荧光激活细胞分拣，用于分离瘦杆菌细胞群

珊瑚创造了对人类和海洋生物都重要的生物多样性生态系统。然而，我们仍然不明白许多珊瑚细胞的全部潜力和功能。在这里，我们提出了为石珊瑚细胞群的分离、标记和分离而开发的协议。

该协议有助于在以前不可能确定的描述水平上识别和隔离活珊瑚细胞种群。这种技术的主要优点是，它允许访问一个细胞特异性水平，到目前为止，已经基本上无法实现。展示这个程序的将是山农·赛格博士，一个研究助理，来自西尔维斯特综合癌症中心的流细胞学共享资源。

要设置活珊瑚细胞分拣的流动细胞仪，请在流式细胞仪软件中打开一个新的项目模板，并在激光面板中选择合适的激光器进行分析。然后，在适当的图中创建侧散点图与前进散点图，以设置浇注和分析策略。对于活珊瑚细胞的流动细胞测量分析和分拣，将控制未污染的细胞样本加载到细胞仪的样品室中，然后开始读取过程。

由于珊瑚细胞特别脆弱，请保持细胞计的低气压，以防止细胞解。在散点图中，调整光倍增器电压以居中点并开始记录事件。在前进与侧散射图中，在向前散射 x 轴上 10 到 4 个标记周围的单元格周围创建一个栅极。

用染色细胞的第一个样本替换控制样本，并在暂停前记录大约 10，000 个细胞。然后对染色样本组唯一的事件进行门控。要对活珊瑚细胞进行排序，在选择流式细胞仪软件中感兴趣的细胞群后，将一个包含250至500微升适当收集溶液的微离心管放入细胞计收集室，供每个细胞量采集室进行排序。

一旦经过适当的时间来清除碎片，开始整理所需的种群，收集从1万到数百万个细胞的任何地方。每次使用新的污渍、物种或分拣器时，将至少2万个感兴趣的细胞分类成500微升染色介质，以便对感兴趣的群体进行纯度检查，并重新分析分拣细胞，以确认事件正在用于初始分拣的大门内读取。对于体外研究，将分类的细胞储存在冰上，直到它们被转移到培养箱或灭菌环境。

通过在向前和侧面散射图上创建栅极选择，引入与珊瑚细胞不具有相同形状或粒度的其他非细胞粒子。通过使用直方图比较未染色和染色细胞悬浮液的 DAPI 信号，并找出高 DAPI 表达细胞，可以排除死细胞。同时，通过对远红色通道中信号高的细胞进行浇注，可以去除自荧光共生细胞。

经过这个迭代的浇注过程，剩余的细胞代表缺乏共生亚的完整活珊瑚细胞种群。然后，这些细胞可以通过染色（如活性氧物种活性和/或糖体含量）的染色，分类为不同的细胞子组。请记住，某些细胞比另一些细胞更脆弱，并尽可能小心地运行此过程。

一旦分离出特定的细胞，它们就可用于x-vivo功能测定，如建立细胞培养和创建转录体配置文件。