一种集成拉曼光谱与质谱技术的平台用于研究单细胞药物摄取、代谢及效应

我们开发了一种用于代谢组学的创新方法。该方法将活细胞的钟楼光谱成像与单细胞质谱技术相结合。我们的技术能够监测并预测单个细胞对药物的代谢变化。

这为基本研究和工业应用开辟了众多可能性。我们的方法将单细胞分辨率引入当前的药物评估技术中，将极大促进未来的药物发现工作。我们的技术还可以帮助我们理解细胞异质性在癌症耐药性中所起的作用。

单细胞取样和数据分析是本实验中最具挑战性的两个环节。我们目前正在致力于实现这两个步骤的自动化，尤其是取样部分。我们建议您在正式实验前充分练习单细胞取样操作，因为每套显微操作系统的配置略有不同，您需要花时间熟悉其控制方式。

待细胞培养至70%融合度后，将目标细胞在适当的培养基中进行培养，并添加青霉素-链霉素以防止污染。使用血细胞计数板测定细胞密度后，以每毫升0.7×10⁶的接种密度将细胞传代至35毫米玻璃底网格培养皿或石英载玻片中，培养基与原培养相同。随后在37°C条件下孵育24小时。

第二天，细胞融合度达到50%至60%。用预热至37摄氏度的PBS缓冲液洗涤细胞两次。将细胞分入35毫米培养皿中，分为药物处理组和未处理组。将溶于二甲基亚砜的他莫昔芬与培养基混合，终体积为2 mL，他莫昔芬终浓度为10 µM。

这是药物处理组。将相应体积的DMSO加入培养基中作为对照组，以研究DMSO的影响。将两组样本分别在2 mL含药物的培养基中孵育24小时，使细胞融合度达到70%至80%。在进行光谱测量前，使用靶标验证针孔和激光位置是否一致。

每次实验前校准分光光度计时，将乙醇加入玻璃底培养皿中，在给定激光强度下测量一秒钟的光谱，并将峰值与已知波长关联。然后将微环境培养室设置为5%二氧化碳和37摄氏度。显微镜系统准备就绪后，从培养箱中取出细胞，并立即用预热至37摄氏度的PBS缓冲液冲洗细胞两次。

然后加入 2 毫升预热的 PBS 或 FluoroBrite DMEM。在浸液物镜上加入 10 微升水。轻柔地将玻璃底细胞培养皿放置在显微镜载物台上。

将细胞采样系统固定到拉曼显微镜上。将三维显微操作器连接至固定在空注射器上的玻璃毛细管支架，用于样品吸取。将显微镜调至40倍高倍视野，观察玻璃毛细管尖端，确保其未破损。

使用显微操作器控制玻璃毛细管的位置。确保毛细管尖端位于视野中央。然后沿Z轴向上移动毛细管，以便后续为培养皿留出操作空间。

将样品皿放置在显微镜载物台上，调节放大倍数和焦距，在网格皿上选择目标细胞，并将其移至视野中心。通过聚焦激光线对每个细胞进行测量。每个细胞15秒的曝光时间足以获得具有清晰拉曼信号的细胞横截面。

使用振镜可在几十分钟内对一个细胞或一群细胞进行扫描。然后使用显微操作器小心地降低玻璃毛细管，直至其尖端进入焦点。在显微镜观察下，用毛细管尖端接触目标单个细胞。

然后使用注射器施加负压，将细胞捕获在毛细管尖端内。通过录像记录该操作过程，以精确检查细胞捕获的时间和位置。沿Z轴方向向上移动毛细管。

然后用镊子将毛细管从毛细管架上取下，准备进行质谱分析。设置好质谱仪并分析培养基后，向含有细胞的毛细管中加入两微升电离溶剂。将毛细管固定到连接至合适质谱仪的纳米电喷雾接口上，并启动自动采集方法。

此处展示了有无药物处理条件下各组平均光谱的比较分析。两种条件下的平均光谱在多个峰位上存在明显差异。特别是位于1,000 cm⁻¹处的峰，该峰是苯丙氨酸和酪氨酸等芳香族化合物的特征信号，显示出显著差异。

基于潜在结构模型的投影，计算了VIP评分，该评分代表了各波长在区分实验条件中的重要性。重要的是，VIP谱图中的最高峰对应于拉曼峰，而在两种处理之间这些拉曼峰表现出显著差异。这证实了经处理与未经处理的细胞之间存在特异性的分子差异。

在确定阳性鉴定后，测量了每种细胞中药物及其代谢产物的相对丰度，并与未经处理细胞中的背景峰进行比较。他莫昔芬的丰度表现出显著差异，而其代谢产物4-羟基他莫昔芬的情况这一现象更为明显。

研究人员可能对探索光谱图像与细胞代谢谱之间的关联感兴趣。我们的研究还具有工业应用价值，因为它能够对制药生产中的细胞进行局部筛选。在为质谱测量制备电离溶剂时，必须格外小心。

应在通风橱中进行配制。同时，切勿触碰质谱仪的离子源，以免触电。最后，测量过程中使用的采样毛细管非常尖锐，操作时需小心谨慎，避免受伤。