人类粪便标本中弯曲杆菌Jejuni在运输介质中确定检测和生存极限的培养方法

坎皮洛菌培养的困难抑制了基础研究，例如产生疾病所需的细菌很少。此处使用的这些组合分析和分析样本可以解决此问题。该技术允许临床相关患者症状与阳性粪便培养结果相关，并首次实际使用细菌数量。

了解有多少细菌与疾病相关，将提供诊断，一个重要的检测目标，以及比较菌株或坎皮洛菌物种之间的毒性的坚实方法。杆菌培养是直接的，但它需要快速和有组织的准备，以保持定量生存能力。还需要作出相当大的判断，以确定盘子里相互竞争的粪便菌群中的坎皮洛菌菌群。

在开始 C.jejuni 或 C.coli 培养之前，戴上手套、实验室外套和安全眼镜，并在经过消毒的层流安全罩中放置一次性保护板。使用无菌技术将每个水合或解冻的细菌存量条纹到坎皮洛菌特异性阿加盘上，将该板在 37 摄氏度下放置 48 小时，放在含有微气大气气体生成袋的厌氧罐中 48 小时。24小时后，松散地盖住一瓶BHI肉汤，将烧瓶放入一个新的厌氧罐中，并放入一个袋中，该袋将产生一个微氧环境，在37摄氏度下过夜孵育。

第二天早上，使用三毫升的预减少的肉汤和一个接种循环刮开盘的坎皮洛菌培养。将浆料转移到无菌管中，用三毫升刮制的浆料为预减的肉汤的其余 97 毫升接种。将肉汤与气袋一起放在罐子中，在37摄氏度和每分钟115圈的振动培养箱中孵育培养物48至72小时，直到培养物达到不超过4的600纳米的光学密度。

为了确定这种纯库存培养中的细菌数量，在900微升的稀释剂中执行8个10倍稀释系列100微升的肉汤。使用无菌电镀珠，在重复的预减少的坎皮洛菌特定板和具有稀释浓度的标签板上，将100微升的1倍10至负五至负七稀释剂铺上，然后将板放入第二个厌氧罐中，用气瓶在37摄氏度下产生48至72小时。在生长期结束时，选择有30到300个殖民地的板块进行计数。

计数后，根据公式使用计数确定每毫升库存汤培养的菌群形成单位。分析菌落计数准确无误至关重要，因为这将支撑使用尖刺粪便池的所有步骤。电镀后立即进行计数，将等量的肉汤和坎皮洛菌负粪池混合，并在负粪池中进行九次随后的两倍稀释，在粪便池中加入一个含有不含坎皮洛菌的肉汤控制板，以帮助识别非坎皮洛菌菌库。

在重复的预减少的坎皮洛菌特异性气剂板上稀释每个坎皮洛菌粪便的 10 微升，并在厌氧罐中用气体生成袋孵育板，温度约为 48 小时。在孵化结束时，目视检查条纹板的菌落，类似于那些来自纯坎皮洛菌培养物的菌落。要确认菌落实际上是弯曲杆菌选择多个弯曲细菌，如菌落进行克染色，并使用油浸透镜通过光显微镜可视化细条纹区域，以识别克阴性弯曲、螺旋或雪茄形状的小细菌。

没有添加坎皮洛菌的负控制板对于帮助识别其他粪便菌群非常重要。考虑最后一个稀释，其中包含一个视觉坎皮洛菌样克阴性菌落点的文化检测的限制。并采用该公式计算在精心诊断的临床粪便标本中，每毫升正稀释的菌落形成单位。

确定储存在运输介质中的坎皮洛菌的可行性，将一毫升坎皮洛菌汤培养物与一毫升负粪池混合，并在负粪池中准备10个重复的两倍连续稀释剂。在 Cary-Blair 介质中，以额外的一到四比进一步稀释每个稀释，并在盖管中储存 20 个稀释管和阴值控制，在盖管中稀释 96 小时。从零时开始，此后每24小时将每稀释10微升的等分到坎蒂洛细菌选择性阿加板上，并在37摄氏度下孵育板48小时。

由于没有从患者样本中建立准确细菌数的独立方法，因此可以使用一种纯细菌库存同时进行两次测量。一个测试用于从粪便基质中对库存细菌的连续稀释中对坎皮洛菌群进行视觉检测，模拟临床标本。另一个测试是分析性的，量化在同一细菌库存培养中用于喷刺的细菌中每毫升存在的菌落形成单位。

成功的一个关键参数是确定竞争粪便菌群中精确大小的菌落，这一具有代表性的尖尖粪便培养板就说明了这一点。在这里，可以观察到七个独立实验的典型数据。仅仅识别粪便培养物中类似于坎皮洛菌的菌落是不够的。

所有菌落应确认克染色或更先进的方法。我们使用一种酶免疫测定，这种酶比培养更准确，以检测不常见的物种，如C.upsaliensis或C.lari，这些物种在含有汞的标准抗生素上生长不良。这项技术为研究诸如坎皮洛菌的非症状运输以及高细菌负荷是否使患者面临更高的坎皮洛菌感染严重后果的风险奠定了必要的基础。

与通常具有传染性且可能危险的细菌一起使用 PPE，并且使用可能含有未知病原体的负粪便池，即使从健康捐赠者那里收集，也可能含有未知病原体。