通过16S rRNA荧光原位杂交法检测膀胱活检组织中的组织驻留细菌

本文介绍了一种用于检测活检膀胱组织内细菌的可靠方案，该方法可广泛应用于多种疑似存在细菌的组织类型。该技术的主要优势在于其无偏性，研究人员无需预先了解组织中存在何种细菌物种，即可实现对组织内细菌的检测。

该技术可能有助于确定细菌是否已侵入复发性尿路感染女性患者的膀胱壁，从而指导治疗方案的选择，例如选用可穿透组织的抗生素。尽管该技术是为膀胱组织设计的，但经过极少优化后，也可广泛应用于其他存在定植细菌群体的组织。初次使用该技术的研究人员可能在盖玻片放置和成像方面遇到困难。

重点优化盖玻片的放置以减少气泡，并在非珍贵样品上练习成像。本实验步骤将由我实验室的研究生 Jashkaran Gadhvi 演示。开始此操作前，使用 70% 乙醇清洁空的通风橱或适当适配的生物安全柜。

按照文本方案中的说明准备好所有必需的缓冲液和试剂。接着，用70%乙醇清洗五个柯林瓶，并让瓶子自然晾干。瓶子干燥后，按此处所示进行标记，并加入100毫升相应的溶液。

在通风橱中，将每份活检样本的两张玻片放入一个垂直玻片架中。将垂直玻片架放入盛有二甲苯1的考普林罐中，处理10分钟。随后，将玻片架从罐中取出，并在纸巾上轻触底部，以吸除多余的二甲苯。

将切片架放入二甲苯2瓶中，孵育10分钟。随后将脱蜡的组织切片依次浸入乙醇中进行梯度水化，每次10分钟。完成洗涤后，用纸巾轻拭切片架底部以去除多余的乙醇，然后将切片架放入盛有100毫升经滤膜除菌的双蒸水的考普林瓶中，孵育10分钟。

在此洗涤过程中，将探针用杂交缓冲液稀释至10纳摩尔，以制备染色液，注意每张载玻片需准备150微升染色液。通过向P1000吸头盒的储液槽中加入浸湿并揉皱的无尘擦拭纸和无菌水，为每种探针准备一个加湿孵育盒。将吸头架卡盒置于其上，载玻片将放置于此处。

最后一次洗涤完成后，将玻片从玻片架中取出，放置在一张干净的纸巾上，组织面朝上。用精细擦拭纸轻轻吸干玻片上的水分，注意仅在活检组织区域附近轻轻点吸，避免直接接触组织区域，以吸除多余水分。使用疏水性笔在活检组织周围画出边界，然后将玻片组织面朝上放入湿化 chamber 中。

接下来，将加湿盒放入设定为 50 °C 的培养箱中。用移液器吸取 50 至 150 µL 染色液，直接滴加在组织上方，使组织周围疏水边界所形成的矩形区域完全充满，然后轻轻盖上盒子。在 50 °C 黑暗条件下过夜孵育。

如果培养箱带有窗口，请用铝箔覆盖以创造黑暗环境。次日早晨，从湿化盒中取出载玻片，并用洁净擦拭纸迅速吸去残留的杂交溶液。然后将载玻片放入垂直染色架中。

将染色架放入已用铝箔包裹并盛有100毫升预热洗涤缓冲液的Coplin瓶中，孵育10分钟。在新的Coplin瓶中使用新鲜洗涤缓冲液，重复此洗涤步骤两次。在洗涤过程中，通过将Hoechst 33342储备液按1:1000的比例用洗涤缓冲液稀释，制备复染液。

向同一管中加入Alexa-555标记的小麦胚芽凝集素，使其终浓度为每毫升5微克，以及Alexa-555标记的鬼笔环肽，使其终浓度为33纳摩尔。避光保存，待用。当最后一次洗涤完成后，将玻片从考普林瓶中取出，并用洁净擦拭纸轻轻吸去多余的洗涤缓冲液。

将切片组织面向上放置在纸巾上，直接在组织上滴加 50 至 150 微升的复染液，使疏水边界区域被完全覆盖但不溢出。用冷冻盒盖覆盖最多四张切片，室温孵育 10 分钟。随后将切片重新放回染色架中，再用盛有新鲜洗涤缓冲液的考普林瓶清洗两次，每次清洗持续 10 分钟。

然后彻底干燥载玻片，并将载玻片有组织的一面朝上放置在纸巾上，置于冷冻盒盖下方。将一滴封片剂直接滴加在组织上，轻轻盖上大小合适的盖玻片。轻压以排出任何气泡，并将带盖玻片的载玻片置于暗处过夜固化。

第二天，用一层薄薄的透明指甲油将盖玻片边缘密封固定在载玻片上，避光干燥10分钟，然后于4摄氏度避光保存。准备对染色的活检样本进行成像时，打开共聚焦显微镜及其配套软件。首先使用FISH阳性切片，并切换至计算机可视化模式。

选择 405、488 和 555 通道。使用最长波长的通道（在本例中为 555）设置针孔，然后找到 488 通道中标记细菌的当前焦平面以进行可视化。

在不改变焦平面的情况下，调整每个通道的增益、激光功率和偏移量，使信号不饱和且背景不过度校正。在所有三个通道中采集图像。在本研究中，通过16S rRNA FISH检测人膀胱活检组织中的组织相关细菌。

本方案已针对福尔马林固定石蜡包埋的膀胱活检组织切片中与膀胱黏膜相关细菌的无偏检测进行了优化。图中所示为采用本方案对复发性尿路感染女性患者的膀胱活检组织切片进行实验所获得的代表性共聚焦显微图像。两个连续切片分别与通用16S rRNA探针或乱序探针进行杂交。

图像取自组织的相同区域，使用16S rRNA探针杂交的组织中细菌清晰可见，而使用随机探针杂交的组织中则不可见。也有可能出现假阳性结果。在此典型的假阳性示例中，自体荧光的胶原蛋白或弹性蛋白信号在16S rRNA探针和随机探针杂交的活检切片中均于405和488通道被检测到，这凸显了始终使用随机探针作为对照的重要性。

为防止光漂白，在探针应用后应尽量减少组织暴露于光照。尽管该技术能够实现对人体组织中细菌的无偏检测，但无法提供物种特异性的信息。使用针对分类学特异性探针的多重荧光原位杂交（Multiplex-FISH）可鉴定存在的属或种。

在该技术开发之前，尚未有研究证实细菌能够侵入人类复发性尿路感染患者的膀胱壁。目前，我们正在使用属和种特异性的探针来确定存在的细菌种类。由于二甲苯具有毒性，应于通风橱中使用。

成像过程中应注意避免直接注视激光。在物镜下放置载玻片时，应关闭激光。