴趣区域，然后使用显微镜相应的调焦旋钮进行聚焦。</li>
		<li>在 Acquisition 选项卡中点击 Stop 以关闭激光曝光。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>定义成像参数。
	<ol>
		<li>在 Channels 选项卡中使用复选框选择一个通道，然后在 Acquisition 选项卡中点击 Live，在屏幕上显示该通道的图像。接着使用鼠标左键调节滑动条，设置所采集荧光信号的发射范围、Lasers 标题下的激光功率、Channels 选项卡中的 Gain (Master) 和 Digital Offset，以便在屏幕上清晰显示Confetti标记的细胞。RFP、YFP和CFP各通道的参考参数值见 Supplementary file 1B-D。请逐一完成每个通道的此步骤。 
		注意：为确保所观察到的信号非自发荧光，可在此步骤中使用Cre阴性动物的组织切片作为阴性对照。由于T-PMT已与RFP激光器结合（步骤7.2.1），调节RFP的激光功率将影响T-PMT信号。</li>
		<li>根据需要调整 Pinhole 大小以增强荧光检测。 
		注意：针孔越大，在Z方向上检测到的荧光信号越多。一个参考指标是艾里单位（AU），该数值会自动显示在 Pinhole 指示器下方，其中1 AU为成像质量的最佳值。若AU过大，将影响后续分析，因为Z方向上单个细胞的区分将变得更加困难。</li>
		<li>检查设置，确保所记录的信号不发生重叠。
		<ol>
			<li>在 Channels 选项卡中勾选所有三个通道的复选框，然后在 Acquisition 选项卡中点击 Snap 按钮。</li>
			<li>在生成的图像中，通过点击 Dimensions 选项卡中每个列出的 Channel 上方的蓝色高亮框来切换查看各通道图像。手动检查屏幕上各通道之间是否存在信号重叠。如果信号重叠（例如，每个红色细胞也呈黄色），则返回步骤7.3的起始位置并重复操作，调整重叠通道的参数，直至各通道信号可被清晰区分。确保每种标记（即RFP、YFP或CFP）至少有一个仅表达单一标记的克隆可被观察到。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>采集图像。
	<ol>
		<li>选择 Acquisition Mode 选项卡，通过设置 Frame Size、Speed 和 Averaging Number 值来指定图像质量。 
		注意：这些实验的典型设置见 Supplementary file 1A。在 Acquisition 选项卡的 Scan Area 标题下减小 Zoom 值，可在不改变图像采集时间的前提下扩大视野。</li>
		<li>在 Acquisition 选项卡的 Dimensional Acquisition 标题下，勾选 Z-Stack 复选框。打开 Z-stack 选项卡，将Z方向上各图像之间的 interval 设置为2.5 µm。</li>
		<li>为设置正确位置，在 Channels 选项卡中仅选择RFP/T-PMT，点击 Live 以在具有组织轮廓可见的情况下观察红色克隆。通过在相应层面点击 Set First 和 Set Last 来设定首层和末层，并使用显微镜旋钮调节焦距。</li>
		<li>在 Acquisition 选项卡中点击 Tile Scan 选项卡，并在相应的输入框中输入水平和垂直方向的总拼图数量。</li>
		<li>进行图像采集时，在 Channels 选项卡中选择所有目标通道，然后点击 Snap 按钮采集单幅图像，或点击 Start Experiment 按钮采集 Z stack/Tile scan 图像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>图像采集完成后，点击 File，然后点击 Save As，将图像保存为能尽可能保留显微镜设置信息的文件格式，以便后续复查和再利用。</li>
	<li>使用图像分析软件进行进一步分析。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

Confetti 模型被广泛用于研究矿化软骨组织12,13,14，并用于描述优化后的实验方案。携带一份或两份 R26R-Confetti 等位基因的 Confetti 小鼠2均可用于繁育和实验。在携带一份 Brainbow 2.1 构建体等位基因的小鼠中，重组可产生四种潜在标记：红色荧光蛋白（RFP，细胞质定位）、黄色荧光蛋白（YFP，细胞质定位）、青色荧光蛋白（CFP，膜定位）和绿色荧光蛋白（GFP，核定位）；而在纯合型 Confetti 小鼠（即含有两份 Brainbow 2.1 构建体）中，重组则可产生十种可能的颜色组合（RFP+RFP、RFP+YFP、RFP+CFP、RFP+GFP、YFP+YFP、YFP+CFP、YFP+GFP、CFP+CFP、CFP+GFP、GFP+GFP）。然而，由于 DNA 切除和倒位事件以随机方式发生，如先前报道所述2，仅在少数细胞中发生产生 GFP 的重组，且似乎因细胞类型或所使用的 Cre 品系而异2,12,13。因此，鉴于导致 GFP 表达的重组事件发生频率较低，在纯合型 Confetti 小鼠中最常见的为六种颜色输出。
在使用彩虹小鼠（Confetti mouse）设计实验时，一个重要的考虑因素是选择合适的Cre品系。首先，由于彩虹等位基因含有多个loxP位点，一次重组事件并不能排除发生第二次重组的可能性4。这意味着，如果一个细胞被标记并分裂产生单一颜色的克隆，其子代细胞中若发生第二次重组事件，则会产生不同的颜色，从而掩盖真实的克隆扩增情况。因此，不建议使用非诱导型Cre品系，因为在这类品系中，只要相应启动子具有活性，Cre酶就持续表达。其次，在某些品系中，Cre重组酶的表达常常以牺牲内源性蛋白的表达为代价，从而自身产生表型效应（例如Prg4-GFPCreERT2基因敲入小鼠品系，该品系小鼠携带两个Cre等位基因15），因此理想情况是仅保留单拷贝的Cre等位基因。在所有上述描述的实验中，均通过父本或母本之一携带单拷贝的Col2CreERT16，以获得Col2CreERT:Confetti小鼠，具体方法如前所述13。接下来，Cre品系对目标细胞类型的特异性也是一个重要考量因素。例如，Col2CreERT具有软骨细胞特异性，但在出生后早期软骨组织中会标记出多种不同的软骨细胞群体17。最后，不同Cre品系的活性会随着动物年龄的变化而显著改变，这是因为驱动Cre表达的内源性启动子活性本身会发生变化，即使在同一类型的细胞中也是如此（例如Prg4-GFPCreERT2，随着小鼠年龄增长，标记浅层区细胞可能需要越来越多的他莫昔芬给药剂量15）。
标记细胞的数量取决于给予的他莫昔芬剂量，因此并非总是希望给予最大剂量，因为不同克隆之间可能难以区分。由于Cre的表达水平受不同启动子调控以及年龄的影响，需要调整他莫昔芬的剂量以优化标记效果。需要注意的是，在诱导重组后细胞并不会立即产生荧光，因为重组的发生以及荧光蛋白的积累达到可成像水平需要一定时间。所需时间范围较广（24−72小时），且似乎受到Cre品系、细胞类型和动物年龄的影响。由于他莫昔芬在给药后可能长时间保持生物活性18，因此始终建议在每种模型中彻底检测重组效率。
在共聚焦显微镜步骤中，激发Confetti荧光蛋白需要激光穿透组织。由于不同组织具有不同的特性，激光可能无法穿透所有组织的160 µm厚切片。然而，对于生长板软骨等组织（如图2和图3中所用），此类较厚切片仍可使用。请注意，每台显微镜的性能均有所不同，因此所描述的设置参数（补充文件1）很可能需要进行微调才能获得理想效果。其中一个主要挑战是区分不同的荧光蛋白，以确保各检测通道之间无信号串扰。例如，GFP发出的荧光可能导致YFP通道出现信号，YFP与RFP通道之间也存在光谱重叠。YFP与CFP通道也必须仔细检查是否存在串扰。这一问题可通过多种方式解决。首先，可收窄每种荧光蛋白所记录的荧光发射波长范围。其次，通过调节激光功率并结合数字增益设置，可优化信号强度。在本研究中，上述步骤已足够有效，但其前提是具备较强的荧光信号。这意味着理论上，组织处理效率低下可能会降低荧光蛋白的活性，或较弱的激光光源可能影响通道间的有效分离。
Confetti 小鼠的一个优势在于，它可以与大量现有的基因突变品系相结合，从而研究特定基因对克隆动态的影响10,11,12,13,14,19,20，尽管存在一些局限性。例如，在将基于 Cre-loxP 的突变体与克隆谱系示踪技术结合使用时，Confetti 等位基因与目标基因的重组事件无法被区分开来。然而，这种同时发生的重组事件仍可能是有效的10,14,20。例如，该策略已被用于探索出生后在生长板中特异性敲除软骨细胞 TSC1 后，小鼠静息区细胞数量的增加21，并揭示了这些细胞随时间推移的克隆关系13。此外，使用 Confetti 小鼠进行组织特异性的克隆分析也可与非 Cre-loxP 系统的突变小鼠结合使用11，并且还可以将这些方法与药理学8,9,13 和/或手术模型8 相结合，以可视化克隆对其他功能扰动的响应。当将 Confetti 标记的组织切片与免疫荧光法检测内源性蛋白相结合时，会带来进一步的研究机会。此类分析可识别被示踪的细胞，并确定其与已知标记物的共定位情况。根据本文所述的固定方法，可以在进行免疫荧光染色的同时，仍保持 Confetti 荧光蛋白的荧光信号可见12,13。然而，在上述文献中并未涉及抗原修复步骤。强烈的抗原修复方法（如在柠檬酸缓冲液中煮沸）会导致 Confetti 荧光完全丧失。尽管此时仍可通过抗体检测 Confetti 荧光蛋白22，但可能发生克隆身份信息的丢失。
综上所述，利用Confetti模型在体内标记细胞是一种有效的工具，可用于分析这些细胞随时间推移的命运。该方法提供了一种快速且高效的方式，以直接观察矿化组织中荧光蛋白的表达。

改进的细胞行为监测方法有助于提高使用动物模型时的实验效率。体内监测细胞行为最具信息量的方法之一是利用多色报告基因小鼠品系进行克隆谱系示踪1，其中包括广泛使用的R26R-Confetti（Confetti）小鼠2。通过基因标记单个细胞的荧光蛋白并随时间追踪这些细胞，许多研究领域的科研人员已利用Confetti小鼠揭示了多种不同生物系统的深层机制。
Confetti 小鼠是一种基于 loxP 的报告系统，其中 Cre 依赖的 DNA 重组以随机方式导致数种可能的荧光蛋白之一被永久表达2。R26R-Confetti 等位基因包含普遍表达的 CAGG 启动子，该启动子位于一个两侧为 loxP 位点的 NeoR-cassette2 的上游，其 polyadenylation 序列可终止转录3，其后为 Brainbow 2.1 构建体4。因此，Cre 介导的重组可同时切除 NeoR-cassette，并根据 Brainbow 2.1 构建体中哪些部分被切除，产生特定的荧光蛋白。这一特性使 Confetti 小鼠具有极强的适应性，因为只要存在特异性的 Cre 品系，即可用于靶向小鼠中任意细胞群体。将组织特异性 Cre 品系与 R26R-Confetti 品系杂交，可实现标记的特异性。然而，该 Cre 品系还应具备可诱导性（例如 CreERT 或 CreERT2，其需与他莫昔芬结合后方可进入细胞核并诱导 DNA 重组5），以便在指定时间点实现标记。因此，可通过在目标时间点向获得的 CreERT 阳性/Confetti 阳性后代注射他莫昔芬来标记特定细胞群体，并追踪至特定年龄，随后收集目标组织进行分析。组织处理后，可通过共聚焦显微镜直接观察荧光标记的细胞，根据不同细胞所携带的特异性荧光标记，将每个初始标记细胞的子代与其他标记细胞产生的子代区分开来，从而评估克隆性（即克隆遗传谱系示踪）。
由于Confetti模型具有高度灵活性，已被广泛应用于研究多种不同组织在健康与疾病状态下的发育与维持过程2,6,7,8,9,10,11。使用该模型的一种常见方法是标记特定的细胞群体，并确定这些细胞（和/或其子代）对哪些组织做出了贡献。通过这种方法获得的一项发现是，成体牙齿由具有胶质细胞来源的细胞构成6。该模型的另一项应用是研究干细胞稳态。例如，Confetti模型揭示了肠道隐窝中的干细胞微环境会逐渐演变为单克隆性，这是因为在干细胞之间的竞争过程中某些干细胞克隆占据主导地位2。该模型还可用于评估细胞增殖，尤其适用于研究分裂缓慢的细胞。例如，已有研究评估了关节软骨中的克隆形成12，并探讨了 Hedgehog 拮抗剂对五周龄小鼠生长板软骨细胞的短期作用13。
尽管Confetti模型相对简单，但在图像采集前技术上难以完整保留其荧光信号，尤其是在分析矿化组织时。本方案描述了一种优化的方法，用于在出生后骨骼（最长至6月龄）中使用Confetti小鼠，使荧光蛋白无需免疫检测即可通过共聚焦显微镜直接观察。该简化方案也可应用于非矿化组织。此外，文中还介绍了如何储存样品，以长期（至少3年）保持荧光信号。本方案的流程概述见图1。

<table><tbody><tr><td>2,2-硫代二乙醇</td><td>Sigma</td><td>MKCF9328</td><td></td></tr><tr><td>60 mm 长盖玻片</td><td>Mendel-Gl&amp;auml;zer</td><td>220588</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦激光扫描显微镜</td><td>Zeiss</td><td>LSM 710</td><td></td></tr><tr><td>玉米油</td><td>Sigma</td><td>C8267</td><td></td></tr><tr><td>冷冻模具（标准型）</td><td>Sakura</td><td>4557</td><td></td></tr><tr><td>冷冻切片机</td><td>Thermo</td><td>型号：NX70</td><td></td></tr><tr><td>一次性冷冻切片刀片</td><td>Histolab</td><td>207500014</td><td>专用于硬组织切片</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Scharlan</td><td>AC0960005P</td><td></td></tr><tr><td>甲醛浓缩液</td><td>Merck</td><td>8.18708.1000</td><td></td></tr><tr><td>玻璃瓶</td><td>Sigma</td><td>V7130</td><td>可用于他莫昔芬稀释以及组织固定和处理</td></tr><tr><td>Imaris 软件</td><td>Oxford Instruments</td><td>N/A</td><td>用于三维重建的图像分析软件</td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Zoetis</td><td>11-8162</td><td></td></tr><tr><td>OCT 包埋剂</td><td>Sakura</td><td>102094-104</td><td></td></tr><tr><td>巴斯德吸管</td><td>Sarstedt</td><td>86.1171</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14200075</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Merck</td><td>1.06498.1000</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost UltraPlus 载玻片</td><td>Mendel-Gl&amp;auml;zer</td><td>J3800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>他莫昔芬</td><td>Sigma</td><td>T5648</td><td></td></tr><tr><td>Zen2 软件</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td>共聚焦激光扫描显微镜免费软件</td></tr></tbody></table>

使用confetti小鼠进行克隆遗传示踪以研究矿化组织

Clonal Genetic Tracing using the Confetti Mouse to Study Mineralized Tissues

对体内单个细胞进行标记，以监测其可分化成哪些细胞类型、追踪其在生物体内的迁移路径或确定其寿命，是揭示组织发育与维持机制的有力方法。目前可用于体内细胞监测的最重要工具之一是Confetti小鼠模型。该模型可通过克隆遗传示踪（亦称克隆谱系示踪）过程，在活体小鼠中以细胞类型特异性的方式，利用多种荧光蛋白对单个细胞进行遗传标记，并长期监测这些细胞及其子代细胞的命运。该模型问世近十年来，已显著促进了人们对多种生物学过程的理解，尤其在干细胞生物学、发育过程以及成体组织更新等领域贡献突出。然而，将荧光信号完整保存至成像阶段，并同时捕获多种荧光信号，在技术上仍具挑战性，尤其是在矿化组织中更为困难。本文介绍了一套使用Confetti模型分析生长板软骨的逐步实验方案，该方案可推广应用于任何矿化或非矿化组织。

为了标记骨骺软骨中的软骨细胞，并通过在出生后第1天（P1）给予他莫昔芬来可视化其随年龄增长的克隆扩增，研究人员对Col2CreERT:Confetti小鼠进行了标记，并在出生后第27天（P27）采集其后肢。通过观察交叉韧带确定中央切片位置（图2A），并观察胫骨近端生长板中的克隆（图2B）。这些数据表明，在P1时Col2阳性并因给予他莫昔芬而被标记上Confetti荧光蛋白的单个细胞，经历了克隆扩增，并持续保留在生长板中直至P27。从相似发育时间点开始的克隆扩增早期变化可参见近期一篇出版物中的图113。
为了说明长期储存后的荧光信号（步骤5.5），该切片在采集后立即储存（见图2A,B），超过3年后再进行制备和成像（图2C，视频1）。
为了说明该实验方案中一些常见的问题，图3A展示了在冷冻切片步骤中发生断裂的组织切片。图3B中放大显示了切片的特定区域（位于生长板与关节软骨之间），表明该剂量的他莫昔芬在此区域诱导了极高水平的重组，从而无法进行克隆分析。
<img alt="小鼠组织成像流程；详细说明共聚焦显微镜步骤及温度储存的示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60424/60424fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：实验概览。 流程图总结了该方法的关键步骤。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60424/60424fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="显示胫骨和股骨结构的十字韧带显微图像，突出韧带解剖结构。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60424/60424fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图2"> 
图2：Col2CreERT:Confetti 小鼠的彩虹标记图像。（A）Col2CreERT:Confetti 小鼠样本未经脱钙或长期储存步骤处理。使用十字韧带作为标记定位中央切片位置。该图像通过瓦片扫描在检测到RFP后使用T-PMT成像（比例尺 = 300 µm）。（B）在（A）中可见的生长板近端胫骨内的克隆柱，经三维重建后显示。（C）与（A）和（B）所示切片相邻的另一张切片，经长期储存超过3年，随后进行成像和三维重建处理。（B）和（C）中显示RFP、YFP和CFP（比例尺 = 50 µm）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60424/60424fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="多色荧光显微镜图像；细胞结构分析；蛋白质表达研究" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60424/60424fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3：使用该方法时面临的挑战。（A）白色虚线标示出Col2CreERT:Confetti小鼠生长板切片中的裂隙（比例尺 = 50 µm）。白色框内区域在（B）中放大显示（比例尺 = 25 µm）。两个图中均显示了RFP、YFP和CFP信号，（A）中还展示了非反射激光检测通道（T-PMT），用于显示组织结构。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60424/60424fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
视频 1：来自 Col2CreERT:Confetti 小鼠的生长板三维重建。 由 Col2CreERT:Confetti 小鼠制备的切片在切片完成后长期储存超过 3 年，随后进行成像处理。通过图像分析软件自动完成三维重建，并导出为视频。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60424/video_1.mov" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>
补充文件 1：共聚焦显微镜的典型设置。 （A）采集选项卡中的主要控制项。（B−D）显示了三种 Confetti 荧光蛋白的激光参数、激发波长以及记录的发射波长范围。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60424/60424supfig01.jpg" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本方法介绍了使用R26R-Confetti（Confetti）小鼠模型研究矿化组织的全过程，涵盖从育种策略到图像采集的各个步骤。文中包含一个适用于所有软组织的通用方案，以及一个适用于矿化组织的改良方案。

使用Confetti小鼠进行克隆遗传示踪以研究矿化组织

对体内单个细胞进行标记，以监测其可分化成哪些细胞类型，追踪其在生物体内的迁移路径，或确定其……

通过使用荧光蛋白对单个细胞进行遗传标记并随时间追踪这些细胞，Confetti 小鼠模型使研究人员能够揭示多种生物过程的新见解。我们的实验方案最大限度地缩短了组织采集与成像之间的延迟时间，可应用于任何矿化或非矿化组织，并且能够将荧光信号保存数年。只要存在合适的 Cre 品系，该方法即可用于不同的细胞群体，研究其命运及动力学特征，因此在再生医学和发育生物学的各个领域均具有重要应用价值。我们的分步说明将演示如何区分不同荧光蛋白发出的荧光信号，这是最具挑战性的步骤。首先准备用于成像的小鼠组织。对于软组织以及45天龄以内小鼠的矿化胫骨和股骨，将组织置于预冷的3.7%甲醛PBS溶液中固定，并在4摄氏度下于旋转仪上轻轻滚动孵育六小时。对于45天龄以上小鼠的胫骨和股骨等矿化组织，用氢氧化钠将1升10% EDTA溶液的pH值调节至8.05，并用该溶液将甲醛稀释至3.7%。将组织置于3.7%甲醛PBS溶液中，在4摄氏度下固定过夜。次日，将组织转移至预冷的甲醛-EDTA溶液中，在4摄氏度下旋转孵育48小时，并确保在孵育期间更换溶液三次。然后将组织放入预冷的30%蔗糖溶液中，确保容器完全装满，并在4°C下轻轻旋转过夜。次日早晨，用镊子将组织从蔗糖溶液中取出，在5毫升的最佳切割温度化合物（OCT）中冲洗数秒钟。用预先标记好的冷冻模具装满OCT，迅速将组织置于模具底部，操作过程要快速，避免样品在室温下放置过久。将模具置于干冰上，使OCT包埋剂凝固，从而固定样本。若样本不立即使用，可于-20°C保存。从模具中取出组织块。在样本块顶部与样品台之间涂抹OCT包埋剂，并在冷冻切片机中冷却至少五分钟，或直至OCT完全凝固。将样本架和刀片架预冷至零下20摄氏度，然后将样本放入样品台夹持器中，将刀片放入刀片夹持器中，并静置数分钟使其达到温度平衡。对于出生后生长板的分析，制备厚度为30至160微米的切片。使用冷冻切片机修整组织块，并将组织切片切成合适的厚度，然后将切片收集到载玻片上。随后在室温下将载玻片空气干燥，直至完全干燥，并于-20摄氏度保存，最长可保存36个月。当准备使用载玻片时，将其从冷冻箱中取出，并在载玻片架中恢复至室温。为了去除OCT，使用巴斯德吸管将PBS轻轻滴加到载玻片上。对于160微米厚的切片，将载玻片孵育15分钟，吸去液体后更换新鲜PBS，再继续孵育5分钟。在室温下，将载玻片置于75%硫代二乙醇溶液中，并用长度为60毫米的盖玻片封片。首先，在通道选项卡中点击选择RFP通道，这将导致该通道的详细信息显示在光路选项卡中。然后勾选T-PMT旁边的复选框。将载玻片放入载玻片 holder 中，并将目标组织直接置于光路与物镜之间。为了定位组织，取消选择通道选项卡中“轨道”标题下的 YFP 和 CFP 复选框。在“轨道”标题下选择 T-PMT 通道，然后点击采集选项卡中的“实时”按钮，并增加 T-PMT 通道的增益，以便在屏幕上观察到组织的选择区域。调整载玻片的位置以定位目标区域，并使用显微镜相应的调焦旋钮进行聚焦。然后在采集选项卡中点击停止，以关闭激光曝光。根据文稿说明设置成像参数，并在必要时调整针孔大小。检查设置，确保记录的信号不发生重叠，然后在通道选项卡中选择所有三个通道，按下拍摄按钮。在结果图像中，通过点击“维度”选项卡中每个通道上方的蓝色高亮框来切换显示通道，并在屏幕上手动检查各通道之间的信号重叠情况。如果信号存在重叠，请重新调整参数，直至各信号能够彼此区分。本实验方案用于标记骺板软骨中的软骨细胞，并可视化其随年龄增长的克隆扩增过程。通过观察交叉韧带和近端胫骨生长板中的克隆，确定了中央区域，并对这些克隆进行了成像。在给予他莫昔芬后，表达Col2阳性并被Confetti荧光蛋白标记的单个细胞经历了克隆扩增，并随后保留在生长板中。荧光信号可在长期保存后仍被观察到。部分切片在制备和成像前已储存超过三年。三维重建通过图像分析软件自动完成，并导出为视频。其中一片在冷冻切片过程中发生断裂，其上存在重组水平极高的区域，将阻碍克隆分析，这体现了本实验方案中常见的问题之一。根据您的研究问题，使用能够特异性标记目标细胞的Cre品系可能非常重要。因此，我们建议在重组完成后尽快检测这些细胞的荧光信号。使用可诱导型Cre品系至关重要，因为在非诱导型Cre品系中持续发生的DNA重组可能会改变被标记细胞的荧光特征，从而阻碍克隆分析。该方案可与功能干扰方法结合使用，例如基因操作菌株、药物处理、手术干预，以及制备切片的免疫荧光染色。

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