Name: 使用CyanoGate模块化克隆工具包进行共生对蓝藻的遗传改造 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: 学习使用CyanoGate模块化克隆工具包和接合转移技术对蓝藻进行遗传改造的方法。本研究展示了在Synechocystis PCC 6803和Synechococcus elongatus UTEX 2973中成功构建和转移cpcBA-eYFP载体的完整流程。

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作者感谢 PHYCONET 生物技术和生物科学研究理事会（BBSRC）工业生物技术和生物能源网络（NIBB）以及工业生物技术创新中心（IBioIC）提供的资金支持。GARG、AASO 和 AP 分别感谢 BBSRC EASTBIO 联合培养博士项目（资助号 BB/M010996/1）、国家科学技术委员会（CONACYT）博士项目以及 IBioIC-BBSRC 协同培训合作伙伴关系（CTP）博士项目提供的经费支持。我们感谢伦敦玛丽女王大学的 Conrad Mullineaux 以及哥本哈根大学的 Poul Eric Jensen 和 Julie Annemarie Zita Zedler 提供质粒载体、实验方案及相关建议。

作者无任何利益冲突需要披露。

与其他载体组装方法相比，Golden Gate 组装在可扩展性方面具有多项优势20,21。然而，在实验室中建立 Golden Gate 系统需要一定时间来熟悉各种元件、受体载体文库以及整体的组装流程。对于更复杂的组装任务，或在并行进行大量复杂组装时（例如，构建包含多个基因表达盒的 Level T 载体系列），通常需要进行周密的规划。我们建议首先列出所需的所有基因表达盒组合，然后在计算机上模拟从 Level 0 到 Level T 的工作流程。在此过程中，用户应考虑 Plant MoClo 试剂盒中提供的 Level 1 &#34;Dummy&#34; 元件，这些元件可用于在 Level T 中组装非连续的 Level 1 载体（例如，Level 1 第1位和第3位的载体可与 &#34;Dummy&#34; 元件第2位一起组装），从而减少所需的总体组装反应次数和克隆步骤15。
DNA合成通常是构建新的0级元件最简单的方法...

蓝细菌是一类自养细菌，可用于生物合成多种天然及异源高价值代谢产物1,2,3,4,5,6。尽管如此，要提升其商业应用潜力仍需克服若干障碍，其中最显著的是与异养生物平台（如 Escherichia coli 和酵母）相比，其产物产量相对较低7。近年来，随着可用于蓝细菌的基因工程工具不断增多，以及合成生物学理念在蓝细菌研究中的广泛应用，这些挑战正逐步得到解决，蓝细菌作为高效生物制造平台的开发也得以进一步推进8,9,10。
将DNA导入蓝细菌的主要方法包括转化、接合和电穿孔。通过转化或电穿孔转移至蓝细菌的载体为&#34;自杀型&#34;载体（即能够介导同源重组的整合型载体），而自复制型载体则可通过转化、接合或电穿孔的方式转移至蓝细菌。对于前者，已有适用于自然转化模式物种的基因操作方案11。最近，一种名为CyanoGate的蓝细菌模块化克隆（MoClo）工具包已被开发出来，该工具包采用标准化的Golden Gate载体组装方法，可用于基于自然转化、电穿孔或接合的蓝细菌基因工程12。
近年来，黄金门（Golden Gate）型组装技术日益流行，目前已有适用于多种生物的组装标准和元件库可供使用13,14,15,16,17. Golden Gate 克隆技术利用 IIS 型限制性内切酶（例如 BsaI、BpiI、BsmBI、BtgZI 和 AarI）以及一系列受体载体和独特的黏性末端，实现多个 DNA 序列的定向、层级化组装 &#34;一锅法&#34; 连接反应。IIS型限制性内切酶识别一段独特的不对称序列，并在其识别位点之外的特定距离处切割，产生一个交错的末端。 &#34;黏性末端&#34; 切割（通常产生4个核苷酸[NT]突出端），可随后用于驱动有序的DNA组装反应15,18这促进了由通用语法规则（如 PhytoBricks 标准）定义的大量模块化 Level 0 部件（例如启动子、开放阅读框和终止子）文库的构建190级元件可轻松组装成1级表达盒，随后可在选定的受体载体中构建更复杂的高阶组装体（如多基因表达载体）12,15黄金门（Golden Gate）型组装技术的一个关键优势在于其适用于DNA合成工厂等高通量设施的自动化操作。20,21，这使得能够测试那些难以通过人工操作实现的复杂实验设计。
CyanoGate 基于已建立的植物 MoClo 系统构建12,15为了将新元件加入CyanoGate系统，必须首先对元件序列进行驯化，即 &#34;非法&#34; BsaI 和 BpiI 的识别位点必须被去除。对于编码开放阅读框（即编码序列，CDS）的片段，可通过在序列中引入同义突变（即将密码子替换为编码相同氨基酸残基的其他密码子）来破坏这些识别位点。该操作可通过多种方法实现，包括从DNA合成到基于聚合酶链式反应（PCR）扩增的策略（如Gibson组装）等。22根据所使用的表达宿主，应避免引入稀有密码子，以防影响翻译效率23去除启动子和终止子序列中的识别位点通常风险较高，因为这些修饰可能影响其功能，导致元件无法按预期发挥作用。例如，对启动子内潜在的转录因子结合位点或核糖体结合位点的改动，可能改变其启动强度以及对诱导或抑制的响应性。同样，对终止子关键结构特征（如富含GC的茎环结构、环状区域和poly-U尾部）的修饰，可能改变终止效率，进而影响基因表达。24,25尽管已有多种在线资源可用于预测启动子和终止子序列的活性，并判断所提出的突变是否会影响其功能表现26,27，这些工具通常难以准确预测蓝细菌中的表现28,29,30.因此，仍建议对修饰后的元件进行体内表征以确认其活性。为了协助难克隆序列的克隆，CyanoGate 包含一种基于 BioBrick 载体 pSB4K5 的低拷贝克隆接受载体12,16,31此外，一个 &#34;设计与构建&#34; 可通过爱丁堡基因组工场（Edinburgh Genome Foundry）的门户进行载体设计（dab.genomefoundry.org）。最后但最重要的是，CyanoGate 包含两种 Level T 接受载体设计（相当于 Level 2 接受载体）15 用于将DNA导入蓝细菌的自杀型载体，或可在多种蓝细菌中自我复制的广宿主范围载体32,33,34.
本文将重点描述一种用于生成T级自我复制载体，并通过接合（也称为三亲交配）对集胞藻（Synechocystis）PCC 6803和长椭圆聚球藻（Synechococcus elongatus）UTEX 2973（下文简称Synechocystis PCC 6803和S. elongatus UTEX 2973）进行遗传改造的实验方案。细菌细胞间的DNA接合转移是一种已被充分描述的过程，此前已被用于蓝细菌物种的基因工程改造，特别是那些不具备天然感受态的菌株，例如S. elongatus UTEX 297335,36,37,38,39,40,41。简而言之，将蓝细菌培养物与携带待转移载体（即&#34;货物&#34;载体）的大肠杆菌（E. coli）菌株共同孵育，同时提供用于介导接合的载体（可位于同一E. coli菌株中，或分布于其他菌株中），即&#34;动员&#34;载体和&#34;辅助&#34;载体。接合转移的发生需要满足四个关键条件：1）参与DNA转移的细胞之间必须有直接接触；2）货物载体必须与接合系统兼容（即必须含有合适的转移起始位点（oriT），也称为移动性基础（bom）位点）；3）必须存在并在货物或辅助载体中表达一种DNA切口蛋白（例如由mob基因编码），该蛋白可在oriT位点切割DNA，以启动单链DNA向蓝细菌细胞内的转移；4）转移的DNA在受体蓝细菌中不能被降解（即必须能够抵抗例如限制性内切酶活性等导致的降解）35,42。为了使货物载体能够在受体细胞中持续存在，其复制起始位点必须与受体蓝细菌相容，以支持其自我复制，并在细胞分裂后传递至子代细胞。为满足上述第3和第4个条件，目前可通过Addgene及其他商业渠道获得多种辅助载体，这些载体编码mob蛋白以及多种甲基化酶，可保护DNA免受宿主蓝细菌内源性核酸酶的降解43。在本方案中，接合过程由携带动员载体pRK24（www.addgeneorg/51950）和辅助载体pRL528（www.addgene.org/58495）的MC1061 E. coli菌株介导。在选择用于接合转移的载体时需格外谨慎。例如，在CyanoGate试剂盒中，自我复制型货物载体pPMQAK1-T自身编码Mob蛋白12；而pSEVA421-T则不编码44，因此必须由合适的辅助载体提供mob的表达。所选载体还应适用于目标生物体。例如，在鱼腥藻（Anabaena）sp. PCC 7120中实现高效接合转移，需要一种能够保护动员载体免受消化的辅助载体（例如pRL623，其编码三种甲基化酶AvaiM、Eco47iiM和Ecot22iM）45,46。
在本方案中，我们进一步阐述如何利用酶标仪或流式细胞仪，通过荧光标记来表征元件（即启动子）的性能。流式细胞仪能够对大量细胞群体中的单个细胞进行荧光检测。此外，流式细胞仪允许用户 &#34;门控&#34; 获取的数据并去除背景噪声（例如来自培养物中的颗粒物质或污染的噪声）。相比之下，酶标仪对给定体积的培养物进行整体荧光强度测量，通常在多个重复孔中进行。酶标仪相较于流式细胞仪的主要优势包括成本较低、更易获得，且下游数据分析通常无需专用软件。酶标仪的主要缺点是相对于流式细胞仪的灵敏度较低，以及在测量高光学密度培养物时可能出现问题。对于比较分析，酶标仪的样品需对每个孔进行归一化处理（例如，以培养物密度的测量值为基准，通常采用750 nm处的光密度吸光值 [OD750），这可能导致密度过高和/或混合不充分的样品（例如易于发生聚集或絮凝时）出现测量误差。
综上所述，本文详细演示了生成 Level 0 模块的基本原理，随后利用 CyanoGate 试剂盒进行分级组装，并将其克隆至适用于接合转移的载体中。接着，我们展示了接合转移过程、表达荧光标记的无菌转接合子菌株的筛选，以及后续使用流式细胞仪或酶标仪获取荧光数据的方法。

<table><tbody><tr><td>5-溴-4-氯-3-吲哚基-&amp;beta;-D-半乳糖吡喃糖苷（X-Gal）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0404</td><td>用于 2.1.3。</td></tr><tr><td>腺苷-5&amp;prime;-三磷酸二钠盐（ATP）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td>用于表 2。</td></tr><tr><td>琼脂（微生物学检测用）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1296-500g</td><td>用于 8.3。</td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Bioline</td><td>BIO-41026</td><td>用于 6。</td></tr><tr><td>Attune NxT 流式细胞仪</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>-</td><td>用于 4.3.1。</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td>用于表 2。</td></tr><tr><td>BpiI (BbsI)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ER1011</td><td>用于表 2。</td></tr><tr><td>BsaI (Eco31I)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ER0291</td><td>用于表 2。</td></tr><tr><td>羧苄青霉素二钠</td><td>VWR International</td><td>A1491.0005</td><td>用于 2.1.3。</td></tr><tr><td>Corning Costar TC 处理平底 24 孔板</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3527</td><td>用于 4.1.3。</td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP231-100</td><td>用于 3.6.2。</td></tr><tr><td>DNeasy 植物小量提取试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>69104</td><td>DNA 提取试剂盒。用于 5。</td></tr><tr><td>FLUOstar Omega 微孔板读数仪</td><td>BMG Labtech</td><td>-</td><td>用于 4.2.2。</td></tr><tr><td>GeneJET 质粒小量提取试剂盒</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>K0503</td><td>质粒纯化试剂盒。用于步骤 2.3.2。</td></tr><tr><td>玻璃珠（直径 0.5 mm）</td><td>BioSpec Products</td><td>11079105</td><td>用于 5.2。</td></tr><tr><td>甘油</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10021083</td><td>用于 2.3.1、3.6.2。</td></tr><tr><td>异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10356553</td><td>用于 2.1.3。</td></tr><tr><td>卡那霉素硫酸盐（Gibco）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11815-024</td><td>用于 2.1.3。</td></tr><tr><td>膜滤器（0.45 &amp;mu;m）</td><td>MF-Millipore</td><td>HAWP02500</td><td>用于 3.3.7</td></tr><tr><td>96 孔平底微孔板（烟囱孔）&amp;micro;CLEAR</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655096</td><td>用于 4.2.1。</td></tr><tr><td>Monarch DNA 凝胶回收试剂盒</td><td>New England Biolabs</td><td>T1020S</td><td>用于 1.1.2.2。</td></tr><tr><td>Monarch PCR DNA 纯化试剂盒</td><td>New England Biolabs</td><td>T1030</td><td>DNA 纯化试剂盒。用于 1.1.2.3。</td></tr><tr><td>带 LED 灯的 Multitron Pro 摇床培养箱</td><td>Infors HT</td><td>-</td><td>带白色 LED 灯的振荡培养箱。用于 4.1.4。</td></tr><tr><td>MyTaq DNA 聚合酶</td><td>Bioline</td><td>BIO-21108</td><td>用于 7.1。</td></tr><tr><td>NanoDrop One</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-ONE-W</td><td>用于 2.3.3。</td></tr><tr><td>One Shot TOP10 化学感受态 &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C404010</td><td>用于 2.1.1。</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）溶液（10X 浓缩液）</td><td>VWR International</td><td>K813</td><td>用于 4.3.2。</td></tr><tr><td>Q5 高保真 DNA 聚合酶</td><td>New England Biolabs</td><td>M0491S</td><td>用于 1.1.2.1。</td></tr><tr><td>Quick-Load 1 kb DNA Marker</td><td>New England Biolabs</td><td>N0468S</td><td>用于图 4。</td></tr><tr><td>螺口管（1.5 ml）</td><td>Starstedt</td><td>72.692.210</td><td>用于 3.6.3</td></tr><tr><td>壮观霉素二盐酸盐五水合物</td><td>VWR International</td><td>J61820.06</td><td>用于 2.1.3。</td></tr><tr><td>Sterilin Clear Microtiter 圆底 96 孔板</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>612U96</td><td>用于 4.3.1。</td></tr><tr><td>T4 DNA 连接酶</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EL0011</td><td>用于表 2。</td></tr><tr><td>TissueLyser II</td><td>Qiagen</td><td>85300</td><td>珠磨仪。用于 5.2。</td></tr></tbody></table>

利用cyanogate模块化克隆工具包通过接合进行蓝细菌的遗传改造

Genetic Modification of Cyanobacteria by Conjugation Using the CyanoGate Modular Cloning Toolkit

蓝细菌是一类多样化的原核光合生物，可通过遗传改造用于可再生地生产有价值的工业产品。近年来，合成生物学的进步推动了多种克隆工具包的开发，例如CyanoGate，这是一种标准化的模块化克隆系统，用于构建质粒载体，以便后续转化或接合转移至蓝细菌中。本文详细阐述了一种组装自复制载体（例如携带荧光标记表达盒）并将其通过接合转移导入蓝细菌菌株Synechocystis sp. PCC 6803或Synechococcus elongatus UTEX 2973的方法。此外，我们还介绍了如何利用酶标仪或流式细胞术对接合元件（例如启动子）的功能进行表征。

为演示 Golden Gate 组装流程，将一个表达盒组装到 1 级位置 1（正向）受体载体（pICH47732）中，该载体包含以下 0 级元件：C-藻蓝蛋白操纵子启动子 Pcpc560 (pC0.005)，eYFP 的编码序列 (pC0.008) 以及双重终止子 TrrnB (pC0.082)12转化连接反应产物后，通过标准的蓝白斑筛选鉴定阳性克隆 E. coli 菌落（图3）。随后将Level 1载体和End-Link 1载体（pICH50872）中的eYFP表达盒组装至Level T接受载体（pPMQAK1-T）中，从而获得该载体 cpcBA-eYFP (图4A）。组装的 cpcBA-eYFP 载体通过限制性酶切进行验证（<strong...

本文介绍了一种实验方案，用于：i）利用CyanoGate模块化克隆工具包构建一种可自我复制的载体；ii）通过接合转移将该载体导入蓝细菌宿主；以及iii）使用酶标仪或流式细胞术对转基因蓝细菌菌株进行表征分析。

利用CyanoGate模块化克隆工具包通过接合进行蓝细菌的遗传改造

蓝细菌是一类多样化的原核光合生物，可通过基因改造用于可再生地生产有价值的化合物……

蓝细菌是一类重要的光合微生物，在合成生物学和可再生生物技术应用中正日益被视为有用的平台。因此，开发高效的技术以简化异源DNA在不同蓝细菌物种中的设计、克隆和导入具有重要意义。本技术演示了一种成熟的方法——接合转移（又称三亲本杂交），用于将DNA导入那些天然不具备转化能力的蓝细菌物种中。接合转化已在多种蓝细菌菌株中成功实现，包括单细胞和多细胞丝状种类。如果您是首次尝试该技术，请务必小心操作您的蓝细菌和大肠杆菌菌株。例如，离心速度不得超过方案中给出的数值，且不要进行涡旋振荡。对于初次使用者而言，混合细菌与蓝细菌可能看似奇怪。我们希望通过演示接合过程，帮助澄清这一问题。在构建一级装配体后，选择一个合适的T级受体载体。选择合适的末端连接片段，将最终一级组装产物的3'端连接至T级载体骨架。若要将一个或多个一级组装产物组装到T级载体中，请准备含有PBI1和所需末端连接片段载体的反应混合物。设置PCR仪程序，并按照文中的方法进行操作。第一天，通过接种无菌的 Synechocystis PCC 6803 或 Synechococcus elongatus UTEX 2973 新鲜培养物来培养蓝细菌。用灼烧灭菌的接种环从无菌 BG-11 琼脂平板上刮取菌体，转移至含有 50 毫升新鲜 BG-11 培养基的 100 毫升锥形瓶中进行接种。将锥形瓶置于光照摇床中，在 30 摄氏度、100 转/分钟的条件下培养 Synechocystis PCC 6803 细胞。对于集胞藻属长链种 UTEX 2973，将细胞培养物在 40 摄氏度、100 RPM 条件下培养。培养一至两天后，取一毫升细胞培养物，在分光光度计上测定。在 OD 750 处的吸光度达到 0.5 至 1.5。第二天，将含有 PRK24 和 PRL528 载体的 MC1061 E.coli 辅助菌株接种至 5 毫升 LB 培养基中，其中添加氨苄青霉素至终浓度为 100 微克/毫升，氯霉素至终浓度为 25 微克/毫升。在 37 摄氏度、225 RPM 条件下于摇床培养箱中过夜培养。随后，将携带 T 级货物载体的 E.coli 菌液接种至 5 毫升含有适当抗生素的 LB 培养基中。在摇床培养箱中，37摄氏度、225转/分钟条件下过夜培养。第三天，在室温下以3,000 ×g离心辅助菌和载体菌的大肠杆菌过夜培养物10分钟。弃去上清液，注意不要扰动菌体沉淀。通过加入5毫升不含抗生素的新鲜LB培养基洗涤菌体沉淀。用移液器轻轻吹打使沉淀重悬，然后离心以去除上清液。重复此洗涤步骤三次，以彻底清除过夜培养物中残留的抗生素。最后一次洗涤后，将细胞沉淀重悬于初始培养液体积一半的LB培养基中。然后，在一个2毫升离心管中混合450微升辅助菌株与450微升运载菌株，并于室温放置。接下来，通过在室温下以1,500 ×g离心1毫升集胞藻培养物10分钟，制备集胞藻培养物。然后小心弃去上清液，注意不要扰动细胞沉淀。用与初始体积相同的无菌 BG-11 培养基重悬沉淀，洗涤四次。取 900 微升洗涤后的蓝细菌培养物，加入含有 900 微升混合大肠杆菌菌株的 2 毫升离心管中。通过轻轻吹打混匀培养物。将混合物在室温下孵育30分钟（集胞藻PCC 6803）或2小时（细长聚球藻UTEX 2973）。在室温下以1,500 g离心10分钟。移除1.6毫升上清液，并将沉淀物重悬于剩余的上清液中。在不含抗生素的LB BG-11琼脂平板上放置一个0.45微米的膜滤器。用无菌涂布棒或无菌弯头枪头，将200微升大肠杆菌/蓝细菌培养混合物小心地涂布在膜上。用石蜡膜密封平板，将平板置于光照培养箱中培养24小时。24小时后，使用火焰灭菌的镊子小心地将膜转移至含有适当抗生素的新鲜BG-11琼脂平板上，以筛选载体。用石蜡膜密封平板，并在与之前相同的条件下继续培养，直至菌落出现。集落通常在接种后7-14天出现于集胞藻PCC 6803，而长椭圆集胞藻UTEX 2973则在3-7天内出现。为筛选接合子，使用经加热灭菌的接种针，从膜上挑选至少两个独立的集落，并划线接种至含有适当抗生素的新BG-11琼脂平板上。随后，将蓝细菌培养物划线接种至含有5毫升LB培养基的15毫升离心管中，并在摇床培养箱中于37°C、225 RPM条件下过夜培养。无菌培养结果证实无大肠杆菌污染。经过七天的充分生长后，挑取单个无菌落建立液体培养物，用于长期冷冻保存或后续实验。本研究展示了金门克隆组装工作流程。在将连接反应产物转化后，通过标准的蓝白斑筛选大肠杆菌菌落来鉴定成功的连接产物。随后，将一级载体和末端连接一载体中的eYFP表达盒组装到一个T级接受载体中，获得cpcBA-eYFP载体。通过限制性酶切验证组装得到的cpcBA-eYFP载体。成功接合转移cpcBA-eYFP或pPMQAK1-T载体后，在Synechocystis PCC 6803和Synechococcus elongatus UTEX 2973的膜上可观察到多达数百个菌落的生长。正如预期的强Pcpc560启动子作用，与阴性对照相比，酶标仪测得的归一化eYFP荧光值以及流式细胞仪测得的单个细胞eYFP荧光值均较高。无论是使用酶标仪还是流式细胞仪检测，Synechococcus elongatus UTEX 2973的荧光值均高于Synechocystis PCC 6803。根据您正在进行接合的菌株，确保孵育时间不少于最短所需时间。

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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