使用二甲基苯并[a]蒽和12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯（DMBA-TPA）建立化学诱导皮肤癌变模型
2019年12月19日
两阶段皮肤致癌过程由两种外用化学物质诱导。致突变剂7,12-二甲基苯并[a]蒽可导致表皮细胞发生突变，而持续应用促生长剂12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯则可加速皮肤乳头瘤的形成。
这种两步皮肤癌模型可用于研究炎症在皮肤癌中的作用，并能够将肿瘤起始作为一个独立于肿瘤进展的过程进行研究。该模型通过化学诱导形成肿瘤，可利用基因敲除小鼠品系来研究环境因素或治疗候选物的影响。该模型非常适合研究免疫系统和血管生成在癌症中的作用。
其表现出与人类患者鳞状细胞癌相似的疾病病理特征。尽管该方法相对容易操作，但准确把握时间至关重要。在处理具有致癌性的DMBA时，采取适当的安全防护措施也非常重要。
实验开始前，将具有攻击性的7至9周龄小鼠单独分笼饲养，以避免打斗及皮肤损伤。进行皮肤乳头状瘤诱导时，首先剃除实验动物背部的毛发，并对小鼠进行个体称重。剃毛后48小时，使用移液器将50微克DMBA溶于200微升丙酮中，滴加至每只麻醉小鼠的剃毛区域。
对于皮肤乳头瘤的促发，在使用DMBA七天后，每周两次在实验结束前以200微升丙酮中含有5微克TPA的溶液处理皮肤。每周检查动物的乳头瘤情况，并对每个单独乳头瘤进行拍照，将其大小记录在图谱上。若可触及的肿块直径大于1毫米且持续超过一周，则视为乳头瘤。
当肿瘤反应达到平台期时，在最后一次TPA处理后24小时采集动物的相应样本材料，并取全层皮肤组织用于免疫组织化学分析。使用皮肤活检打孔器采集乳头状瘤及非乳头状瘤皮肤样本，用于基因表达和/或蛋白质分析；使用手术刀采集乳头状瘤及非乳头状瘤皮肤组织，用于免疫组织化学分析。随后根据需要采集皮肤引流淋巴结及脾脏组织样本，用于流式细胞术分析。
在DMBA-TPA肿瘤模型中，通常可观察到实验组之间在乳头状瘤无瘤时间和乳头状瘤数量上的统计学显著差异。组织学分析适用于研究乳头状瘤的结构、皮肤的形态或特定免疫细胞的浸润情况。将DMBA和TPA均匀地涂抹于皮肤表面，并以固定的时间间隔给予TPA处理，是实验成功的关键。
定期计数乳头状瘤也非常重要。可以使用多种方法研究影响肿瘤形成数量和时间的机制，包括免疫组织化学、流式细胞术、定量PCR和蛋白质分析。这种传统技术易于调整和应用，可用于研究不同基因、环境因素或感兴趣的治疗手段对肿瘤发生和进展的影响。
进行该技术操作时需谨慎，因为DMBA具有致癌性，且丙酮挥发迅速。建议使用合适的防毒面具并在通风橱中操作。
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概述
本研究介绍了一种两阶段皮肤癌发生模型，可使研究人员探究炎症在皮肤癌中的作用。该模型利用一种诱变剂和一种生长刺激剂来诱导肿瘤形成，从而深入了解肿瘤的起始与进展过程。
关键研究组成部分
科学领域
- 肿瘤学
- 致癌作用
- 炎症
背景
- 两阶段皮肤致癌过程涉及一种致突变剂和一种生长刺激剂。
- 该模型适用于研究鳞状细胞癌。
- 实验设置中，精确的时间控制和安全措施至关重要。
- 可利用基因敲除品系来探究环境因素和治疗因素。
研究目的
- 研究肿瘤发生和发展的机制。
- 评估免疫系统在皮肤癌中的作用。
- 评价化学诱导肿瘤背景下的血管生成。
使用的方法
- 局部应用7,12-二甲基苯并[a]蒽（DMBA）。
- 持续应用12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯（TPA）。
- 利用基因敲除小鼠品系进行环境因素研究。
- 随时间监测肿瘤的形成与进展。
主要结果
- 该模型成功模拟了人类鳞状细胞癌的病理特征。
- 炎症在肿瘤发生过程中起着重要作用。
- 准确的时间控制对于实验结果的可重复性至关重要。
- 处理致癌物质时必须遵守安全操作规程。
结论
- 两阶段模型在研究皮肤癌机制方面具有显著效果。
- 该模型为治疗候选药物的测试提供了平台。
- 进一步的研究有助于加深对癌症生物学的理解。
常见问题
行业重要性概述
DMBA-TPA 两阶段皮肤致癌模型为临床前肿瘤学研究中解析肿瘤的起始与进展提供了可靠的平台。该模型具有良好的可重复性，并能提供定量的检测结果，有助于对炎症通路及免疫介导的肿瘤促进作用进行机制性风险评估。这使得研究人员能够在皮肤科及免疫肿瘤学项目的早期发现阶段，基于数据做出继续或终止的决策，并对研发管线进行优先级排序。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过时间上分离的化学刺激，可区分肿瘤起始与进展过程并进行研究。
- 科学价值：利用基因敲除品系分析，支持对炎症驱动的癌变过程中靶点的功能验证。
- 科学价值：通过分离免疫细胞浸润和血管生成对肿瘤形成的作用，有助于阐明其作用机制并降低研发风险。
筛选与检测方法开发
- 操作价值：可生成标准化、可量化的乳头状瘤计数及生长指标，用于化合物筛选。
- 操作价值：提供可重复的肿瘤发生时间及多发性读数，适用于检测方法的标准化。
- 操作价值：支持对影响肿瘤起始或促进阶段的治疗候选物进行可扩展的评估。
转化与临床前研究
- 转化价值：模拟人类鳞状细胞癌的病理特征，使其与皮肤肿瘤学的临床指征具有相关性。
- 转化价值：将炎症机制与肿瘤进展相联系，支持基于生物标志物的临床前验证。
- 转化价值：提供一个生理相关背景下测试免疫调节剂和抗血管生成药物的平台。
流程与工作流整合
该模型适用于从靶点验证到临床前药效测试的整个发现流程，尤其适用于肿瘤免疫学和炎症通路调控研究。
- 发现生物学：利用可诱导或组成型敲除模型，实现对致癌过程中基因-环境相互作用的假设验证。
- 筛选：提供乳头状瘤潜伏期和负荷等定量终点，用于剂量-反应关系研究和先导化合物优化。
- 分析：生成组织病理学、流式细胞术和分子水平的检测结果，以将表型结果与作用机制相关联。
- 转化研究：通过共有的炎症和血管生成通路，支持从机制发现到临床前验证的连续性研究。
- 企业级复用：建立可重复使用的炎症性致癌平台，用于皮肤癌及上皮性癌症的跨适应症筛选。
运营与企业影响
- 科学价值：通过分离肿瘤发展中的启动和促癌阶段，减少机制上的不确定性。
- 操作价值：通过标准化的化学物质给药、时间控制和安全可控的应用，确保实验可重复性。
- 战略价值：在由炎症驱动的肿瘤模型中实现靶点的早期去风险化，提高资本使用效率。
- 项目组合影响：基于无瘤生存期和疾病进展指标，指导经风险调整后的研发推进决策。
实施注意事项
- 需要具备处理致癌物及在啮齿类动物模型上实施局部给药的专业技能。
- 由于DMBA具有挥发性和致癌性，实验依赖于通风设施和个人防护装备（PPE）的支持。
- 需要标准化的动物饲养管理，以避免因争斗或皮肤损伤导致的干扰因素。
- 需要接受过规范培训，以实现肿瘤大小的一致性测量和长期追踪，确保实验终点的可靠性。
- 仅限于皮肤或易于接触的上皮表面，因此仅适用于局部或黏膜给药研究。
