Name: 16S rRNA 荧光原位杂交检测膀胱活检中的组织驻留细菌 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: 学习使用16S rRNA荧光原位杂交技术检测膀胱活检组织中的驻留细菌。该方法结合共聚焦显微镜成像，可无偏向性地识别细菌，为复发性尿路感染的临床诊断和抗生素选择提供重要依据。

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我们感谢Kim Orth和Marcela de Souza Santos在实验方案方面提供的建议，以及Amanda Arute提供的技术支持。本工作部分由K.P.所持有的Cecil H.和Ida Green系统生物学科学讲席基金资助。

本研究方案已获得德克萨斯大学达拉斯分校和德克萨斯大学西南医学中心机构生物安全与化学安全委员会的批准，并遵循其相关指南。本方案中使用人体活检样本的部分已获得德克萨斯大学达拉斯分校和德克萨斯大学西南医学中心机构审查委员会（IRB）的批准，并遵循其相关指南。所有参与活检样本采集与处理的人员均已完成现行的人体受试者保护（HSP）和《健康保险可携性和责任法案》（HIPAA）培训。
1. 固定和石蜡包埋的组织制备
注意：活检样本取自接受膀胱镜检查并进行三角区电灼治疗三角区炎的女性，以进一步管理复发性尿路感染（rUTI）。rUTI 定义为 12 个月内发生 3 次尿路感染。活检采集在手术室中进行，患者在签署知情同意书后接受麻醉，操作遵循 UTSW IRB 方案 STU 082010-016。所有样本在实验前均进行编码并去标识化。
<ol>
	<li>使用输尿管钳经柔性膀胱镜从膀胱三角区获取一块冷杯活检组织（约1 mm3），并立即放入含有1.5 mL 4% v/v多聚甲醛（PFA）的无菌2 mL冻存管中，PFA需用1×无菌磷酸盐缓冲液（PBS）配制。 
	注意： 1× PBS中的4% PFA可预先配制，并在-20 °C下保存，直至使用。</li>
	<li>在室温下固定6小时，或在4 °C下固定16–24小时。 
	注意： 固定时间应根据组织样本大小计算，避免过度固定。不建议使用戊二醛作为固定剂，因其会引入自发荧光。</li>
	<li>在无菌操作台或生物安全柜中，用移液器吸除固定液，并替换为1.5 mL无菌1× PBS。将样本在4 °C下保存过夜，或立即进行组织处理和石蜡包埋19。</li>
	<li>使用无菌切片机将组织块切成5 μm厚的切片，并将石蜡包埋的组织切片贴附于带电荷的玻璃载玻片上。每份活检样本至少需要两张载玻片用于16S rRNA FISH实验。 
	注意： 活检组织应相对于切面呈横截方向排列，以确保在所有切片中均可观察到尿路上皮层。还应注意，切片厚度应优化以利于细菌群落的检测。在组织驻留细菌极为稀少的感染情况下（例如，&#60;每1,000个哺乳动物细胞中少于1个组织驻留细菌），可能需要更薄的切片或连续多张切片取样。</li>
</ol>
2. 使用通用16S rRNA探针进行荧光原位杂交
注意：每份活检样本需要两张载玻片。一张载玻片用于通用的16S rRNA探针，另一张用于序列随机的对照探针。这在显微镜观察时区分真实信号与背景信号至关重要，因为膀胱上皮在多个通道中具有自发荧光。除了使用随机序列探针外，在封片前用0.1%苏丹黑B进行封闭处理，可能有助于降低组织固有的自发荧光20。
<ol>
	<li>试剂准备与通风橱处理
	<ol>
		<li>使用 70% 乙醇清洁一个空的通风橱（或适当规格的生物安全柜）。</li>
		<li>制备杂交缓冲液，成分包括 0.9 M 氯化钠（NaCl）、20 mM Tris-HCl（pH 7.2）、0.1% 十二烷基硫酸钠（SDS），溶于 10 mL 经无菌过滤的水中。 
		注意：无菌过滤水可通过将高压灭菌的蒸馏水经 0.22 μM 滤膜过滤制得。杂交缓冲液可在室温下保存，但 SDS 可能从溶液中析出。若出现 SDS 沉淀，使用前需将溶液置于 50 °C 水浴中加热溶解。</li>
		<li>在清洗并高压灭菌的瓶中，分别用无菌过滤水配制至少 100 mL 的 95% 和 90% 乙醇。</li>
		<li>将荧光标记的冻干探针溶解于 10 mM Tris-HCl（pH 8.0）和 1 mM 乙二胺四乙酸（EDTA）缓冲液（TE 缓冲液）中，TE 缓冲液需使用滤膜除菌的无核酸酶水配制，最终浓度为 100 μM。再用 TE 缓冲液稀释至 1 μM，用于本实验方案。将 100 μM 的浓缩储备液和 1 μM 的工作液均避光保存于 -20 °C。 
		注意：切勿将荧光标记探针直接溶解于水中。必须使用缓冲液以防止连接荧光团与核苷酸探针的 NHS 酯键发生水解。</li>
		<li>用 70% 乙醇清洁五个 Coplin 染色缸，晾干后分别标记为：二甲苯 I、二甲苯 II、95% EtOH、90% EtOH、ddH2O，并各加入 100 mL 对应溶液。此步骤有助于避免后续操作中的混淆。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>组织脱蜡与再水化
	<ol>
		<li>在通风橱内，将每例活检样本的两张切片放入垂直切片架中。</li>
		<li>将垂直切片架放入装有 100 mL 二甲苯的 Coplin 染色缸（标记为二甲苯 I）中，处理 10 分钟。</li>
		<li>从二甲苯 I 中取出切片架，用纸巾轻拭底部以去除多余二甲苯，随后放入二甲苯 II Coplin 染色缸中继续处理 10 分钟。 
		注意：切勿在未认证的通风橱外操作二甲苯。</li>
		<li>将脱蜡后的组织切片依次在 95% 和 90% 乙醇中各洗涤 10 分钟，分别使用对应标记的 Coplin 染色缸进行再水化。 
		注意：此阶段可将杂交缓冲液在水浴中预热至 50–56 °C。</li>
		<li>从 90% 乙醇中取出切片架，用纸巾轻拭底部以去除多余乙醇，随后放入装有 100 mL 滤膜除菌 ddH2O 的 ddH2O Coplin 染色缸中，处理 10 分钟。</li>
		<li>在等待 ddH2O 洗涤期间，将探针用杂交缓冲液稀释至 10 nM，制备染色液。每张切片准备 150 μL 染色液。 
		注意：用铝箔包裹管子并存放于抽屉中，以避光保存染色液。在实验台操作荧光标记探针时，应尽可能关闭顶灯。用杂交缓冲液稀释后的探针不可重复使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>杂交与复染
	<ol>
		<li>通过在 P1000 枪头盒的储液槽中放入浸湿并揉皱的 Kimwipe 纸并加入无菌水，为每种探针制备一个加湿室。将枪头架卡入其上——切片将放置于此处。 
		注意：使用加湿室至关重要，可防止活检切片在杂交过程中干燥。需注意，市售加湿室设计用于维持稳定湿润环境，但此处所述方法可在显著降低成本的同时有效控制湿度。</li>
		<li>将切片从切片架中取出，放置于干净纸巾上（组织面向上）。用 Kimwipe 纸轻轻吸干切片表面水分，注意仅轻拍组织切片周围（而非直接接触切片）以吸除水分。使用疏水笔在组织切片周围画出边界，随后将切片（组织面向上）放入加湿室中。 
		注意：操作应迅速，避免组织在杂交前干燥。</li>
		<li>将加湿室放入设定为 50 °C 的培养箱中。用移液器将 50–150 μL 染色液直接加至组织表面，使疏水边界形成的矩形区域完全覆盖，但避免溢出边界。轻轻盖上盒盖。</li>
		<li>在避光条件下于 50 °C 孵育过夜（约 16 小时）。若培养箱带有观察窗，应用铝箔覆盖以创造黑暗环境。 
		注意：为获得可靠信号，杂交温度需低于 FISH 探针的熔解温度。50 °C 是通用 16S rRNA 探针的最佳温度，但对其他探针可能并非最优。</li>
		<li>次日早晨，准备至少 500 mL 洗涤缓冲液，成分包括 0.9 M NaCl 和 20 mM Tris-HCl（pH 7.2），溶于 ddH2O 中，并通过真空瓶顶滤器过滤除菌至无菌瓶中。将缓冲液在水浴中预热至 50–56 °C。</li>
		<li>从加湿室中取出切片，用 Kimwipe 纸小心吸除残留的杂交液，随后将切片放入垂直染色架中。</li>
		<li>将染色架放入装有 100 mL 预热洗涤缓冲液的不透光 Coplin 染色缸中，孵育 10 分钟。若染色缸非不透光（如玻璃材质），则在孵育期间应将其置于黑暗环境中——例如放入盒内或抽屉中。</li>
		<li>使用新的 Coplin 染色缸和新鲜洗涤缓冲液重复洗涤步骤两次。</li>
		<li>在洗涤过程中，通过将 100 μg/mL 的 Hoechst 33342 储备液以 1:1,000 比例稀释于洗涤缓冲液中来制备复染液。向同一管中加入 Alexa-555 小麦胚芽凝集素（WGA），使其终浓度为 5 μg/mL，再加入 Alexa-555 鬼笔环肽（Phalloidin），使其终浓度为 33 nM。配制后避光保存，待用。 
		注意：Hoechst、Alexa-555 WGA 和 Alexa-555 鬼笔环肽分别标记 DNA、黏蛋白/尿斑蛋白和肌动蛋白，根据制造商说明可在避光条件下长期保存。探针与复染所用荧光标记物可根据拟使用显微镜的滤光片组进行定制。</li>
		<li>从最后一次洗涤中取出切片，用 Kimwipe 纸轻轻吸除多余洗涤缓冲液，将切片（组织面向上）置于纸巾上，直接在组织表面加入 50–150 μL 复染液，使疏水边界完全覆盖但不溢出。用冷冻盒盖覆盖最多四张切片，在室温下孵育 10 分钟。</li>
		<li>将切片重新放入染色架中，用新鲜洗涤缓冲液在 Coplin 染色缸中再洗涤两次，每次 10 分钟。</li>
		<li>最后一次洗涤后彻底干燥切片，将切片（组织面向上）置于纸巾上，并用冷冻盒盖覆盖。在组织表面直接挤一滴封片介质，轻轻盖上合适尺寸的盖玻片（根据活检组织大小选择）。轻压以排除气泡（气泡会影响成像），随后将封片后的切片在避光条件下过夜固化。</li>
		<li>次日，用少量透明指甲油沿盖玻片边缘密封切片与盖玻片之间的缝隙。在避光条件下干燥 10 分钟，随后于 4 °C 避光保存，用于共聚焦显微镜观察。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 通过共聚焦显微镜观察16S rRNA FISH
注意：本实验方案建议使用配备63倍和100倍物镜的激光扫描共聚焦显微镜，以获得最佳结果。需要配备用于观察Hoechst、Alexa-488和Alexa-555荧光的合适滤光片组。然而，若无共聚焦显微镜，也可使用常规荧光显微镜。本方案适用于激光扫描共聚焦显微镜。
<ol>
	<li>根据制造商说明，打开共聚焦显微镜及与之配套的计算机软件。</li>
	<li>加载载玻片，使用10倍物镜在蓝色（DAPI/Hoechst）通道中观察。仔细调焦，直至细胞核清晰可见。</li>
	<li>调焦完成后，切换至高倍物镜（63倍或100倍）。在盖玻片上方滴加镜油。使用新物镜重新调焦，确保物镜镜头在调焦过程中与镜油接触。 
	注意： 高倍放大（63x 或 100x）时仅使用微调焦功能。镜油仅可用于油镜物镜。</li>
	<li>通过目镜在绿色（eGFP/Alexa-488）通道中快速评估每张载玻片，以确定哪些为FISH阳性，哪些为FISH阴性。 
	注意： 为减少实验偏差，最好由另一位独立操作人员以盲法方式进行初步评估/评分。</li>
	<li>为成像染色的活检样本，首先选择一张FISH阳性载玻片，切换至计算机成像模式。选择405（Hoechst）、488（Alexa-488）和555（Alexa-555）通道。使用最长波长通道（本例中为555通道）设置针孔。在488通道中找到可清晰观察标记细菌的正确焦平面。保持焦平面不变，为每个通道设置增益、激光功率和偏移量，确保信号未饱和且背景未过度校正。在三个通道中同步采集图像。 
	注意： 在同一实验中对所有载玻片成像时，488通道的设置应保持一致。若不同视野间细菌成像的最佳焦平面发生变化，可能需要对405和555通道的激光功率进行调整。</li>
	<li>重复上述步骤，对多个视野进行成像，直至覆盖整个上皮表面。 
	注意： 可能需要轻微调整焦平面以在不同视野中观察标记细菌，但切勿更改488通道的增益、激光功率或偏移量。若使用共聚焦显微镜，建议采集Z轴堆栈图像，以便分析细菌在组织内的三维定位。</li>
	<li>使用ImageJ或类似软件处理图像，并定量分析组织内或与组织相关的标记细菌。建议对图像进行最小限度处理（例如拆分/合并通道、转换为图像文件），必要时可进行背景校正。所有校正或其他处理应在各图像间保持一致。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍一种利用16S rRNA荧光原位杂交（Fluorescence in situ Hybridization, FISH）技术检测人膀胱活检组织中组织相关细菌的实验方案。该方案可轻松适用于其他组织来源的活检样本，例如胃肠道或皮肤组织，并可扩展至多种哺乳动物模式生物的组织样本。本文所述方案亦可适配多种固定方法（如甲醛、乙醇、甲醇-醋酸-乙醇混合固定液）以及组织处理技术（如石蜡包埋、树脂包埋和冷冻保存组织）。双标记的通用16S rRNA探针可无偏倚地检测组织内存在的所有细菌种类，有助于深入理解病原体及微生物群在疾病状态与健康状态下如何在空间上与黏膜表面相互作用。通过使用probeBase、PhylOPDb或ARB软件包中的PROBE_DESIGN工具来筛选或设计针对特定物种或属的16S或23S rRNA探针，本方案亦可调整用于组织内特定细菌物种或属的检测15,21,22。该方法未来的重要发展方向是采用标记不同离散荧光染料的物种或属特异性探针进行多重检测，以评估膀胱黏膜内的微生物多样性。
该方法在人体样本上应用的主要限制在于活检组织的可获得性。获取活检样本需要经过机构审查委员会批准并获得患者的知情同意，同时必须与实施操作的临床医生密切合作，以确保最佳的样本采集以及获取患者元数据。由于CEFT操作本身会破坏膀胱上皮，因此我们能够在操作前对这些区域进行活检并提供合理依据。本实验方案在脱蜡步骤中使用有毒的二甲苯，且整个过程需维持无菌环境，因此必须在通风橱或适当配置的生物安全柜中进行。本方案需要配备63倍或100倍物镜以及适用于Hoechst、Alexa-555和Alexa-488荧光染料观察的滤光片组的荧光显微镜，优先选用共聚焦显微镜。图1所示的代表性结果是使用激光扫描共聚焦显微镜成像获得的。类似的激光扫描显微镜应能产生可比的图像。本方案的局限性在于仅能检测与组织相关的细菌，而无法检测例如真菌等其他病原体。要鉴定组织内的真菌病原体，必须使用针对真菌18S或28S rRNA的特异性探针18。
本实验方案的关键步骤包括在整个操作过程中维持无菌环境，并确保组织在杂交与染色步骤之间不会干燥。如果组织在操作过程中干燥，可能导致信号减弱，或在洗涤步骤中从载玻片上脱落。此外，本方案必须始终使用两个连续切片——一个用于16S rRNA探针，另一个用于乱序探针（scramble probe）。若缺少这一对照，将很难区分假阳性结果，所获得的数据可能无效或缺乏信息价值。如果本方案需改用除通用16S rRNA探针以外的其他探针，则必须谨慎选择合适的杂交温度，通常应比探针预测的熔解温度低约5 °C。为保持信号强度，在加入探针后，组织应避免长时间暴露于光线下，且在显微镜观察时不得过度曝光。最后，在显微镜成像过程中，实验组（16S rRNA探针）与对照组（乱序探针）载玻片所对应的荧光染料荧光通道必须保持相同的成像参数设置。可视化患者来源组织中细菌在黏膜表面的空间分布关系，对于理解并建立与感染性疾病相关的宿主-病原体相互作用的临床相关假说至关重要。

尿路由尿道、膀胱、输尿管和肾脏组成，持续暴露于构成尿微生物组的细菌以及来自胃肠道的侵袭性尿路致病菌（如尿路致病性 E. coli（UPEC））1,2。膀胱表层细胞表面表达的一层水合黏液（由糖胺聚糖组成）和不可渗透的糖基化尿斑蛋白（uroplakin）斑块共同形成屏障，通常可防止黏附细菌侵入膀胱上皮3,4。在尿路感染（UTI）期间，这些屏障被破坏或扰乱，从而促进尿路致病菌黏附并侵入膀胱上皮5,6。小鼠模型的研究表明，多种尿路致病菌（包括UPEC、Klebsiella pneumoniae 和 Enterococcus faecalis）可在表层细胞的细胞质内形成可复制的胞内菌群（IBCs），并在移行上皮细胞内形成静息性胞内储存库（QIRs）7,8,9。尽管已在人类尿路感染患者的脱落上皮细胞中检测到UPEC，但此前尚未在人体中直接观察到尿路致病菌与膀胱黏膜的相互作用10。
我们改进了一种常用技术——荧光原位杂交（FISH），用于检测来自接受膀胱镜下三角区电灼术（CEFT）治疗的绝经后患者的膀胱活检组织黏膜中的细菌，以进一步管理抗生素难治性复发性尿路感染11。通过使用针对16S rRNA的通用探针，我们能够客观地检测与复发性尿路感染患者膀胱黏膜相关的细菌种类，并确定其在膀胱壁内的位置12。该通用16S rRNA核苷酸探针此前已被设计用于靶向细菌16S rRNA的一个保守区域13，该区域对应于大肠杆菌（E. coli）16S rRNA的第388–355位。16S rRNA探针和乱序探针（scramble probe）序列此前已在小鼠胃肠道研究中经过验证并发表14,15。探针的序列及特性详见表1。本方案中必须使用连续的两个切片，一个用于16S rRNA探针，另一个用于乱序探针，以便区分真实信号与背景信号，因为膀胱上皮、胶原蛋白和弹性蛋白均具有自发荧光16。在本方案中，16S rRNA探针和乱序探针均在3'和5'末端通过N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）酯键连接了Alexa Fluor 488荧光标记，以增强荧光信号。
尽管本方案最初是为人类膀胱活检组织切片设计的，但也可轻松适用于任何疑似存在细菌的组织来源的石蜡包埋切片。与靶向细菌表面特定抗原（如脂多糖）的免疫组织化学实验不同，该方法无需预先了解组织相关细菌所表达的抗原信息10,17。使用通用的16S rRNA探针可无偏倚地检测样本中所有细菌种类，但无法确定其具体种类。若需确定所检测细菌的种类，必须使用针对特定物种或属的16S或23S rRNA探针。本方案无法检测与宿主组织相关的真菌病原体，例如Candida albicans。如需检测真菌病原体，应使用28S或18S rRNA探针18。

<table><tbody><tr><td>Alexa-555 鬼笔环肽</td><td>Invitrogen</td><td>A34055</td><td>肌动蛋白染色</td></tr><tr><td>Alexa-555 小麦胚芽凝集素（WGA）</td><td>Invitrogen</td><td>W32464</td><td>黏蛋白染色</td></tr><tr><td>瓶顶滤器</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-741-07</td><td>灭菌</td></tr><tr><td>染色缸</td><td>Simport</td><td>M900-12W</td><td>脱蜡/洗涤</td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-5M</td><td>显微镜观察</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-224</td><td>再水化</td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸二钠盐二水合物</td><td>Fisher Scientific</td><td>S311-500</td><td>TE</td></tr><tr><td>磨砂载玻片</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-550-343</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342 三盐酸盐三水合物</td><td>Invitrogen</td><td>H21492</td><td>细胞核染色</td></tr><tr><td>疏水性标记笔</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-4000</td><td>建立疏水屏障</td></tr><tr><td>吸水纸（Kimwipes）</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666-11</td><td></td></tr><tr><td>浸油 518 F</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-624-66A</td><td>显微镜观察</td></tr><tr><td>多聚甲醛（16%）</td><td>Thermo Scientific</td><td>TJ274997</td><td>固定</td></tr><tr><td>ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂</td><td>Invitrogen</td><td>P36934</td><td>封片介质</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-10</td><td>杂交缓冲液/PBS</td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP166-500</td><td>杂交缓冲液</td></tr><tr><td>磷酸氢二钠七水合物</td><td>Fisher Scientific</td><td>S373-500</td><td>PBS</td></tr><tr><td>磷酸二氢钠一水合物</td><td>Fisher Scientific</td><td>S369-500</td><td>PBS</td></tr><tr><td>注射器</td><td>VWR</td><td>75486-756</td><td>灭菌</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-5</td><td>TE/杂交缓冲液</td></tr><tr><td>二甲苯</td><td>Fisher Chemical</td><td>X3P-1GAL</td><td>脱蜡</td></tr><tr><td>0.22 &amp;mu;m 注射器滤膜</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-754-29</td><td>灭菌</td></tr></tbody></table>

通过16s rrna荧光原位杂交法检测膀胱活检组织中的组织驻留细菌

Detection of Tissue-resident Bacteria in Bladder Biopsies by 16S rRNA Fluorescence In Situ Hybridization

观察细菌与宿主黏膜表面及组织的相互作用，可为病原体致病机制提供重要见解。尽管在感染动物模型中可通过表达荧光蛋白（如GFP）的基因工程菌株实现细菌病原体的可视化，但在来自人类患者的活检或组织样本中观察细菌，则需要一种无偏倚的方法。本文介绍一种高效检测人类活检组织切片中与组织相关细菌的方法。该方法利用针对16S rRNA的荧光标记通用寡核苷酸探针，通过荧光原位杂交（FISH）技术对复发性尿路感染患者膀胱活检组织切片中的组织相关细菌进行标记。由于采用通用的16S rRNA探针，该方法可在无需预先了解细菌种类、属别或生化特性（如脂多糖LPS）的情况下检测细菌，而这些特性通常是免疫荧光实验检测所必需的。本文详细描述了从活检组织固定到共聚焦显微镜成像的完整16S rRNA FISH实验流程。该方案几乎可适用于任何类型的组织，是无偏倚可视化临床相关细菌-宿主相互作用的有力工具。此外，通过使用针对特定物种或属的探针，该方法也可被调整用于检测患者组织中的特定细菌病原体。

本方案已针对福尔马林固定石蜡包埋的膀胱活检组织切片中与膀胱黏膜相关细菌的无偏检测进行了优化。图1展示了采用本方案对复发性尿路感染女性患者的膀胱活检组织切片进行实验所获得的代表性共聚焦显微图像。两张连续切片分别与通用16S rRNA（上图）或乱序（scramble，下图）探针杂交。对组织同一区域拍摄的图像显示，使用16S rRNA探针杂交的组织中可见明显的细菌信号（绿色），而乱序探针杂交的组织中则无此信号。图2展示了一个假阳性结果。在16S rRNA探针和乱序探针杂交的组织切片中，405和488通道均检测到对应于自体荧光胶原蛋白或弹性蛋白的信号，这凸显了始终使用乱序探针作为对照的重要性。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>探针</td>
			<td>序列</td>
			<td>Tm</td>
			<td>荧光团</td>
			<td>连锁</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>通用16S rRNA </td>
			<td>5'-GCTGCCTCCC 
			GTAGGAGT-3'</td>
			<td>54.9</td>
			<td>Alexa-488（5' 和 3'）</td>
			<td>NHS 酯</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>随机序列</td>
			<td>5'-ACTC游戏副本ACGG 
			GAGGCAGC-3'</td>
			<td>NA</td>
			<td>Alexa-488（5' 和 3'）</td>
			<td>NHS 酯</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：FISH探针序列及特性。 Tm表示熔解温度，NHS是N-羟基琥珀酰亚胺的缩写。
<img alt="显示肌动蛋白、黏蛋白、Hoescht染色、16S rRNA分析及合并结果的荧光显微镜图像" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60458/60458fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：人类膀胱活检组织中通用16S rRNA和随机序列探针FISH的代表性共聚焦显微图像。 肌动蛋白和黏蛋白呈红色标记，细胞核呈蓝色标记，细菌呈绿色标记。仅在使用16S rRNA探针时检测到与组织相关的细菌，而随机序列探针未检测到。图像拍摄于63倍放大倍数下。比例尺 = 20 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60458/60458fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="用Hoescht染色对肌动蛋白、黏蛋白和16S rRNA进行荧光显微观察，显示细菌的定位。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60458/60458fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图2"> 
图2：人膀胱活检组织中假阳性绿色自发荧光的代表性共聚焦显微图像。 肌动蛋白和黏蛋白呈红色标记，细胞核呈蓝色标记，细菌以及细胞外基质中具有自发荧光的成分（如胶原蛋白和弹性蛋白）呈绿色。使用16S rRNA探针和乱序探针均观察到绿色荧光，表明为假阳性结果。图像以63倍放大倍数采集。比例尺 = 20 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60458/60458fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>

本方案通过16S rRNA原位杂交和共聚焦显微镜技术，对患者活检组织中与组织相关的细菌进行无偏倚检测。

通过16S rRNA荧光原位杂交法检测膀胱活检组织中的组织驻留细菌

可视化细菌与宿主黏膜表面及组织的相互作用，可为病原体致病机制提供重要见解。尽管……

本文介绍了一种用于检测活检膀胱组织内细菌的可靠方案，该方法可广泛应用于多种疑似存在细菌的组织类型。该技术的主要优势在于其无偏性，研究人员无需预先了解组织中存在何种细菌物种，即可实现对组织内细菌的检测。该技术可能有助于确定细菌是否已侵入复发性尿路感染女性患者的膀胱壁，从而指导治疗方案的选择，例如选用可穿透组织的抗生素。尽管该技术是为膀胱组织设计的，但经过极少优化后，也可广泛应用于其他存在定植细菌群体的组织。初次使用该技术的研究人员可能在盖玻片放置和成像方面遇到困难。重点优化盖玻片的放置以减少气泡，并在非珍贵样品上练习成像。本实验步骤将由我实验室的研究生 Jashkaran Gadhvi 演示。开始此操作前，使用 70% 乙醇清洁空的通风橱或适当适配的生物安全柜。按照文本方案中的说明准备好所有必需的缓冲液和试剂。接着，用70%乙醇清洗五个柯林瓶，并让瓶子自然晾干。瓶子干燥后，按此处所示进行标记，并加入100毫升相应的溶液。在通风橱中，将每份活检样本的两张玻片放入一个垂直玻片架中。将垂直玻片架放入盛有二甲苯1的考普林罐中，处理10分钟。随后，将玻片架从罐中取出，并在纸巾上轻触底部，以吸除多余的二甲苯。将切片架放入二甲苯2瓶中，孵育10分钟。随后将脱蜡的组织切片依次浸入乙醇中进行梯度水化，每次10分钟。完成洗涤后，用纸巾轻拭切片架底部以去除多余的乙醇，然后将切片架放入盛有100毫升经滤膜除菌的双蒸水的考普林瓶中，孵育10分钟。在此洗涤过程中，将探针用杂交缓冲液稀释至10纳摩尔，以制备染色液，注意每张载玻片需准备150微升染色液。通过向P1000吸头盒的储液槽中加入浸湿并揉皱的无尘擦拭纸和无菌水，为每种探针准备一个加湿孵育盒。将吸头架卡盒置于其上，载玻片将放置于此处。最后一次洗涤完成后，将玻片从玻片架中取出，放置在一张干净的纸巾上，组织面朝上。用精细擦拭纸轻轻吸干玻片上的水分，注意仅在活检组织区域附近轻轻点吸，避免直接接触组织区域，以吸除多余水分。使用疏水性笔在活检组织周围画出边界，然后将玻片组织面朝上放入湿化 chamber 中。接下来，将加湿盒放入设定为 50 °C 的培养箱中。用移液器吸取 50 至 150 µL 染色液，直接滴加在组织上方，使组织周围疏水边界所形成的矩形区域完全充满，然后轻轻盖上盒子。在 50 °C 黑暗条件下过夜孵育。如果培养箱带有窗口，请用铝箔覆盖以创造黑暗环境。次日早晨，从湿化盒中取出载玻片，并用洁净擦拭纸迅速吸去残留的杂交溶液。然后将载玻片放入垂直染色架中。将染色架放入已用铝箔包裹并盛有100毫升预热洗涤缓冲液的Coplin瓶中，孵育10分钟。在新的Coplin瓶中使用新鲜洗涤缓冲液，重复此洗涤步骤两次。在洗涤过程中，通过将Hoechst 33342储备液按1:1000的比例用洗涤缓冲液稀释，制备复染液。向同一管中加入Alexa-555标记的小麦胚芽凝集素，使其终浓度为每毫升5微克，以及Alexa-555标记的鬼笔环肽，使其终浓度为33纳摩尔。避光保存，待用。当最后一次洗涤完成后，将玻片从考普林瓶中取出，并用洁净擦拭纸轻轻吸去多余的洗涤缓冲液。将切片组织面向上放置在纸巾上，直接在组织上滴加 50 至 150 微升的复染液，使疏水边界区域被完全覆盖但不溢出。用冷冻盒盖覆盖最多四张切片，室温孵育 10 分钟。随后将切片重新放回染色架中，再用盛有新鲜洗涤缓冲液的考普林瓶清洗两次，每次清洗持续 10 分钟。然后彻底干燥载玻片，并将载玻片有组织的一面朝上放置在纸巾上，置于冷冻盒盖下方。将一滴封片剂直接滴加在组织上，轻轻盖上大小合适的盖玻片。轻压以排出任何气泡，并将带盖玻片的载玻片置于暗处过夜固化。第二天，用一层薄薄的透明指甲油将盖玻片边缘密封固定在载玻片上，避光干燥10分钟，然后于4摄氏度避光保存。准备对染色的活检样本进行成像时，打开共聚焦显微镜及其配套软件。首先使用FISH阳性切片，并切换至计算机可视化模式。选择 405、488 和 555 通道。使用最长波长的通道（在本例中为 555）设置针孔，然后找到 488 通道中标记细菌的当前焦平面以进行可视化。在不改变焦平面的情况下，调整每个通道的增益、激光功率和偏移量，使信号不饱和且背景不过度校正。在所有三个通道中采集图像。在本研究中，通过16S rRNA FISH检测人膀胱活检组织中的组织相关细菌。本方案已针对福尔马林固定石蜡包埋的膀胱活检组织切片中与膀胱黏膜相关细菌的无偏检测进行了优化。图中所示为采用本方案对复发性尿路感染女性患者的膀胱活检组织切片进行实验所获得的代表性共聚焦显微图像。两个连续切片分别与通用16S rRNA探针或乱序探针进行杂交。图像取自组织的相同区域，使用16S rRNA探针杂交的组织中细菌清晰可见，而使用随机探针杂交的组织中则不可见。也有可能出现假阳性结果。在此典型的假阳性示例中，自体荧光的胶原蛋白或弹性蛋白信号在16S rRNA探针和随机探针杂交的活检切片中均于405和488通道被检测到，这凸显了始终使用随机探针作为对照的重要性。为防止光漂白，在探针应用后应尽量减少组织暴露于光照。尽管该技术能够实现对人体组织中细菌的无偏检测，但无法提供物种特异性的信息。使用针对分类学特异性探针的多重荧光原位杂交（Multiplex-FISH）可鉴定存在的属或种。在该技术开发之前，尚未有研究证实细菌能够侵入人类复发性尿路感染患者的膀胱壁。目前，我们正在使用属和种特异性的探针来确定存在的细菌种类。由于二甲苯具有毒性，应于通风橱中使用。成像过程中应注意避免直接注视激光。在物镜下放置载玻片时，应关闭激光。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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使用寡核苷酸偶联荧光微球在复杂临床和环境样本中进行细菌多重检测

来源： Ng, K. M., Tropini, C. 通过荧光成像可视化肠道微生物群-宿主相互作用 原位 杂交、凝集素染色与成像 视频实验杂志...

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本视频展示了尿路感染患者去石蜡化的膀胱组织中细菌的可视化。荧光标记的探针与细菌16S核糖体RNA杂交，可揭示与组织相关的细菌及其分布情况，从而提供有关样本内细菌密度的空间信息。...

通过荧光原位杂交技术在膀胱活检切片中可视化细菌

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通过荧光法检测神经元组织中一种持续性DNA病毒的基因组和转录本 原位 杂交结合免疫染色

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从小鼠尿路感染模型中分离用于下游单细胞分析的单个胞内细菌群落

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一种基于荧光的方法用于研究感染组织中的细菌基因调控

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