激光诱导荧光发射（L.I.F.E.）作为新型非侵入性工具，用于在低温层生境中进行生物标志物的原位测量

低温圈中的碳通量尚待评估，但对气候变化至关重要。在这里，我们展示了一种新型原型设备，它基于激光诱导荧光发射（L.I.F.E.）技术，在超高空环境中捕获光动电位，在原位条件下提供高光谱和空间分辨率数据。

本研究的总体目标是校准和测试一种新型设备，该装置可用于对低温层栖息地的生物标志物进行原位测量。该器件基于激光诱导荧光发射技术，称为 LIFE。由于采石、碎裂和锯切样品的分解以及熔化的温度变化，现行标准取样方法对样品造成物理影响。

这些方法往往导致就地条件的伪造。因此，微生物生命的原位检测和表征新方法至关重要。我们开发了一种具有高空间和时间分辨率的新的无创、无损方法。

激光诱导荧光发射技术的应用是基于一个事实，即超冰川环境是居住，除其他外，由光热带生物。这些生物体可以通过检测以植物素为基础的附属色素叶绿素 A 和植物红素的荧光模式来追踪，这些荧光模式分别被蓝色和绿色激光所兴奋。便携式双波长套件重 4.5 公斤，与外部计算机一起用于三脚架。

透镜管朝向试样。然后，绿色五毫瓦激光通过偏振分光分离器后击中样品，将偏振光重定向到光谱仪的光轴。试样上显示一盏红色插图的荧光灯。

一半的准直光通过偏振光束分路器，并通过一个长通滤波器聚焦，从而消除激光信号。接下来，信号击中一个光圈狭缝，它由两个可调剃须刀刀片组成。在传感器上捕获信号之前，棱镜光谱上将光正交细线与狭缝光圈分开。

使用蓝色激光重复该过程。原始数据会自动传输到便携式计算机，该计算机也用于软件操作。它分为三个主要部分。

曝光调整是手动完成的。在这里，曝光时间和信号强度之间的校正是线性的。注释字段用于示例的描述。

在右侧部分中，测量完成后，将尽快显示原始图像。此功能对于现场即时数据评估至关重要。红色区域表示通过减少曝光时间可以避免曝光过度的像素。

12 位灰度原始图像显示了由于一维光圈狭缝和光谱分量由于 CCD 前面的棱镜造成的空间分量。由于对光学约束，原始图像失真。因此，需要通过应用识别失真程度的代码来裁剪和去扭曲它们。

接下来，在532纳米激光的帮助下完成波长校准。绿灯由1064纳米红外激光的频率翻倍产生。CCD 可以检测到两种波长，因此每个像素的光谱位置都可以在去扭曲的图像中计算。

然后，将图片裁剪到给定的波长范围。对选定像素行中每个像素的灰色值进行计数和汇总。灰色值的范围可以从零到 255。

之后，每个像素线占一个数字。在此图中，根据空间坐标绘制每个像素线的灰色值计数。这允许在样品中同时对叶绿素和植物红素进行定量的空间识别。

此外，还可以从选定的像素线绘制样本的光谱属性。现场设置快速方便。将仪器连接到三脚架上。

将镜头管连接到设备。连接 Arduino USB 电缆和摄像机电缆。使用 USB 电缆将外部计算机与仪器连接。

调整三脚架腿，使透镜管覆盖试样。运行软件，描述示例，并开始测量运行。对于颜料校准，从库存溶液中准备一个稀释排系列，如显示。

叶绿素 A 库存溶液需要用丙酮稀释，用蒸馏无菌水稀释植物红素。稍后需要每个稀释步骤的十五毫升。将颜料包裹在铝箔下，保护颜料免受光线影响。

将叶绿素存放在冰柜中，将植物红素存放在冰箱中，直到进一步使用。接下来，构建一个机架，如图所示，其高度为 1.5 厘米。在多闪烁塑料小瓶中加入五毫升浓度最高的稀释剂。

此体积相当于小瓶中的 15 毫米高水柱，并测量荧光强度。然后，将小瓶放在机架的中间位置，再添加相同溶液的五毫升。再用等于 45 毫米的柱高度的五毫升重复此过程。

使用叶绿素和叶绿素的所有稀释步骤重复该过程。由于液体表面位于 LIFE 仪器的焦点，机架和柱高度在测量中起着重要作用。从冰川中收集冰雪样本。

此外，从冰川前场收集微生物垫样本。在这项研究中，选择了位于斯瓦尔巴群岛高北极群岛的Ny-Alesund研究设施附近的冰川米特雷·洛文布林。在 GF/F 过滤器下熔化冰雪样品并进行真空过滤器。

请注意筛选的卷。然后，使用 LIFE 设备在四个随机区域上测量滤波器，每个区域使用绿色和蓝色激光进行三次三分。通过将区域密度与过滤面积和过滤体积相乘来计算整体颜料浓度。

将颜料浓度归类为一升的体积。将过滤器放入一个小瓶中，内有30毫升丙酮，并在夜间四摄氏度的黑暗中储存。接下来，拿一个小瓶，并在声波前放在冰上两分钟，在连续模式下以50%的功率。

挤压并从小瓶中卸下过滤器。不再需要筛选器。将Tygon管连接到注射器，从小瓶中去除叶绿素提取丙酮混合物。

用 GF5 过滤器支架更换 Tygon 油管。将溶液转移到石英盒中。校准丙酮的吸收度光谱仪后，将含有 cuvette 的样品放在光谱仪中，并测量 400 到 750 纳米之间的吸光度特征。

接下来，从光谱仪中去除其铜质，并在样品中加入200微升的两摩尔盐酸。然后，重复吸收度测量，以测量样品中的苯丙酸含量。激光测量对细菌群落活动的影响尚不详细。

因此，通过初级和二级生产对效果进行了调查。对于细菌生产，采取五等我们的细菌垫。三个等分用于三分标记的白化素吸收，两个等分用作控制。

用甲醛灭活控制。在所有等分项中添加标有钛的白化素。对所有样本重复此过程。

在这里，我们的实验设计显示了所需的样本量。接下来，如实验设置所示，用绿色和蓝色激光暴露细菌垫。然后，灭活所有尚未用甲醛处理的样品。

将样品转移到低温中，加入三氯乙酸或TCA。将小瓶在10，000克时离心5分钟。加入闪烁液，将冷冻液放入多闪烁小瓶中。

使用液体闪烁计数器分析样品并计算吸收率。对于光合作用，准备五个等分，如以前，其中两个变暗。加入放射性示踪剂NaH14CO3并孵育4小时。

孵育后，将样品包裹在铝箔中，停止反应。如前所述，每分钟通过液体闪烁测量分解。在将数据规范化为一秒的曝光时间和 15 毫米的样本列高度后，使用泊松回归计算最终校准线。

区域密度和光子计数之间的相关性具有线性字符。曲线的斜率为 81.04。这意味着，在暴露一秒钟的样品中，光子计数速率为 8，104，等于植物红素平方的 100 南克的面积密度。

高浓度样品的标准偏差可以通过样品中的自吸收过程来解释。叶绿素 A 校准曲线显示相似的特征，具有斜率为 8.94 的线性字符。在叶绿素提取和随后的吸收光谱测量之前，使用 LIFE 仪器测量了六个过滤的冰和雪样品，用于叶绿素含量分析。

样品按吸收度光谱法获得的叶绿素含量排序。LIFE 数据显示标准偏差很小，表明滤波器上的材料分布相对均匀。LIFE 仪器低估了前三个过滤器的叶绿素含量。

最后三个过滤器，显示较低的叶绿素含量，被高估了 LIFE 仪器。数据差异的原因可以用滤饼的厚度来解释。在薄滤饼中，以橙色为插图，由于颜料的面积密度低，可以捕获低荧光信号。

叶绿素 A 信号在此原始图像中以红色表示。此原始图像中的所有灰色区域表示滤波器本身在通过 450 纳米长通滤波器后表现出激光诱导信号。软件误导性地将这个信号算作叶绿素 A 荧光。

由于激光不能诱导叶绿素中分子在过滤蛋糕的较深层中产生荧光反应，因此低估了高色素含量。激光照射实验表明，细菌垫的初级和二次生产力没有显著影响。曝光时间从5到60秒，激光强度从5到50毫瓦不等，都没有对生产率结果产生任何影响。

这意味着产生更好信号所需的更高强度和暴露时间不会伤害细胞。四种低温硅石是原位测量的，它们与叶绿素标准溶液进行比较，叶绿素标准溶液是在以红色显示的实验室条件下测量的。蓝色光谱荧光峰值与叶绿素标准光谱匹配，从而提供了就地测量的概念。

对土壤、细菌垫、生物膜和低温硅石进行了生命测量。如果低温硅石覆盖的表面面积超过12.5厘米平方，可以测量具有厚沉积层的低温康石。这种类型的低温石阻挡了冰下杂散的光线。

在薄低温石层中，荧光信号被环境光遮盖。因此，无法对裸冰表面进行 LIFE 测量，而所有其他样品类型都可以通过 LIFE 仪器进行分析。温度变化导致液态水供应增加，导致冰川表面的生物活性增加。

因此，色素浓度可能会增加。监视这些变化并预测可能和可能的未来情况至关重要。