Name: 激光诱导荧光发射（L.I.F.E.）作为新型非侵入性工具，用于在低温层生境中进行生物标志物的原位测量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 38 s
Description: 了解激光诱导荧光发射技术用于低温层生境中原位生物标志物测量的非侵入性方法。该技术可高分辨率检测叶绿素A和藻红蛋白，为冰川微生物生态研究提供便携式现场解决方案。

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作者们衷心感谢美国塔瓦尼基金会的 J.N. Pritzker 上校（IL）、奥地利联邦科学、研究与经济部（Sparkling Science SPA04_149 和 SPA05_201 项目）、阿尔卑斯奥伯古格尔研究站（AFO）、奥地利太空论坛（ÖWF）、欣特图克斯自然冰宫的 Roman Erler，以及斯瓦尔巴群岛新奥尔松北极站的奥地利联邦林业局和基地经理 Nick Cox。我们还要感谢 Sabrina Obwegeser、Carina Rofner 和 Fabian Drewes 在拍摄过程中提供的帮助。最后，我们感谢 James Bradley 为配套视频提供旁白配音。

1. 校准与验证
注意：进行色素校准时，从叶绿素标准溶液制备系列稀释液a 和 B-PE。叶绿素a 将储备液用丙酮稀释，B-PE 用无菌蒸馏水稀释。后续每种稀释液各需 15 mL。用铝箔包裹样品以避光保护色素。将叶绿素储存于a 在冰箱中冷藏保存，B-PE 在冰箱中冷藏保存，直至后续使用。关于稀释梯度的详细操作步骤见第 1.1 节（针对叶绿素）a 和 1.2 用于 B-PE。两者均指 chla 以及使用L.I.F.E.仪器进行色素检测与定量的B-PE实验室校准方法如下所述。此前的校准24 使用了与本研究相同的颜料。
<ol>
	<li>叶绿素a稀释系列
	<ol>
		<li>将1 mg叶绿素a（从A. nidulans藻类中纯化获得）用丙酮溶解于50 mL样品管中，并用丙酮将该叶绿素a储备液稀释至以下终浓度：1,000；800；640；320；160；80；40；20；10；5；1；和0.5 ng/mL。</li>
		<li>将每种稀释液各15 mL转移至50 mL样品管中，并用铝箔包裹以避光，因该物质对光敏感。将样品管储存于-20 °C冰箱中，直至进行校准测量。 
		注意：本方案可在此处暂停。</li>
		<li>使用双光束分光光度计对每种稀释液的叶绿素a吸收特征进行三次重复测量，并按照Lorenzen25所述方法计算叶绿素a含量，具体细节将在第2.2.2节中详细描述。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>藻红蛋白（PE）稀释系列
	<ol>
		<li>将4 mg/mL的B-藻红蛋白（B-PE）储备液用无菌过滤水（pH = 7）稀释至以下终浓度：1,000；800；640；320；160；80；40；20；10；和5 ng/mL B-PE。将每种稀释液各15 mL转移至50 mL样品管中，并用铝箔覆盖。4 °C保存以备后续使用。 
		注意：本方案可在此处暂停。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>校准设置
	<ol>
		<li>按照图5所示搭建支架，建立三个测量平台，每个平台比下一个高1.5 cm。 
		注意：支架和液柱高度对测量至关重要，因为液体表面应始终保持在L.I.F.E.仪器的焦点位置，如图5所示。</li>
		<li>取5 mL最高浓度的稀释液加入聚苯乙烯闪烁塑料小瓶中，并将其置于支架的最高位置，测量荧光强度。</li>
		<li>将小瓶移至支架的中间位置，再加入5 mL（总体积10 mL），测量荧光强度。再将小瓶移至支架最低位置，再次加入5 mL（总体积15 mL；液柱总高度45 mm），并进行测量。 
		注意：应针对每一步稀释调整曝光时间，以防止探测器饱和（12位图像中灰度值超过255），并确保弱荧光信号具有足够的信噪比。</li>
		<li>对叶绿素a和B-PE的所有稀释液（步骤1.1.1和1.2.1）重复步骤1.3.2和1.3.3。</li>
		<li>将生成的数据文件导入数据处理向导，自动沿Y轴（空间分布）对每行像素的灰度值进行计数并求和。 
		注意：通过将荧光强度归一化至1秒积分时间，系统会自动补偿不同曝光时间的影响。</li>
		<li>利用稀释系列已知浓度和归一化后的荧光强度，采用泊松回归分析计算色素面密度。然后将三个不同液柱高度的荧光计数归一化至1.5 cm（5 mL），方法是将各液柱高度的计数分别乘以一个校正因子（对于5 mL、10 mL和15 mL溶液，因子分别为1、0.5和0.33）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="显示光折射和焦点分析的光学装置示意图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60447/60447fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 5"> 
图 5：在实验室条件下使用叶绿素a和B-藻红蛋白（B-PE）进行L.I.F.E.校准的装置示意图。 
(A) 仪器的透镜管。(B) 用于激发B-PE的绿光激光器。(C) 用于激发叶绿素a的蓝光激光器。(D) 闪烁小瓶。(E) L.I.F.E.仪器的焦点位置。(F) 含5 mL、10 mL和15 mL的B-PE/水溶液或叶绿素a/丙酮溶液。(G) 间隔垫片，用于在三种不同体积下将每种溶液的表面保持在焦平面上。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60447/60447fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
2. 取样与样品处理
<ol>
	<li>积雪和冰的采集
	<ol>
		<li>从冰川中采集积雪和冰面冰，装入无菌聚乙烯袋中，并冷冻保存直至进一步处理。 
		注意：本研究中的样品采自斯瓦尔巴群岛高北极地区研究站Ny-Ålesund附近的中洛温布伦冰川（Midtre Lovenbreen, MLB）（78°53’ N, 12°03’ E）。</li>
		<li>从冰川前缘采集细菌垫样品，装入无菌聚乙烯袋中，并将所有样品运送至实验室进行后续处理。</li>
		<li>在4 °C避光条件下缓慢融化冷冻样品。使用GF/F滤膜（47 mm直径）过滤液体样品，并记录过滤体积。将滤膜冷冻保存直至进一步处理。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>叶绿素a测定
	<ol>
		<li>使用L.I.F.E.仪器，在滤膜上随机选取四个区域，分别使用绿色和蓝色激光进行三次重复测量。通过将面积密度乘以过滤面积和过滤体积，计算总色素浓度。将色素浓度（µg/L）标准化至1 L体积。</li>
		<li>根据Lorenzen25的实验方案，使用实验室标准方法测定GF/F滤膜中的chla含量。具体操作为：将每张滤膜放入含有13 mL丙酮的试管中，4 °C避光过夜。随后取出试管，置于冰上，以50%功率连续超声2分钟。挤压并从试管中取出滤膜。</li>
		<li>将Tygon管连接至注射器，从试管中吸取chla提取液-丙酮混合液。更换Tygon管，连接GF-5滤器支架。将溶液转移至石英比色皿中。</li>
		<li>在对丙酮进行吸收光谱仪校准后，将比色皿中的样品放入光谱仪，测定400–750 nm范围内的吸光度特征。随后从光谱仪中取出比色皿，向样品中加入200 µL的2 M HCl，再次进行吸光度测定，以检测样品中脱镁叶绿素的含量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过放射性标记物测定微生物活性及激光强度与照射时间对生产力速率的影响 
	注意：注意标记物的放射性（β射线）。实验时需穿戴实验服、手套和护目镜，并在持有许可的同位素实验室的通风橱内操作。
	<ol>
		<li>将五份细菌垫等分试样转移至无菌聚乙烯袋中用于细菌生产测定。向对照组中加入甲醛至终浓度为4%，以灭活微生物。 
		注意：其中三份用于3H标记亮氨酸摄取实验，另两份作为对照。</li>
		<li>分别使用蓝色激光（405 nm, 5 mW）和绿色激光（532 nm, 5 mW）对细菌垫照射10秒和30秒。重复实验时使用50 mW激光。随后，对未加甲醛处理的样品进行灭活。 
		注意：每份细菌垫仅用于一次激光照射。未照射的微生物垫作为对照。</li>
		<li>激光处理后，分别通过3H-亮氨酸和NaH14CO3的掺入来估算细菌生产和初级生产。测定细菌生产时，每份样品取五个等分试样（20 mL），向其中两个平行样中加入甲醛（终浓度4%），作为标记物非生物掺入的对照。向所有不同处理组的样品中加入3H-亮氨酸（40 nM），在原位条件（0.1 °C）下孵育4小时。向剩余活体样品中加入甲醛以终止反应。</li>
		<li>对于细菌垫的细菌生产测定，将标记样品转移至冻存管中。根据Kirchman26和Bell27的实验方案，使用5%三氯乙酸提取细胞，并在10,000 x g下离心5分钟。加入闪烁液，将冻存管放入多用途闪烁瓶中。使用液体闪烁计数器分析样品，并计算摄取速率。 
		注意：其中三份用于3H标记亮氨酸摄取，另两份作为对照。</li>
		<li>对于初级生产测定，准备五份不同处理组的重复样品（100 mL），将其中两份用铝箔包裹以模拟黑暗条件，并向所有样品中加入NaH14CO3（1 µCi）。在环境光照和原位温度（0.1 °C）下孵育4小时。通过遮蔽剩余三个重复样并使用GF/F滤膜（25 mm直径）过滤样品，以终止反应。</li>
		<li>向滤膜中加入100 µL的2 N HCl以去除过量碳，然后在通风橱中通风干燥。将样品在80 °C加热板上烘干，并放入多用途闪烁瓶中。</li>
		<li>为测定初级生产和细菌生产各处理组的每分钟放射性衰变数（dpm），将冻存管放入多用途闪烁瓶中，加入5 mL闪烁液。使用液体闪烁计数器测定dpm，并计算摄取速率。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Kaňa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+slow+S+to+M+fluorescence+rise+in+cyanobacteria+is+due+to+a+state+2+to+state+1+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">The slow S to M fluorescence rise in cyanobacteria is due to a state 2 to state 1 transition.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1817, 1237-1247 (2012).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

校准 
在将光子计数归一化至1 s曝光时间后，色素浓度与荧光强度之间呈现线性相关关系。与相同色素浓度但液柱高度较高的样品相比，液柱高度较低且色素浓度较低的样品会导致目标色素含量被高估。此外，微弱的荧光信号需要较长的曝光时间才能在传感器上获得足够的光子计数。然而，较长的积分时间也会增加传感器上的杂散光量，从而降低信噪比。在当前版本中，软件在数据处理过程中无法区分噪声与信号。因此，低荧光强度的测量结果会导致色素含量被高估，因为噪声被计为来源于目标色素的信号。此外，较高浓度色素溶液的荧光强度表现出比低浓度溶液更大的变异性。该现象可通过用于绘制校准曲线的色素溶液内部的吸收过程加以解释。
叶绿素a定量的数据验证 
在过滤冰和雪样品后，三维样品在滤膜上几乎呈现为二维样本。这证明了L.I.F.E（面积密度）与分光光度法数据（体积测量）之间进行直接比较是合理的。
数据集（图8）表明，高色素浓度会导致对实际值的低估，而低色素浓度则会导致对实际值的高估。这一现象可通过滤饼的厚度以及样品的体积特性来解释。激光穿透深度取决于样品的光密度和厚度。由于激光无法激发较深层中的色素产生荧光，因此高色素含量被低估。然而，在较薄的滤饼中，由于色素的面密度较低，所采集到的荧光信号也较弱。显然，在透过450 nm长通滤光片后，滤膜本身显示出激光诱导的信号（图12），该信号被错误地计为来源于chla的荧光信号。因此，过薄或过厚的滤饼均难以使用L.I.F.E.仪器进行准确测量。
<img alt="激光激发与荧光发射示意图，带有滤光片反射装置；光学研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60447/60447fig12.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图12"> 
图12：来自GF/F滤膜上厚（A）和薄（B）滤饼的荧光信号。（A）自遮蔽效应阻止了激光诱导更深层产生的荧光，导致色素浓度被低估。（B）滤饼的荧光发射受到滤膜反射光叠加的影响。（C）原始数据显示滤膜反射信号（灰色）。实验室获得的叶绿素a荧光光谱模式以红色表示。比例尺 = 45 mm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60447/60447fig12large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
L.I.F.E. 原型的局限性 
在数据降维过程中，MATLAB 编写的软件通过累加特定波长范围内像素线的数值来解析原始图像。当前版本的软件无法区分来源于有机物和无机物的信号。多种信号的存在可能导致色素含量的实际值被高估。由于荧光强度较低，需要较长的曝光时间，这导致信噪比下降，从而加剧了上述效应（见图8和图12）。
如图13所示，当用绿光和蓝光照射时，一块晶洞岩石表现出红色荧光。目前尚不清楚该荧光是源于矿物，还是源于基于卟啉的分子。因此，生物信号与非生物信号的叠加可能会限制本方法的应用，并需要为L.I.F.E.原型机建立专门的荧光数据库。
<img alt="荧光发射实验，样品A、B、C的显微镜图像，显示不同的亮度。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60447/60447fig13.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图13"> 
图13：采自新奥尔松（Ny-Ålesund）的晶洞岩石中的矿物荧光。 岩石分别使用532 nm 50 mW激光器（A）和405 nm 50 mW激光器（B）激发。两张图像均在镜头上加装偏振滤光片拍摄，导致实际荧光颜色失真。（C）在日光条件下，未使用偏振滤光片拍摄的真实颜色图像。比例尺 = 40 mm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60447/60447fig13large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
Beutler 等人29得出结论，海洋生态系统中蓝藻的特征发射光谱依赖于环境条件。此外，光合生物的代谢状态也会影响其荧光特性30。L.I.F.E 仪器可通过使用包含与环境条件相关联的样本光谱信息的生物指纹图谱库，来区分藻类与蓝藻的荧光模式。
在暗适应的叶绿素a分子中，所有反应中心均处于完全氧化状态，可用于光化学反应，且无荧光产额被淬灭31。采用L.I.F.E.程序时，先用532 nm激光（绿色）激发样品，随后使用405 nm激光（蓝色）进行第二次激发。在蓝色激光的第二次激发过程中，由于先前受到绿色激光的激发，叶绿素a可能表现出降低的荧光响应。尽管532 nm波长远离其吸收峰波长，叶绿素a仍可吸收该波长的能量32。在实际进行405 nm波长下的叶绿素a测量前，绿色激光可能引发光化学反应，从而激活目标色素中的淬灭机制。此外，对海洋光合生物进行预照射后，在450 nm–600 nm范围内的光谱归一化曲线未发生改变，但荧光强度的标准偏差增加了25%29。根据物种的不同，荧光强度甚至可能因先前的激发而增强。这一现象仍需进一步研究。
适用性 
我们已在多种生境中测试了L.I.F.E.仪器，重点是冰锥孔（cryoconite holes）。由于测量过程中无环境光干扰，激光技术已成功应用于土壤和生物膜生境。当沉积层阻隔了冰锥孔下方的光线时，可对冰锥颗粒进行测量（图14A、C）。而沉积物较薄的冰锥孔则允许下方杂散光透过（图14B），杂散光会干扰测量结果。因此，在白天光照条件下尚无法测量裸露冰面的色素浓度。目前正在进行信号处理方面的研究，以实现该系统在高环境光条件下的正常运行。
<img alt="冰面上的冰尘融水；太阳辐射对冰层和颗粒物影响示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60447/60447fig14.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图14"> 
图14：顶部有液态水的冰尘穴。（A）冰川上的冰尘，带有L.I.F.E.透镜管。比例尺 = 70 mm。（B）沉积层（红色）非常薄，杂散光可穿透冰尘层。（C）沉积层足够厚，可阻挡来自下方的杂散光。此类冰尘穴可使用L.I.F.E.仪器进行测量。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60447/60447fig14large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
综上所述，我们的 L.I.F.E. 仪器在土壤、细菌垫、生物膜以及冰川表面的冰锥孔等陆地生境中检测到了光合自养生物。目标分子为叶绿素a 和 B-藻红蛋白（B-PE）。空间分辨率为 30 µm/px。叶绿素a 的检测限为 250 pg/mL，B-PE 的检测限为 2 ng/mL。在实验室校准后，我们能够对在北极研究地点采集的样品中的色素含量进行定量分析。我们应用了自行编程的软件实现自动化数据处理。测量过程中矿物的存在以及光照条件的变化所造成的影响仍需进一步研究。
随着气候变暖，温度升高导致液态水的可利用性增加，从而提高了冰面自养和异养生物的生物活性。应大力开展对异养生物的原位检测，以全面揭示冰冻圈中活跃的生命活动。这可以通过其他目标色素及适当的激光激发波长进行验证。因此，L.I.F.E. 提供了一个合适的监测系统，能够在全球变化背景下以及可能的天体生物学应用中，对冰川表面条件实现高时间分辨率和高空间分辨率的监测。

冰冻圈包含海冰、冰川、高山湖泊、积雪区、湖冰、融水溪流以及永久冻土。这些区域约占地球陆地面积的11%1,2，其上方的大气层构成了公认的冰冻圈环境。近期研究表明，冰冻圈的大片区域正在迅速退缩3,4。南极5,6、阿尔卑斯山脉7、北极8及其他地区均显示出负的冰量平衡。冰盖和冰川的退缩导致地球上最大的淡水资源库逐渐枯竭。在某些地区，冰川退缩已无法阻止5。
长期以来，冰生态系统被认为是一种无菌的环境。然而，尽管条件严酷，地球冰冻圈中存在活跃生命的现象已十分明确9,10,11,12,13,14,15。由于冰体因融化而大规模流失的趋势日益显著，冰冻圈正经历生物活性的转变，并影响邻近的生境。为了理解这些部分不可逆的变化，我们需要能够在原位条件下以高空间和时间分辨率研究冰中生物活性的方法。
在冰川表面环境中，生命存在于冰尘孔洞、积雪覆盖层、融水、溪流以及裸露的冰面之上。然而，最显著的冰川表面生境是冰尘孔洞。这类生境在全球冰川地区均有分布，最早由瑞典探险家 Adolf Erik Nordenskjold 在19世纪70年代远征格陵兰期间首次描述16,17。该名称源自希腊语“kryos”（寒冷）和“konia”（尘埃）。由风力输送的深色有机和无机碎屑附着于冰面，局部降低了反照率。太阳辐射促使碎屑向下融化进入更深层的冰层，形成底部含有沉积物（冰尘）的圆柱形凹坑9。冰尘孔洞约占冰川消融区面积的0.1–10%11。
冰尘生物群落由病毒、真菌、细菌、蓝细菌、微藻和原生动物组成。根据地区不同，还可发现轮虫、线虫、桡足类、缓步动物和昆虫幼虫等后生动物。Edwards 等人18将冰尘穴描述为“冰寒中的热点区域”。他们还在冰尘穴中追踪到与氮、铁、硫和磷循环相关的功能基因。这些微型湖泊生态系统进行呼吸和光合作用的速率，可与温暖得多且营养更丰富的生境中的速率相媲美11。这些发现凸显了微生物固持作用在冰川表面环境中的重要作用。除了冰尘穴中的生物群落外，裸露的冰面也栖息着冰藻。冰藻的生理特性已被广泛研究19，但其空间分布尚未得到系统评估20。它们在冰川表面环境中的存在会降低反照率，从而促进冰雪融化，导致养分淋失并输入下游生境9。温度升高导致液态水的可获得性增加，进而影响这些冰雪生态系统中的净生态系统生产力。
在冰面环境中，光合作用活性生物将无机碳和氮转化为有机的、可供微生物食物网利用的物质21,22。迄今为止，估算冰面碳通量的研究仍十分有限11,20,23。所提出的碳通量速率存在差异，主要原因在于空间和时间上的数据分辨率较低。此外，冰裂孔以外区域的冰面群落空间分布几乎未被评估。Cook 等人20在其模型中预测，由于冰面藻类群落覆盖面积较大，其固定的碳量可达 contemporary cryoconite holes 的 11 倍之多。目前，由于缺乏原位检测与定量工具，仍难以有效检测并保障冰面藻类群落样本的完整性。
由于后勤方面的困难，冰层生态系统的研究频率低于温带地区的生境。数据分辨率取决于所评估样本的数量，并受研究地点可达性的影响。标准采样方法（如锯切、钻取冰芯及后续融化）会干扰微生物群落。例如，使用标准方法无法在不造成显著干扰的情况下对固态冰样品中的叶绿素a（chla）进行测定。因此，在所研究的微生物群落中，因融化引起的温度变化不可避免。鉴于嗜冷生物的光系统II及其他细胞结构对温度敏感22，对融化后的冰样品进行实验室分析将始终导致原位条件的失真。
非破坏性原位测量是获得可靠数据的唯一合理方法。这一目标可通过基于荧光的方法实现。由于具有捕光功能，chla 和 B-藻红蛋白（B-PE）存在于参与冰川表面环境中碳循环的生物体中，这一点已被Anesio等人11证实。因此，这些荧光分子可作为量化冰生态系统中微生物介导的碳通量的合适生物标志物。
本研究介绍了一种用于原位定量测定陆地和冰层生态系统中叶绿素a和B-藻红蛋白（B-PE）分子的新型非侵入式工具的开发、校准及其应用。该原型设备基于激光诱导荧光发射技术（L.I.F.E.）。该光学仪器（图1）在激光诱导荧光激发后捕获荧光生物标志物的信号。该方法具有非破坏性，可在野外研究现场或实验室中进行。
<img alt="光学激发装置；示意图；激光光谱系统；光子学研究，532 nm，405 nm 激光器。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60447/60447fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：L.I.F.E. 原型装置。左图：未安装防护盖时的仪器照片。右图：仪器的示意图。总质量 = 5.4 kg（激光器与光学部件 = 4.025 kg，笔记本电脑 = 1.37 kg）。铝制框架尺寸 = 32.5 cm × 20.3 cm × 6.5 cm。光学管：18.4 cm × 4 cm（直径）。CCD：bluefox mv220g 传感器；F：伺服控制的长通滤光片（450 nm 和 550 nm）；L：光学透镜；M1：反射镜；M2：二向色镜；MC：微控制器；P：棱镜；PBS：偏振分束器；S：由可调剃须刀片制成的狭缝光阑。比例尺 = 70 mm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60447/60447fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
该便携式双波长装置重4.5 kg，需与三脚架及外接计算机配合使用。现场安装快速简便。将仪器固定于三脚架上，并将镜头管连接至设备，同时接入USB线缆和相机线缆。通过USB线缆将外接计算机与仪器连接。调节三脚架支腿，使镜头管对准并覆盖待测样本。随后，5 mW绿色激光经偏振分光棱镜后照射样本，该棱镜将偏振光重定向至光谱仪的光轴方向。样本产生荧光，如图1中红色所示。准直光束中的一半透过偏振分光棱镜，并经伺服控制的长通滤光片聚焦，以去除激光信号。随后，信号通过由两个可调剃刀刀片构成的狭缝光阑。棱镜将垂直于狭缝光阑的细光束在光谱上进行分离，之后由传感器捕获信号。该过程使用蓝色激光重复一次。原始数据自动传输至便携式计算机，该计算机也用于软件操作。
该仪器由一台外部计算机通过LabVIEW环境进行控制，以同步CCD相机的图像采集、激光器的开关以及长通滤光轮的旋转。图形用户界面（GUI）分为三个主要部分。曝光调节需手动完成。尽管曝光时间与信号强度之间呈线性关系（图2B），但最大曝光时间被限制为10秒，因为更长的积分时间会导致信噪比显著下降。注释字段用于描述样品信息（图2A）。在右侧区域，测量一旦完成即刻显示原始图像。此功能对于野外现场的即时数据评估至关重要（图2C–E）。红色区域表示过曝像素，可通过缩短曝光时间来避免。
后续的原始数据降维过程与图像采集过程相互独立，可在图像采集完成后的任意时间进行。
<img alt="光谱测量装置界面；光学激发测量；滤光片设置；光谱分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60447/60447fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图2"> 
图2：L.I.F.E. 图形用户界面，用于数据采集与原始数据评估。（A）该软件支持对样品描述进行手动文本输入。（B）测量前可调节曝光时间。（C−E）原始图像在界面右侧显示。（E）红色表示传感器已达到饱和。（F）点击 RUN MEASUREMENT 按钮将启动数据采集过程。在阵列（G）中，显示了数据采集期间自动执行的所有指令。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60447/60447fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="显示CCD上空间和光谱分离的瞬态吸收光谱示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60447/60447fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3：原始图像示例。左侧：丙酮溶液中chla标准品的原始数据，由L.I.F.E仪器记录。由于设备的光学特性，信号呈现为弯曲的线条。右侧：按像素（px）解析的原始图像。光谱轴（5 nm/px分辨率）与空间轴（30 µm/px分辨率）相对应绘制。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60447/60447fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
12 位灰度原始图像由于一维狭缝光阑的存在而呈现出空间分量，同时由于 CCD 前方的棱镜而呈现出光谱分量（图 3）。受光学限制的影响，原始图像存在畸变，因此需要通过应用能够识别畸变程度的代码对图像进行裁剪和去畸变校正。该过程通过软件向导完成（图 4）。接下来，使用 532 nm 激光进行波长校准。绿光由 1,064 nm 红外激光的频率倍增产生。由于 CCD 可同时检测这两个波长，因此可在去畸变后的图像中自动计算每个像素的光谱位置（图 4）。
然后将图像裁剪至指定的波长范围（绿光激光测量为550–1,000 nm，蓝光激光测量为400–1,000 nm）。选取某一像素行，统计并累加该行中每个像素的灰度值，灰度值范围为0–255。此后，每一像素行对应一个数值。后续的屏幕软件操作将生成一幅图表，显示各像素行的灰度值计数随空间坐标的分布情况。这实现了对叶绿素的空间定量区分a 并同时检测样品中的B-PE。此外，可自动从选定的像素线绘制样品的光谱特性。
<img alt="光学发射分析；光谱学装置；带有光谱拟合结果的示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60447/60447fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图4"> 
图4：校正原始图像的畸变。左：使用绿色激光捕获的原始图像。未使用滤光片。信号显示在532 nm和1,064 nm处。曝光时间 = 0.015 s。 中：裁剪后的532 nm信号被用作参考线，以校正一组图像的畸变。 右：从原始图像源校正后的图像。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60447/60447fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>丙酮</td><td>Merck</td><td>67-64-1</td><td></td></tr><tr><td>B-藻红蛋白</td><td>Invirtrogen</td><td>P6305</td><td></td></tr><tr><td>叶绿素a标准品</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6144-1MG</td><td></td></tr><tr><td>甲醛</td><td>Merck</td><td>HT501128</td><td>36%</td></tr><tr><td>GF/C滤膜</td><td>Whatman</td><td>WHA1822025</td><td>直径25mm</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Merck</td><td>H1758</td><td>36,5-38%</td></tr><tr><td>L.I.F.E. 原型装置</td><td>University of Innsbruck</td><td></td><td>按需定制</td></tr><tr><td>LabView</td><td>National Instruments</td><td></td><td>软件，实验室虚拟仪器工程工作台</td></tr><tr><td>亮氨酸，L-[4,5-³H]，1 mCi</td><td>Perkin Elmer</td><td>NET1166001MC</td><td>放射性</td></tr><tr><td>Beckman Ready Use液体闪烁液</td><td>Beckman</td><td>已不再供应，可用Packard Ultra Gold替代</td><td></td></tr><tr><td>液体闪烁计数器</td><td>Beckman</td><td>缺货</td><td>LSC 6000 IC</td></tr><tr><td>NaH¹⁴CO₃ (4 &amp;micro;Ci/ml)</td><td>DHI Denmark</td><td>4 &amp;mu;Ci/ml, 1 ml</td><td>放射性</td></tr><tr><td>Osmonics聚碳酸酯滤膜</td><td>DHI Denmark</td><td>PCTE</td><td>直径25mm，孔径0,2&amp;micro;m</td></tr><tr><td>聚闪烁小瓶</td><td>Perkin Elmer</td><td>WHA1825047</td><td>20ml</td></tr><tr><td>样品管</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T2318-500EA</td><td>Greiner离心管，50ml</td></tr><tr><td>分光光度计</td><td>Hitachi</td><td>NA</td><td>型号U2001，任何可在664nm和750nm波长下进行吸收光谱测量的光度计均可适用</td></tr><tr><td>三氯乙酸（TCA）</td><td>Merck</td><td>T6399</td><td>100%</td></tr><tr><td>超声探头</td><td>nano lab</td><td>QS1T-2</td><td></td></tr></tbody></table>

激光诱导荧光发射（l.i.f.e.）作为一种新型非侵入式工具用于冰冻圈生境中生物标志物的原位测量

Laser-Induced Fluorescence Emission (L.I.F.E.) as Novel Non-Invasive Tool for In-Situ Measurements of Biomarkers in Cryospheric Habitats

全球变暖影响着多种生态系统中的微生物群落，尤其是冰冻圈生境。然而，关于极端环境中微生物介导的碳通量仍知之甚少。因此，目前极少数研究中所描述的样品采集方法存在两个主要问题：A）高分辨率数据需要大量样品，而在偏远地区难以获取；B）不可避免的样品操作，如切割、锯取和融化冰芯，会导致对原位条件的误解。本研究介绍了一种无需样品制备或破坏样品的原型设备。该设备可用于陆地和冰层生态系统中的原位测量，具有高光谱和空间分辨率，其原理基于激光-诱导荧光发射（L.I.F.E.）技术。通过检测光合色素中的L.I.F.E.特征信号，可识别出冰面光合自养微生物群落。本文展示了该设备对卟啉类衍生物叶绿素a（chla）（405 nm激光激发）和B-藻红蛋白（B-PE）（532 nm激光激发）的L.I.F.E.校准。为验证该方法，采用传统的chla定量方法——色素提取及后续吸收光谱分析——对L.I.F.E.数据进行了验证。该原型设备在极端极地环境中的野外适用性已得到证实。进一步的陆地生境测试在摩洛哥沙漠的火星类比模拟实验以及奥地利石冰川上进行。L.I.F.E.仪器能够以可接受的操作后勤条件实现大范围区域的高分辨率扫描，有助于更好地理解在全球变化背景下冰面微生物群落的生态潜力。

B-PE 的实验室校准 
在20 °C的暗室中，使用L.I.F.E.仪器测量B-PE稀释系列的响应信号（图6）。计数率取决于被测样品的浓度和液柱高度。相较于相同浓度但液柱高度更高的样品，低浓度且低液柱高度的B-PE样品表现出更强的荧光。
<img alt="浓度与计数图；色谱柱数据，显示归一化曝光和缩放因子。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60447/60447fig06.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 6"> 
图 6：B-PE 实验室校准。展示了 B-PE 含量与柱密度的校准结果。归一化计数率按 1.5 cm 的柱高计算得出。经许可转载28。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60447/60447fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
最终校准曲线的拟合采用泊松回归。面积密度与像素灰度值计数之间存在线性相关关系。曲线函数为 y = 81.04x（图7），这意味着在曝光1秒的样品中，8,104的灰度值计数率相当于100 ng/cm2的B-PE面积密度。叶绿素a（chla）的校准以类似方式建立，其函数为 y = 8.94x。
<img alt="校准曲线图，显示光谱分析验证中面积密度与计数值的数据拟合情况。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60447/60447fig07.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图7"> 
图7：B-PE的最终校准曲线。灰度值计数已归一化至1秒的曝光时间，并相对于面积密度进行绘图。经许可转载28。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60447/60447fig07large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
斯瓦尔巴群岛冰尘样本的应用及数据的实验室验证 
使用丙酮进行常规提取，随后通过分光光度计分析，得到相同样本的L.I.F.E.测量平均值及单次测量值，如图8所示。
<img alt="叶绿素分析；柱状图；光度法与光学方法对比；样本数据比较；实验结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60447/60447fig08.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图8"> 
图8：利用天然样品进行数据验证。 样品（MLB）按叶绿素a含量排序，依据实验室分光光度计测得的结果（单次测量值），并与每张滤膜上四个随机区域测得的叶绿素a荧光数据进行比较。误差线表示L.I.F.E.测量结果的标准偏差。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60447/60447fig08large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
Chla 内容涵盖从 48 µg/L–67 µg/L 被低估，且叶绿素含量较低a 内容范围从 0.7 µg/L–7 µg/L 被 L.I.F.E. 原型机高估。L.I.F.E. 测量值的标准差较低。
原位测量光谱数据与实验室标准品的比较 
冰尘样品的叶绿素a光谱与从A. nidulans藻类中提纯得到的样品光谱相似。所有样品的荧光峰均位于700 nm–710 nm。然而，与叶绿素a色素标准品的光谱相比，冰尘样品的光谱在400 nm–650 nm以及800 nm–1,000 nm范围内的噪声信号更高（图9）。
<img alt="荧光光谱图，405 nm 激发，相对强度 vs. 波长，700 nm 处出现峰值。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60447/60447fig09.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图9"> 
图9：光谱数据分析。 使用405 nm激光激发后，对四个冰尘颗粒（蓝色）和一个叶绿素a标准色素溶液（红色）进行测量。光谱数据是在样品采集一年后记录的。样品在测量前始终保持冷冻状态，且未暴露于光照。由于波长校准问题，荧光峰位于700 nm–710 nm，而非680 nm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60447/60447fig09large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
自动化冰尘颗粒分析 
在一个冰尘孔自动化分析的示例中（图10），在第50行像素处观察到最高的色素面积密度。使用532 nm激光激发后，样品光谱显示一个峰值，该峰值因传感器过饱和而被截断，对应的灰度值为255。此峰值来源于绿色激光，而非荧光信号。
<img alt="在532 nm和405 nm激发下的光谱分析原始图像、密度图及光谱图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60447/60447fig10.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图10"> 
图10：直径为1 mm的单个冰尘颗粒的自动化数据分析。样品采自维斯特布罗格尔布林（VBB），采样后4小时内于新奥尔松北极站（GB）设施的暗室实验室中进行测量。左列为B-PE测量结果，右列表示叶绿素a数据。顶部显示原始图像，激光诱导荧光响应以灰色表示，红色区域表示标准色素的响应信号。中间部分展示了目标色素的空间分布，下部图像显示荧光信号的光谱特性。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60447/60447fig10large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
激光激发对细菌席生产力的影响 
当增加激光功率和/或曝光时间时，初级生产力和细菌生产力均未受到影响（图11）。在提高激光功率的处理下，未检测到显著差异。
<img alt="细菌碳生产量柱状图；激发波长为 532 nm 和 405 nm，功率可变。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60447/60447fig11.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 11"> 
图 11：来自斯瓦尔巴群岛样品的生产力测量结果。细菌垫暴露于不同强度和曝光时间的绿色和蓝色激光下。数据根据激光波长来源（绿色和蓝色）进行着色。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60447/60447fig11large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

冰冻圈中的碳通量目前几乎尚未得到评估，但在气候变化方面至关重要。本文展示了一种新型原型装置，该装置基于激光诱导荧光发射（L.I.F.E.）技术，在原位条件下提供高光谱和高空间分辨率的数据，用于捕捉表生冰川环境中的光合潜力。

激光诱导荧光发射（L.I.F.E.）作为一种新型非侵入式工具用于冰冻圈生境中生物标志物的原位测量

全球变暖影响多种生态系统中的微生物群落，尤其是冰冻圈生境。然而，关于……

本研究的总体目标是校准并测试一种可用于冰冻圈生境中生物标志物原位测量的新设备。该设备基于激光诱导荧光发射技术，简称 LIFE。目前的标准采样方法会因开凿、切割和锯切导致样品破碎，以及融化引起的温度变化，从而对样本产生物理影响。这些方法常常导致原位条件的失真。因此，开发一种用于原位检测和表征微生物生命的新方法至关重要。我们已开发出一种新型的非侵入性、非破坏性方法，具有高空间和时间分辨率。激光诱导荧光发射技术的应用基于以下事实：表生环境（如冰面）中栖息着多种生物，其中包括光合生物。这些生物可通过检测基于卟啉的辅助色素——叶绿素A和藻红蛋白的荧光特征进行追踪，其中叶绿素A由蓝光激光激发，藻红蛋白由绿光激光激发。该便携式双波长设备重4.5千克，使用时需架设在三脚架上，并与外部计算机联用。将镜头管对准样品。随后，一束绿色的5毫瓦激光穿过偏振分光镜后照射到样品上，该偏振分光镜将偏振光重新导向至光谱仪的光轴方向。样品发出荧光，图中以红色表示。一半的准直光通过偏振分光棱镜，并经由一个长通滤光片聚焦，该滤光片可去除激光信号。随后，信号通过一个由两个可调节剃刀刀片构成的孔径狭缝。在信号被传感器捕获之前，棱镜将垂直于狭缝孔径的一条细光束在光谱上分离开来。使用蓝光激光重复该步骤。原始数据将自动传输至一台便携式计算机，该计算机也用于软件操作。数据分为三个主要部分。曝光调整需手动完成。此处，曝光时间与信号强度之间的校正呈线性关系。注释栏用于描述样品。在右侧区域，测量一旦完成，原始图像将立即显示。此功能对于在野外进行即时数据评估至关重要。红色区域表示过曝像素，可通过缩短曝光时间来避免。12 位灰度原始图像由于一维狭缝光阑而呈现出空间分量，并由于 CCD 前方的棱镜而呈现出光谱分量。受光学限制的影响，原始图像存在畸变，因此需要通过应用能够识别畸变程度的代码对图像进行裁剪和去畸变处理。接下来，利用532纳米激光进行波长校准。绿光是通过1,064纳米红外激光的倍频产生的。这两种波长均可被CCD检测，因此可以在去畸变图像中计算出每个像素的光谱位置。然后，将图像裁剪至指定的波长范围。对选定像素行中每个像素的灰度值进行计数并求和。灰度值的范围可从0到255。此后，每一像素行对应一个数值。在该图中，来自每像素行的灰度值计数与空间坐标相对应绘制。这使得能够在样品中同时对叶绿素和藻红蛋白进行定量的空间区分。此外，可以从选定的像素行绘制样品的光谱特性。现场设置快速简便。将仪器安装在三脚架上。将镜头筒连接到设备上。连接 Arduino USB 线缆和相机线缆。使用 USB 线缆将外部计算机与仪器连接。调整三脚架的支腿，使镜筒覆盖样品。运行软件，描述样品，并开始测量。对于色素校准，按所示方式从储备液制备一系列稀释梯度。叶绿素A标准储备液需要用丙酮稀释，藻红蛋白则用无菌蒸馏水稀释。后续每种稀释液各需15毫升。将样品用铝箔包裹以避光保存。将叶绿素置于冷冻室保存，藻红蛋白置于冰箱保存，以备后续使用。接下来，按照图示搭建一个高度差为1.5厘米的支架。在聚闪塑料小瓶中加入5毫升最高浓度的稀释液。此体积相当于小瓶中15毫米高的水柱，并测量荧光强度。然后将小瓶置于支架的中间位置，再加入5毫升相同溶液。重复该步骤，再加入5毫升溶液，相当于液柱高度达到45毫米。对叶绿素和藻红蛋白的所有稀释步骤重复该操作流程。由于液体表面需位于LIFE仪器的焦点位置，支架和色谱柱的高度在测量中起着重要作用。从冰川中采集雪和冰样品。此外，从冰川前缘区域采集微生物席样本。在本研究中，选择了位于北极斯瓦尔巴群岛新奥尔松研究设施附近的中洛文冰川（Midtre Lovenbreen）作为采样点。将融化的雪和冰样在GF/F滤膜上进行真空过滤。记录滤过的体积。然后，使用 LIFE 设备在每个滤膜的四个随机区域分别进行三次测量，采用绿色和蓝色激光。通过将面积密度与滤过面积和滤过体积相乘，计算总色素浓度。将色素浓度归一化至一升体积。将滤膜放入含有30毫升丙酮的试管中，于4摄氏度避光条件下过夜保存。接下来，取一支试管，在冰上放置，随后在连续模式下以50%功率超声处理两分钟。挤压并从样品瓶中取出滤膜，滤膜不再需要。将Tygon管连接到注射器上，从样品瓶中吸取叶绿素提取的丙酮混合液。将Tygon管替换为GF5滤光片支架。将溶液转移至石英比色皿中。用丙酮校准吸收光谱仪后，将装有样品的比色皿放入光谱仪中，测定400至750纳米范围内的吸收特征。接下来，从分光光度计中取出比色皿，并向样品中加入 200 微升 2 摩尔的盐酸。然后，重复吸光度测定，以测量样品中脱镁叶绿素的含量。激光测量对细菌群落活性的影响目前尚未详细描述。因此，通过初级和次级生产来研究该效应。对于细菌生产，取五份细菌垫样品，其中三份用于氚标记亮氨酸吸收实验，两份作为对照。用甲醛灭活对照组。向所有等分试样中加入氚标记的亮氨酸。对所有样品重复该操作步骤。此处显示了我们实验设计所需的样品量。接下来，按照实验装置所示，用绿色和蓝色激光照射细菌膜。然后，对所有尚未用甲醛处理的样品进行灭活。将样品转移至冻存管中，并加入三氯乙酸或TCA。在10,000 g离心5分钟。加入闪烁液，然后将冻存管放入聚乙烯闪烁瓶中。使用液体闪烁计数器分析样品，并计算吸收速率。进行光合作用实验时，按前述方法准备五份等量样品，其中两份避光处理。加入放射性示踪剂 NaH¹⁴CO₃，孵育四小时。孵育结束后，用铝箔包裹样品以终止反应。按照之前所述方法，通过液体闪烁计数测量每分钟衰变数。在将数据归一化至一秒钟曝光时间及15毫米样品柱高度后，采用泊松回归计算最终的校准曲线。面积密度与光子计数之间的相关性呈线性关系。该曲线的斜率为81.04，这意味着在曝光一秒钟的样品中，8,104的光子计数率对应于每平方厘米100纳克的藻红蛋白面积密度。高浓度样品中的标准偏差可通过样品内部的自吸收过程来解释。叶绿素A校准曲线表现出类似特征，呈线性关系，斜率为8.94。在进行叶绿素提取及后续的吸收光谱测量以分析叶绿素含量之前，使用LIFE仪器测量了六个经过过滤的冰和雪样品。样品按照分光光度法测得的叶绿素含量进行排序。LIFE 数据显示标准偏差较小，表明滤膜上的物质分布相对均匀。LIFE 仪器对前三个滤膜的叶绿素含量估计偏低。后三种滤膜的叶绿素含量较低，但被LIFE仪器高估了。数据差异的原因在于滤饼的厚度。对于较薄的滤饼（以橙色表示），由于色素的面密度较低，测得的荧光信号也较弱。在此原始图像中，叶绿素A信号以红色显示。该原始图像中的所有灰色区域表明，滤光片本身在透过450纳米长通滤光片后表现出激光诱导信号。软件错误地将此信号计为叶绿素A荧光。由于激光无法诱导滤饼深层中叶绿素A分子的荧光响应，导致高色素含量被低估。激光暴露实验表明，激光对细菌垫的初级和次级生产力无显著影响。无论是5至60秒的暴露时间，还是5至50毫瓦的激光强度，均未对生产力结果产生任何影响。这意味着，产生更强信号所需的更高强度和更长曝光时间不会对细胞造成伤害。现场测量了四个冰尘样本，并将其与在实验室条件下测得的叶绿素标准溶液（以红色显示）进行比较。蓝色所示的光谱荧光峰与叶绿素标准光谱相吻合，从而验证了现场测量的可行性。已对土壤、细菌垫、生物膜和冰尘囊进行了LIFE测量。如果冰尘囊覆盖的表面积超过12.5平方厘米，则可对具有较厚沉积层的冰尘囊进行LIFE测量。这类冰尘囊能够阻隔来自冰层下方的杂散光。在较薄的冰尘层中，荧光信号会被环境光掩盖。因此，LIFE 仪器无法对裸露的冰面进行测量，但可分析所有其他类型的样品。温度变化会增加液态水的可利用性，从而导致冰川表面的生物活性升高。因此，色素浓度可能会增加。监测这些变化并预测可能及很可能出现的未来情景至关重要。

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激光诱导荧光发射（L.I.F.E.）作为新型非侵入性工具，用于在低温层生境中进行生物标志物的原位测量

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