2020年6月3日
解离海马细胞培养是神经科学中的关键实验工具。当珊瑚骨架用作基质时,由于其神经保护和神经调节作用,神经细胞在培养中的存活和功能得到增强。因此,在珊瑚基质上生长的神经细胞显示出更高的耐久性,因此更适合培养。
该方案的意义在于它提供了一种在体外增加神经元、神经胶质细胞和干细胞的持久性和生长的新方法。它也适用于其他细胞。该技术的主要优点是使用了由珊瑚骨架制成的基质。
这种基质滋养和保护神经细胞,并促进再生。珊瑚骨骼在体外支持神经细胞,其功能可能类似于脑损伤部位的再生植入物。首先,用锤子打碎珊瑚骨架,将其分成 0.5 到 2 厘米的碎片。
为了溶解有机和无机残留物,将珊瑚骨架碎片浸泡在 10% 次氯酸钠溶液中 10 分钟。然后用双蒸水洗涤一次。要去除剩余的有机残留物,请将碎片浸泡在一摩尔氢氧化钠溶液中 5 分钟,然后用双蒸水洗涤一次。
将碎片浸泡在 30% 过氧化氢溶液中 10 分钟,然后用双蒸水洗涤碎片 3 次,继续去除有机沉积物。尽可能多地去除多余的双蒸水,并将珊瑚碎片留在罩中晾干。然后通过在 100 毫米玻璃培养皿中浸泡在 10 毫升 95% 乙醇中来清洁玻璃盖玻片。
15 分钟后,去除乙醇,用双蒸水洗涤 3 次,每次洗涤之间等待 10 分钟。取出双蒸水,将盘子放在 80 摄氏度预热的加热板上。然后轻轻搅拌盖玻片,直到双蒸水蒸发。
高压灭菌盖玻片。使用研钵和研杵研磨珊瑚骨架碎片,直到完全分解。获得尺寸范围为 20 至 200 微米的颗粒混合物。
或者,使用刀片长度为 6 厘米、宽度为 0.5 至 1 厘米的电动研磨机,以 1000 RPM 的速度研磨珊瑚骨骼碎片 30 秒。要净化颗粒,请将颗粒转移到 40 微米电动过滤网过滤器上。将电气过滤器设置调整为以每分钟 600 次振幅摇晃,并以每秒 6 次的速度弹跳。
然后对谷物进行高压灭菌。在无菌条件下,将珊瑚骨架颗粒加入 20 μg/ml PDL 中,溶解在 Hank 溶液中,以达到每 1 ml PDL 溶液 5 毫克或 10 毫克颗粒的浓度。将溶液以每 25 平方厘米约 2 毫升的浓度倒入烧瓶和培养皿中,并在 4 摄氏度下孵育过夜。
颗粒下沉并附着在底部。第二天,用无菌双蒸水清洗烧瓶和培养皿一次。让烧瓶和盘子在引擎盖中晾干。
要涂覆玻璃盖玻片,首先将珊瑚骨架粒以每毫升 5 或 10 毫克的浓度加入双蒸水中。将盖玻片放在预热至 80 摄氏度的加热板上。然后将 40 微升谷物溶液滴到盖玻片的中心,等待 15 分钟以完全蒸发。
这将导致谷物粘附在盖玻片上。高压灭菌涂层盖玻片,并储存在无菌条件下。接下来,将盖玻片放在无菌 24 孔板的盖子上,向每个盖玻片中加入 100 微升每毫升 20 微克的 PDL 溶液。
使用喷嘴确保液体覆盖整个谷物区域和盖玻片表面的其余部分。用板底盖住盖子,并用石蜡膜包裹该处的侧面。在 4 摄氏度下孵育过夜。
第二天,用双蒸水清洗盖玻片一次,然后在罩中晾干。准备好鼠幼崽头后,用大镊子从嘴里夹住。用小剪刀剪开覆盖头骨的皮肤。
用干净的剪刀,进入小脑一侧的颅骨下方,向右和向左剪断颅骨,以便将其取出。使用小镊子将头骨从大脑上剥下来。将大脑与头部分开,并将其放入含有 2 毫升冷 MEM 的 60 毫米培养皿中。
在立体显微镜下,用两个小镊子解剖海马体。将海马体转移到准备好的含有 MEM 的 35 毫米培养皿中。用手术刀将海马切成大约 1 毫米的切片。
加入 200 μL 胰蛋白酶溶液。轻轻混合,并在 37 摄氏度和 5% 至 10% 二氧化碳下孵育 30 分钟。孵育后,向培养皿中加入 2 毫升冷 MEM 以使胰蛋白酶失活。
然后使用直径最大的玻璃巴斯德移液器将胰蛋白酶消化的组织转移到含有 1 毫升第一天培养基的 15 毫升试管中,预热至 37 摄氏度。通过最大直径的玻璃移液管将组织研磨 10 到 15 次。然后使用中等直径的玻璃移液器重复此过程。
继续用最小直径的移液器研磨。避免鼓泡以减少细胞死亡。让解离的组织块沉入 2 到 5 分钟。
然后将上清液转移到另一个 15 毫升试管中。使用血细胞计数器计数细胞。为了达到每毫升 200, 000 至 400, 000 个细胞之间的首选细胞密度。
使用第一天培养基稀释。接下来,在每个玻璃盖玻片上接种 100 微升细胞。确保用单元格覆盖整个盖玻片。
在 37 摄氏度和 5% 至 10% 二氧化碳下孵育。第二天,向孔中加入 500 μL 神经元生长培养基。使用镊子倾斜盖玻片,取出第一天的培养基,然后将每个盖玻片轻轻转移到适当的孔中。
从盖子中吸出剩余的介质。在 37 摄氏度和 5% 至 10% 二氧化碳下孵育板。使用培养箱底部的一盘水保持培养箱的最大湿度。
请勿更换培养基。在这些条件下,培养物可以维持长达一个月。在这项研究中,手动研磨机和电动研磨机都产生了相似的结果,颗粒混合物的大小在 20 到 200 微米之间。
手动或电动过滤器产生两种类型的谷物混合物。一种颗粒尺寸从 40 到 200 微米不等,另一种颗粒尺寸为 40 微米或更小。相差显微照片显示,在基质不存在和存在的情况下,海马细胞在涂有珊瑚骨架颗粒的盖玻片上培养形成了复杂的神经元网络。
细胞核染色表明,接种后 14 天,基质上的细胞密度高于未包被的盖玻片上的细胞密度。用微管相关蛋白 2 染色表明,与对照相比,在基质上形成了复杂的神经元和树突网络。此外,使用神经胶质纤维酸性蛋白可视化的珊瑚骨架基质上生长的神经胶质细胞发生了显着的形态变化。
与在对照基质上生长的神经胶质细胞相比,它们获得了更尖刺的外观,过程更长,在对照基质上生长,它们看起来更圆润、更平坦。在分离细胞时,重要的是要记住快速工作,必要时添加 CO2 以保持 pH 值,并尽可能轻柔地工作,以防止珊瑚粒脱落。
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通过使用珊瑚骨架作为基质来增强离散的海马细胞培养,这提供了神经保护和神经调节的好处。这种方法增加了神经细胞在体外的耐久性和生长,使它们更适合研究应用。
Durable dissociated neural cell cultures are critical for early-stage neuroscience drug discovery, enabling extended mechanistic studies and functional assays. The use of a biologically active coralline matrix addresses the persistent challenge of rapid cell death in vitro, supporting more reliable target validation and phenotypic screening. This matrix-driven approach enhances predictive confidence at key inflection points in neurobiology-focused R&D portfolios.
This matrix-based culture method fits at the interface of early discovery and assay development, enabling robust neural models for downstream screening and translational research.