Name: 一个集成拉曼光谱和质谱平台，用于研究单细胞药物接受、代谢和效果 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: 学习整合拉曼光谱与质谱技术，用于单细胞药物摄取、代谢及效应研究。该方法可监测细胞对药物的反应，揭示代谢变化，助力药物发现与癌症耐药性研究。

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作者感谢矢形俊夫的支持，以及归于 Arno Germond 博士名下的理化学研究所内部合作资金。

1. 细胞培养
<ol>
	<li>在适当的培养基中培养目标细胞。可添加青霉素-链霉素以避免污染。对于 HepG2 细胞，使用添加了10%胎牛血清（FBS）和0.1%青霉素-链霉素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）进行培养。为便于进行拉曼光谱检测，可将细胞培养在经0.1%明胶包被的玻璃底培养皿或石英载片上。</li>
	<li>将细胞置于37 °C、5% CO2的湿化培养箱中孵育2天。</li>
	<li>同步细胞培养物，使其达到70%融合度。</li>
	<li>以0.7 × 106的接种密度，将细胞传代至35 mm玻璃底网格培养皿或石英载片中，并使用相同的培养基，在37 °C下孵育24小时。 
	注意：培养皿或载片可预先用胶原蛋白或明胶包被液处理（包被浓度为5 µg/cm2），以促进细胞贴附，确保其在检测过程中的存活。</li>
</ol>
2. 药物处理
<ol>
	<li>从培养箱中取出细胞培养物，用预热的 PBS 缓冲液（37 °C）洗涤 2 次。 
	注意：进行药物处理时，细胞汇合度在 50%–60% 为最佳。</li>
	<li>将细胞分入 35 mm 培养皿中，分为药物处理组和未处理组。</li>
	<li>将所选药物与培养基混合。例如，将他莫昔芬溶解于二甲基亚砜（DMSO）中，再与培养基混合，最终体积为 2 mL，他莫昔芬浓度为 10 µM。此为药物处理组。</li>
	<li>向对照组培养基中加入等体积的溶剂（DMSO），以研究 DMSO 的影响。此为对照组。</li>
	<li>将两组细胞分别在步骤 2.3–2.4 配制的 2 mL 加药培养基中孵育 24 小时。孵育后预期细胞汇合度为 70%–80%。</li>
</ol>
3. 拉曼光谱成像与光谱处理
注意：尽管拉曼光谱系统已有商业化产品，但本研究所使用的拉曼光谱系统为自行搭建的线扫描共聚焦显微镜，此前已有描述7,8。简而言之，该系统配备了一台532 nm的二极管泵浦固体激光器。激光光束通过柱面透镜整形为一平面光，从而可在单次曝光中同时采集400个光谱。拉曼光谱通过安装在多色仪上的冷却CCD相机记录，多色仪采用每毫米1,200条刻线的光栅，以最大化指纹区（500–1,800 cm-1）的光谱分辨率。该光谱区域包含大量与产生拉曼散射的分子特异相关的振动频率。系统还使用了水浸物镜（NA = 0.95）。该系统的空间分辨率约为300 nm，光谱分辨率为1 cm-1。为确保实验过程中细胞的存活，使用了一个固定在电动显微镜载物台上的微型培养腔室。
<ol>
	<li>在进行光谱测量之前，需验证光学元件的对准情况。可使用一个50 µm的小孔来确认小孔与激光位置是否完全重合，并尽可能缩小光谱仪狭缝至最小，使小孔进入狭缝。</li>
	<li>每次实验前，使用乙醇对光谱仪进行校准。具体操作为：将乙醇（EtOH）置于玻璃底培养皿中，在给定的激光强度（在样品处测得）下测量1秒的光谱，并将测得的峰值与已知波长进行关联7。</li>
	<li>将样品处的激光强度最小化至约2.4 mW/µm2，以确保细胞在激光照射下仍能存活。</li>
	<li>将微环境培养室设置为5% CO2 和37 °C。</li>
	<li>显微镜系统准备就绪后，从培养箱中取出细胞，立即用预热的PBS缓冲液（37 °C）清洗细胞2次，然后加入2 mL预热的PBS（37 °C）或DMEM重悬细胞。 
	注意事项：PBS和基于FluoroBrite DMEM的培养基均适用于拉曼光谱测量，因其产生的背景信号极小。</li>
	<li>在浸水物镜上加入10 µL水，然后小心地将玻璃底细胞培养皿放置于显微镜载物台上。</li>
	<li>通过聚焦激光线对每个细胞进行测量。每个细胞曝光15秒足以获得具有清晰拉曼信号的细胞横截面。使用振镜可在几十分钟内扫描单个细胞或一组细胞。 
	注意事项：对细胞进行全光谱成像时，若要求更高分辨率，则需要更长时间，但也可能导致光损伤。本实验采用单线曝光方式获取每个细胞的横截面信息。该方法在提高通量、获取足够用于细胞区分的信息的同时，通过限制光损伤有效保障了细胞活性，是一种良好的权衡策略。</li>
</ol>
4. 光谱数据的预处理与多变量分析
注意：预处理是进行进一步分析前的必要步骤，旨在消除光谱数据中存在的非期望技术变异。由于方法和软件的多样性，无法提供详尽的列表，但文献中已有许多有益的综述7,8。在本节中，我们简要描述用于分析和解释从活体单细胞获得的拉曼光谱数据的方法。
<ol>
	<li>提取并预处理拉曼图像，以去除可能的宇宙射线干扰。 
	注意：在不同天/周/月获得的光谱数据，其光谱轴可能因使用乙醇进行校准时存在微小技术差异而出现波动。这将严重影响后续的多变量分析和统计比较。若实验在不同周/月进行，则预期会出现微小的光学变化。此时，必须对数据进行插值处理，以校正跨实验数据可能存在的光谱偏移。此处采用立方样条插值法。完成此步骤后，所有光谱轴应实现对齐。后续分析采用 500–1,800 cm-1 范围内的光谱。</li>
	<li>使用自编算法从每幅图像中提取细胞及其背景（无细胞区域）的光谱数据。将细胞信号减去背景信号，然后对剩余像素的光谱进行平均，所得结果应代表单个细胞的光谱。以下步骤均基于细胞的二维光谱数据进行。</li>
	<li>采用ModPoly9 或其他被认为足够适用的算法进行基线校正。将光谱范围截取为 600–1,700 cm-1，以选择指纹区，并确保由于多项式拟合不佳导致的光谱边缘效应不会干扰分析结果。</li>
	<li>进行归一化处理，例如向量归一化（将每个波数处的强度除以光谱的整体l2范数或最大奇异值），以标准化光谱强度10，尽管也可考虑其他归一化方法。</li>
	<li>为每个类别/条件准备带有适当标签的数据集。 
	注意：可进行比较性光谱分析，以探索不同细胞类别/条件之间差异的本质（例如，通过将对照组的平均光谱从其他组中减去，识别感兴趣区域[如潜在生物标志物]）。也可进行方差分析（ANOVA）和Fisher得分计算10。</li>
	<li>为基于光谱特征区分处理与未处理细胞，可应用多变量分析方法。应使用归一化后的光谱数据作为训练数据集，若可能，应使用来自重复实验的未知数据集（无标签）作为测试数据。 
	注意：主成分分析的判别分析（PCA-DA10）、潜变量得分投影后接判别分析（PLS-DA）以及支持向量机（SVM）11 是该领域常用的模型，每种模型具有不同的统计考量。应据此进行相应的数据预处理。</li>
	<li>选用符合实验目标的机器学习方法。此处，基于拉曼光谱的指纹区（600–1,710 cm-1）构建潜变量投影结构（PLS）模型11,12。根据需要对数据进行均值中心化处理。对于模型的交叉验证，可采用多种技术。 
	注意：此处采用10折“威尼斯 blinds”交叉验证法。应测试模型复杂度（组分数或潜变量数），以使最优模型的均方根误差（RMSE）最小化。结果表明，三个潜变量（LVs）在本数据集中提供了最佳的区分能力。</li>
	<li>识别哪些拉曼光谱峰对细胞的区分具有贡献（例如，通过绘制每个拉曼波数的投影变量重要性得分[VIP]或回归系数的大小）。 
	注意：变量的VIP得分是通过PLS-DA组分与原始变量之间相关系数平方的加权和计算得到的。有关PLS和VIP得分算法的详细信息可参见相关文献11,12。</li>
</ol>
5. 单细胞取样装置与操作步骤
<ol>
	<li>如图1所示，将细胞取样系统固定在拉曼显微镜上。将三维微操纵器连接至玻璃毛细管 holder，该 holder 连接一个空注射器，用于通过施加负压吸取样品（图1）。</li>
	<li>将显微镜调至高倍视野（40倍），观察玻璃毛细管尖端，确保其未破损。使用微操纵器（x、y、z轴）调节玻璃毛细管的位置。确保毛细管尖端位于视野中央，然后沿z轴向上移动毛细管，为后续放置培养皿预留空间。 
	注意：直径在10–15 µm之间的细胞采用玻璃毛细管进行微量取样。建议使用内径约为5 µm的毛细管。若内径过小，毛细管尖端易被细胞堵塞；若过大，则可能影响后续质谱检测的灵敏度。</li>
	<li>将样品板/培养皿置于显微镜载物台上，调节放大倍数和焦距，在网格培养皿中选择目标细胞并将其移至视野中心。随后，使用微操纵器（z轴）小心降低玻璃毛细管，直至其尖端进入焦点。 
	注意：在毛细管未对焦前，切勿在x轴和y轴方向移动毛细管。</li>
	<li>在显微镜下观察，使毛细管尖端接触目标单个细胞，然后使用注射器施加负压，将细胞吸入毛细管尖端内。如有必要，可通过拍照或录像记录该过程，以精确确认细胞捕获的时间和位置。</li>
	<li>沿z轴向上移动毛细管。然后使用镊子将毛细管从毛细管 holder 上取下，准备进行质谱分析。</li>
</ol>
6. 质谱测量
<ol>
	<li>根据制造商的建议校准质谱仪的质量准确性。校准后，确保质量误差不超过 3 ppm。</li>
	<li>优化质谱仪参数，使其最适合目标分析物。 
	注意：在他莫昔芬和 4-OHT 分析的情况下，仪器参数设置如下：进样毛细管温度：400 °C，喷雾电压：1500 V，自动增益控制目标（AGC）：5.00E+06，S-透镜射频水平：90%，SIM 范围：347–397 m/z，SIM 最大注入时间：200 ms，SIM 分辨率：140,000 FWHM，MS/MS 范围：50–400 m/z，MS/MS AGC 目标值：2.00E+05，MS/MS 最大注入时间：100 ms，MS/MS 分辨率：17,500 FWHM，MS/MS 隔离窗口：1 m/z，MS/MS 归一化碰撞能量（NCE）：35。</li>
	<li>设置一个持续时间为 5 分钟的自动采集方法，用于 SIM 模式以实现相对定量，并设置另一个 MS/MS 方法用于药物及其代谢物的阳性鉴定。采集方法的参数应设置为步骤 6.2 中提到的优化值。</li>
	<li>在通风橱内配制电离溶剂。溶剂组成取决于目标分析物。此处使用的有机溶剂由 80% 甲醇（MeOH）、10% 二甲基亚砜（DMSO）和 0.1% 甲酸组成。</li>
	<li>在测量前，将适量的内标物与有机溶剂混合。本实验中使用 5.31 nM 的 d5-他莫昔芬作为内标物。</li>
	<li>为避免假阳性结果，使用孔径为 1 µm 的毛细管并在持续显微观察下吸取经药物处理的细胞周围的培养基，以避免取样到任何细胞组分。</li>
	<li>使用连接加载尖端的移液器，向含有培养基的毛细管宽端加入 2 µL 电离溶剂。然后通过质谱分析所取样的培养基，检测目标分析物是否存在（通常应无法检出）。</li>
	<li>向含有细胞的毛细管中加入 2 µL 电离溶剂，将毛细管固定至连接到合适质谱仪的纳米电喷雾适配器（nano-ESI），并启动自动采集方法。</li>
</ol>
7. 质谱数据处理与分析
注意：可使用任何合适的软件进行数据分析。然而，如果研究人员希望使用质谱仪供应商未提供的软件进行数据分析，则应首先将原始数据从供应商专有格式转换为开放格式或文本文件（本研究中已执行此步骤）。
<ol>
	<li>通过将目标分析物的峰面积除以同一质谱扫描中内标物的峰面积来对数据进行归一化处理，然后对峰面积比值进行对数转换以减少偏度。</li>
	<li>将药物或其代谢物的归一化强度以箱形图或密度曲线形式绘出，以可视化其在单个细胞间的分布情况。此处使用 R 统计软件及 ggplot2 软件包。</li>
	<li>通过将每个细胞中药物代谢物的丰度除以未代谢母体分子的丰度，计算代谢药物与未代谢药物的比值（例如，分别为 4-OHT 和他莫昔芬）。 
	注意：可进一步研究特定拉曼特征峰的变化与药物或其代谢物质谱峰变化之间的相关性。此外，还可探究药物与其代谢物在单细胞水平上的潜在相关性。可通过双尾检验计算皮尔逊相关系数来实现。也应考虑采用更高级的整合分析方法。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无利益冲突。

在本研究中，选择了一个简单的案例，即HepG2细胞暴露于他莫昔芬（或不暴露）。本文展示了拉曼光谱与质谱系统监测他莫昔芬对细胞作用的能力。拉曼光谱能够识别出反映单个细胞对药物暴露整体响应的潜在生物标志物。观察到单个细胞之间存在一定的异质性，提示部分细胞对他莫昔芬暴露无响应。另一方面，激光扫描细胞质谱（LSC-MS）能够在单细胞水平上对药物及其代谢产物进行靶向分析，结果显示药物及其代谢产物的丰度存在高度异质性。这种异质性有助于解释为何尽管细胞来源于一个理论上均一的群体，但部分细胞受到药物影响，而另一些细胞则似乎未受影响12。
在该技术的诸多需要注意的方面中，重要的是评估显微镜设置和信号处理的质量，以确保数据的可重复性。如果对光谱进行仔细的预处理，信号变化应在每个峰的局部最大值处达到最大化。相比之下，不同测试细胞条件下的光谱基线和边缘应相互重叠。另一个重要方面是用于分析不同处理之间差异的多变量模型。必须仔细评估模型及其参数，以确保分析的精确性和准确性。与神经网络不同，PLS 模型的一个优势在于，它能够提供与每个波长（拉曼位移）相关的权重信息，从而揭示最能区分模型中所测试条件的特征波长。
尽管拉曼光谱能够成功区分药物反应，但需要强调的是，该技术在提供生物学解释方面存在局限性。这主要是由于光谱信号的复杂性，其包含了数千种分子的混合信号。因此，还需进一步研究以评估拉曼光谱强度变化与药物浓度变化之间的系统性关联。此外，还需对其他细胞系开展类似研究，以评估与他莫昔芬相关的光谱生物标志物的普适性。
此外，对活体组织进行测量以评估药物动力学并研究药物在每个细胞内的渗透和流动情况可能具有重要意义。同时需要注意的是，LSC-MS 中的采样步骤高度依赖操作人员的技术水平。诸如空间分辨率、采样后细胞在毛细管内的位置以及通量强度等参数完全依赖于操作者，这限制了 LSC-MS 的大规模应用。尽管如此，自动化采样系统可能有助于缓解这一问题。此外，虽然 LSC-MS 在采集处于天然状态的贴壁细胞或悬浮细胞方面表现优异，但在采集嵌入组织切片中的细胞时效果较差。这是由于当样品密度较高时，采样毛细管尖端容易断裂。因此，在此类情况下，采用单探针等其他方法可能更为合适14,15。
由于本实验所用细胞是在环境条件下采集且样品前处理极少，因此LSC-MS可轻松与其他技术整合，例如本方案中展示的与拉曼光谱的联用。另一种与三维全息技术的类似整合已实现了亚细胞水平上细胞代谢物的绝对定量16。此外，与流式细胞术的联用已帮助揭示了神经母细胞瘤患者单个循环肿瘤细胞中的代谢生物标志物17,18。
未来，随着人们对整合不同成像模式数据集的兴趣日益增加19，利用综合计算方法研究拉曼信号与质谱结果（以及其他组学方法）之间的系统性差异也可能成为关注的重点。有趣的是，我们已经发现，通过VIP评分鉴定出的拉曼峰强度与通过质谱在单细胞水平鉴定出的他莫昔芬或其代谢物丰度之间存在多个虽弱但具有统计学意义的线性相关性4。这些数据可能提示质谱图谱与拉曼光谱之间存在代谢关联，并表明这些数值具有可预测性。

在单细胞水平上，细胞对微环境变化的响应各不相同，这一现象被称为细胞异质性1。然而，目前的药物发现研究依赖于对细胞群体的平均测量，这掩盖了有关潜在亚群以及单细胞变异的信息2。这种缺失的信息可能解释了为何某些细胞对药物更敏感，而另一些细胞则具有耐药性。有趣的是，缺乏关于药物反应的单细胞信息可能是药物II期临床试验失败的一个潜在原因3。因此，为解决这一问题，必须在单细胞水平上测量细胞与药物之间的相互作用（即药物摄取、代谢和响应）。
为实现这一目标，我们设计了一种独特的系统，该系统首先利用无标记拉曼光谱对活体单细胞进行筛选，随后通过质谱技术进行进一步表征4。拉曼光谱可提供细胞状态的分子指纹，这种复杂的光谱源自细胞内多种分子的共同贡献。尽管其复杂，但拉曼指纹图谱可被视为反映整个细胞结构与代谢状态的综合信息5,6。拉曼光谱在以非侵入性方式、相对高通量地测量细胞状态方面具有显著优势，因此适用于在单细胞水平上进行药物反应的筛选与评估。
相比之下，质谱法（MS）具有在单细胞水平上测量药物摄取所需的灵敏度和选择性。由于质谱法具有破坏性（样品（细胞）通常在分析过程中被消耗），将其与非破坏性、无需标记的拉曼光谱技术相结合，可构建一个高通量且灵敏的分析系统。这种联合平台能够在单细胞水平上提供关于药物摄取、代谢及其效应的更全面信息。
本文阐述了一种利用体外培养结合集成拉曼-质谱（Raman-MS）平台，在单细胞水平上研究细胞与药物相互作用的实验方案。该研究以肝细胞癌细胞（HepG2）和他莫昔芬作为模型。选择HepG2细胞的原因在于其能够摄取并代谢他莫昔芬，同时该药物的肝毒性作用也会对其产生影响。本研究中使用两种状态：药物处理组细胞与未处理组细胞 与 未经处理的细胞（对照）

<table><tbody><tr><td>0.1% 青霉素-链霉素</td><td>Nacalai Tesque</td><td>09367-34</td><td></td></tr><tr><td>35 mm 玻璃底网格培养皿</td><td>Matsunami</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-羟基他莫昔芬标准品</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>94873</td><td></td></tr><tr><td>532 nm 半导体泵浦固体激光器</td><td>Ventus, Laser Quantum</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BIOS-L101T-S 电动显微镜载物台</td><td>OptoSigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CT-2 Cellomics 涂层采样毛细管</td><td>HUMANIX</td><td></td><td></td></tr><tr><td>d5-他莫昔芬标准品</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>色谱-质谱级二甲基亚砜</td><td>Nacalai Tesque</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf GELoader 吸头</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Hyclone laboratories</td><td>SH3006603</td><td></td></tr><tr><td>FluoroBrite DMEM 培养基</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>色谱-质谱级甲酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>33015</td><td></td></tr><tr><td>HepG2 细胞系 (RCB1886)</td><td>RIKEN 细胞库中心</td><td>RCB1886</td><td></td></tr><tr><td>MC0-19A1C 型培养箱</td><td>Sanyo Electric Co.</td><td>MC0-19A1C</td><td></td></tr><tr><td>色谱-质谱级甲醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1060352500</td><td></td></tr><tr><td>MMO-203 三维显微操作器</td><td>Narshige</td><td>MMO-203</td><td></td></tr><tr><td>NA:0.95, UPL40 水浸式 Olympus 物镜</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanoflex 纳米电喷雾电离适配器</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ES071</td><td></td></tr><tr><td>载物台培养箱</td><td>ibidi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pierce LTQ Velos ESI 校准溶液</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88323</td><td></td></tr><tr><td>PIXIS BR400 制冷 CCD 相机</td><td>Princeton Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Q-Exactive Orbitrap 质谱仪</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>大鼠尾胶原包被溶液</td><td>Cell Applications Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>他莫昔芬标准品</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85256</td><td></td></tr></tbody></table>

一种集成拉曼光谱与质谱技术的平台用于研究单细胞药物摄取、代谢及效应

An Integrated Raman Spectroscopy and Mass Spectrometry Platform to Study Single-Cell Drug Uptake, Metabolism, and Effects

已知细胞对药物的反应具有内在的异质性。因此，在药物发现研究中必须考虑单细胞水平的异质性。这可以通过在单细胞层面精确测量细胞与药物之间的多种相互作用（即药物摄取、代谢及其效应）来实现。本文介绍了一种结合单细胞拉曼光谱与质谱（MS）的技术平台，用于监测细胞对药物刺激产生的代谢变化。利用该平台，可通过拉曼光谱检测细胞对药物的代谢响应，同时在同一细胞中使用质谱技术对药物及其代谢产物进行定量分析。结果表明，该方法能够获取单细胞水平下药物摄取、代谢及细胞响应的相关信息。

对药物相互作用（摄取、代谢和效应）进行单细胞分析，对于发现潜在的或耐药的亚群以及理解细胞异质性的影响至关重要。在本方案中，采用两种互补技术在单细胞水平上测量上述相互作用：拉曼光谱和质谱（MS）。拉曼光谱技术可根据药物反应的光谱生物标志物快速识别受药物影响的细胞；质谱则用于选择性且半定量地监测药物的摄取与代谢情况。实验首先通过拉曼光谱对细胞进行筛选，随后对单个细胞进行取样，并用于质谱分析。
各条件（有无药物处理）平均光谱的比较分析如图2所示。两种条件的平均光谱在多个峰位上存在明显差异，这些峰位此前已被鉴定并归属于特定的分子化合物2。特别是位于1000 cm-的峰（归属于苯丙氨酸和酪氨酸等芳香族化合物）显示出显著差异。统计学差异的显著性需通过进一步的多变量分析进行评估。
随后利用该数据集训练一个偏最小二乘（PLS）模型（步骤 4.5–4.8），旨在区分两种细胞处理方式（加药组：n = 290，未加药组：n = 115）。在测试数据中（相对于经交叉验证训练的模型为未知样本），该模型对在存在他莫昔芬条件下培养的细胞进行分类的预测能力达到100%的灵敏度和72%的特异性。灵敏度是指模型正确识别出的真阳性样本所占的比例，而特异性是指模型正确识别出的真阴性样本所占的比例。其他模型如支持向量机（SVM）、线性判别分析（LDA）和神经网络可能提供相似或更优的结果，但本研究尚未进行全面比较。
基于PLS模型计算了VIP得分，该得分代表了不同波长（拉曼位移）在区分实验条件中的重要性（图3）。重要的是，VIP谱图中的最高峰对应于在两种处理之间表现出显著差异的拉曼峰，这证实了处理组与未处理组细胞之间存在特异性的分子差异。因此，研究人员可以识别出可能反映单细胞对药物处理响应的光谱生物标志物。这些生物标志物可进一步验证其生物学意义以及在不同条件和细胞系中的普适性。
活细胞单细胞质谱（LSC-MS）系统能够检测经药物处理的单个 HepG2 细胞中的药物及其代谢物，这些细胞此前已通过拉曼光谱进行过测量。此外，可采用串联质谱（tandem MS）对这两种分子的结构进行确认。在完成正向鉴定后，分别测量每个细胞中药物及其代谢物的相对丰度，并与未处理细胞中的背景峰进行比较。他莫昔芬丰度表现出显著的异质性，其代谢物 4-OHT 的情况尤为明显（图 4）。同时研究了他莫昔芬丰度与其代谢物之间的关系，发现两者之间存在显著的正相关性（r = 0.54，p = 0.0001，n = 31）。
<img alt="配备体视显微镜和三维微操作器的显微镜系统，用于科研中精确的样品操作。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60449/60449fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：安装在显微镜载物台上的细胞挑选系统。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60449/60449fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="拉曼光谱图，强度与位移关系，药物效应比较，光谱分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60449/60449fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：经药物处理的细胞（含他莫昔芬：n = 295）与未处理细胞（不含他莫昔芬：n = 115）的平均光谱。 拉曼峰可从文献中识别。如先前所述4，大多数显著的光谱差异具有统计学意义（ANOVA，p ≤ 0.5）。本图改编自先前发表的研究4。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60449/60449fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="拉曼光谱图；VIP 分数与拉曼位移；蛋白质和脂质峰，光谱分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60449/60449fig3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 3"> 
图 3：从预测性 PLS 模型中提取的 VIP 分数。 VIP 分数反映了在模型中区分两个类别时具有贡献的波长。大多数峰对应于特定分子，这些分子可作为药物对给药细胞作用的光谱生物标志物。本图经改编自先前发表的研究4。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60449/60449fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="比较处理对生物样本中标准化丰度影响的箱线图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60449/60449fig4.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 4"> 
图 4：他莫昔芬及其代谢产物丰度的分布情况。 他莫昔芬及其代谢产物4-羟基他莫昔芬（4-OHT）（在单细胞水平测定）的丰度分布，与未经处理细胞（对照组）中的内源性峰进行比较。本图改编自先前发表的研究4。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60449/60449fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本方案介绍了一种集成拉曼光谱-质谱（MS）平台，可实现单细胞分辨率。拉曼光谱可用于研究细胞对药物的响应，而质谱则可用于药物摄取与代谢的靶向定量分析。

已知细胞对药物的反应具有内在的异质性。因此，在研究中必须考虑单细胞水平的异质性。

我们开发了一种用于代谢组学的创新方法。该方法将活细胞的钟楼光谱成像与单细胞质谱技术相结合。我们的技术能够监测并预测单个细胞对药物的代谢变化。这为基本研究和工业应用开辟了众多可能性。我们的方法将单细胞分辨率引入当前的药物评估技术中，将极大促进未来的药物发现工作。我们的技术还可以帮助我们理解细胞异质性在癌症耐药性中所起的作用。单细胞取样和数据分析是本实验中最具挑战性的两个环节。我们目前正在致力于实现这两个步骤的自动化，尤其是取样部分。我们建议您在正式实验前充分练习单细胞取样操作，因为每套显微操作系统的配置略有不同，您需要花时间熟悉其控制方式。待细胞培养至70%融合度后，将目标细胞在适当的培养基中进行培养，并添加青霉素-链霉素以防止污染。使用血细胞计数板测定细胞密度后，以每毫升0.7×10⁶的接种密度将细胞传代至35毫米玻璃底网格培养皿或石英载玻片中，培养基与原培养相同。随后在37°C条件下孵育24小时。第二天，细胞融合度达到50%至60%。用预热至37摄氏度的PBS缓冲液洗涤细胞两次。将细胞分入35毫米培养皿中，分为药物处理组和未处理组。将溶于二甲基亚砜的他莫昔芬与培养基混合，终体积为2 mL，他莫昔芬终浓度为10 µM。这是药物处理组。将相应体积的DMSO加入培养基中作为对照组，以研究DMSO的影响。将两组样本分别在2 mL含药物的培养基中孵育24小时，使细胞融合度达到70%至80%。在进行光谱测量前，使用靶标验证针孔和激光位置是否一致。每次实验前校准分光光度计时，将乙醇加入玻璃底培养皿中，在给定激光强度下测量一秒钟的光谱，并将峰值与已知波长关联。然后将微环境培养室设置为5%二氧化碳和37摄氏度。显微镜系统准备就绪后，从培养箱中取出细胞，并立即用预热至37摄氏度的PBS缓冲液冲洗细胞两次。然后加入 2 毫升预热的 PBS 或 FluoroBrite DMEM。在浸液物镜上加入 10 微升水。轻柔地将玻璃底细胞培养皿放置在显微镜载物台上。将细胞采样系统固定到拉曼显微镜上。将三维显微操作器连接至固定在空注射器上的玻璃毛细管支架，用于样品吸取。将显微镜调至40倍高倍视野，观察玻璃毛细管尖端，确保其未破损。使用显微操作器控制玻璃毛细管的位置。确保毛细管尖端位于视野中央。然后沿Z轴向上移动毛细管，以便后续为培养皿留出操作空间。将样品皿放置在显微镜载物台上，调节放大倍数和焦距，在网格皿上选择目标细胞，并将其移至视野中心。通过聚焦激光线对每个细胞进行测量。每个细胞15秒的曝光时间足以获得具有清晰拉曼信号的细胞横截面。使用振镜可在几十分钟内对一个细胞或一群细胞进行扫描。然后使用显微操作器小心地降低玻璃毛细管，直至其尖端进入焦点。在显微镜观察下，用毛细管尖端接触目标单个细胞。然后使用注射器施加负压，将细胞捕获在毛细管尖端内。通过录像记录该操作过程，以精确检查细胞捕获的时间和位置。沿Z轴方向向上移动毛细管。然后用镊子将毛细管从毛细管架上取下，准备进行质谱分析。设置好质谱仪并分析培养基后，向含有细胞的毛细管中加入两微升电离溶剂。将毛细管固定到连接至合适质谱仪的纳米电喷雾接口上，并启动自动采集方法。此处展示了有无药物处理条件下各组平均光谱的比较分析。两种条件下的平均光谱在多个峰位上存在明显差异。特别是位于1,000 cm⁻¹处的峰，该峰是苯丙氨酸和酪氨酸等芳香族化合物的特征信号，显示出显著差异。基于潜在结构模型的投影，计算了VIP评分，该评分代表了各波长在区分实验条件中的重要性。重要的是，VIP谱图中的最高峰对应于拉曼峰，而在两种处理之间这些拉曼峰表现出显著差异。这证实了经处理与未经处理的细胞之间存在特异性的分子差异。在确定阳性鉴定后，测量了每种细胞中药物及其代谢产物的相对丰度，并与未经处理细胞中的背景峰进行比较。他莫昔芬的丰度表现出显著差异，而其代谢产物4-羟基他莫昔芬的情况这一现象更为明显。研究人员可能对探索光谱图像与细胞代谢谱之间的关联感兴趣。我们的研究还具有工业应用价值，因为它能够对制药生产中的细胞进行局部筛选。在为质谱测量制备电离溶剂时，必须格外小心。应在通风橱中进行配制。同时，切勿触碰质谱仪的离子源，以免触电。最后，测量过程中使用的采样毛细管非常尖锐，操作时需小心谨慎，避免受伤。

an-integrated-raman-spectroscopy-mass-spectrometry-platform-to-study

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

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