利用CyanoGate模块化克隆工具包通过接合进行蓝细菌的遗传改造

蓝细菌是一类重要的光合微生物，在合成生物学和可再生生物技术应用中正日益被视为有用的平台。因此，开发高效的技术以简化异源DNA在不同蓝细菌物种中的设计、克隆和导入具有重要意义。本技术演示了一种成熟的方法——接合转移（又称三亲本杂交），用于将DNA导入那些天然不具备转化能力的蓝细菌物种中。

接合转化已在多种蓝细菌菌株中成功实现，包括单细胞和多细胞丝状种类。如果您是首次尝试该技术，请务必小心操作您的蓝细菌和大肠杆菌菌株。例如，离心速度不得超过方案中给出的数值，且不要进行涡旋振荡。

对于初次使用者而言，混合细菌与蓝细菌可能看似奇怪。我们希望通过演示接合过程，帮助澄清这一问题。在构建一级装配体后，选择一个合适的T级受体载体。

选择合适的末端连接片段，将最终一级组装产物的3'端连接至T级载体骨架。若要将一个或多个一级组装产物组装到T级载体中，请准备含有PBI1和所需末端连接片段载体的反应混合物。设置PCR仪程序，并按照文中的方法进行操作。

第一天，通过接种无菌的 Synechocystis PCC 6803 或 Synechococcus elongatus UTEX 2973 新鲜培养物来培养蓝细菌。用灼烧灭菌的接种环从无菌 BG-11 琼脂平板上刮取菌体，转移至含有 50 毫升新鲜 BG-11 培养基的 100 毫升锥形瓶中进行接种。将锥形瓶置于光照摇床中，在 30 摄氏度、100 转/分钟的条件下培养 Synechocystis PCC 6803 细胞。

对于集胞藻属长链种 UTEX 2973，将细胞培养物在 40 摄氏度、100 RPM 条件下培养。培养一至两天后，取一毫升细胞培养物，在分光光度计上测定。在 OD 750 处的吸光度达到 0.5 至 1.5。

第二天，将含有 PRK24 和 PRL528 载体的 MC1061 E.coli 辅助菌株接种至 5 毫升 LB 培养基中，其中添加氨苄青霉素至终浓度为 100 微克/毫升，氯霉素至终浓度为 25 微克/毫升。在 37 摄氏度、225 RPM 条件下于摇床培养箱中过夜培养。随后，将携带 T 级货物载体的 E.coli 菌液接种至 5 毫升含有适当抗生素的 LB 培养基中。

在摇床培养箱中，37摄氏度、225转/分钟条件下过夜培养。第三天，在室温下以3,000 ×g离心辅助菌和载体菌的大肠杆菌过夜培养物10分钟。弃去上清液，注意不要扰动菌体沉淀。

通过加入5毫升不含抗生素的新鲜LB培养基洗涤菌体沉淀。用移液器轻轻吹打使沉淀重悬，然后离心以去除上清液。重复此洗涤步骤三次，以彻底清除过夜培养物中残留的抗生素。

最后一次洗涤后，将细胞沉淀重悬于初始培养液体积一半的LB培养基中。然后，在一个2毫升离心管中混合450微升辅助菌株与450微升运载菌株，并于室温放置。接下来，通过在室温下以1,500 ×g离心1毫升集胞藻培养物10分钟，制备集胞藻培养物。

然后小心弃去上清液，注意不要扰动细胞沉淀。用与初始体积相同的无菌 BG-11 培养基重悬沉淀，洗涤四次。取 900 微升洗涤后的蓝细菌培养物，加入含有 900 微升混合大肠杆菌菌株的 2 毫升离心管中。

通过轻轻吹打混匀培养物。将混合物在室温下孵育30分钟（集胞藻PCC 6803）或2小时（细长聚球藻UTEX 2973）。在室温下以1,500 g离心10分钟。

移除1.6毫升上清液，并将沉淀物重悬于剩余的上清液中。在不含抗生素的LB BG-11琼脂平板上放置一个0.45微米的膜滤器。用无菌涂布棒或无菌弯头枪头，将200微升大肠杆菌/蓝细菌培养混合物小心地涂布在膜上。

用石蜡膜密封平板，将平板置于光照培养箱中培养24小时。24小时后，使用火焰灭菌的镊子小心地将膜转移至含有适当抗生素的新鲜BG-11琼脂平板上，以筛选载体。用石蜡膜密封平板，并在与之前相同的条件下继续培养，直至菌落出现。

集落通常在接种后7-14天出现于集胞藻PCC 6803，而长椭圆集胞藻UTEX 2973则在3-7天内出现。为筛选接合子，使用经加热灭菌的接种针，从膜上挑选至少两个独立的集落，并划线接种至含有适当抗生素的新BG-11琼脂平板上。随后，将蓝细菌培养物划线接种至含有5毫升LB培养基的15毫升离心管中，并在摇床培养箱中于37°C、225 RPM条件下过夜培养。

无菌培养结果证实无大肠杆菌污染。经过七天的充分生长后，挑取单个无菌落建立液体培养物，用于长期冷冻保存或后续实验。本研究展示了金门克隆组装工作流程。

在将连接反应产物转化后，通过标准的蓝白斑筛选大肠杆菌菌落来鉴定成功的连接产物。随后，将一级载体和末端连接一载体中的eYFP表达盒组装到一个T级接受载体中，获得cpcBA-eYFP载体。通过限制性酶切验证组装得到的cpcBA-eYFP载体。

成功接合转移cpcBA-eYFP或pPMQAK1-T载体后，在Synechocystis PCC 6803和Synechococcus elongatus UTEX 2973的膜上可观察到多达数百个菌落的生长。正如预期的强Pcpc560启动子作用，与阴性对照相比，酶标仪测得的归一化eYFP荧光值以及流式细胞仪测得的单个细胞eYFP荧光值均较高。无论是使用酶标仪还是流式细胞仪检测，Synechococcus elongatus UTEX 2973的荧光值均高于Synechocystis PCC 6803。

根据您正在进行接合的菌株，确保孵育时间不少于最短所需时间。