Name: 结核病分子细菌负荷测定（TB-MBLA） (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: 了解结核病分子细菌负荷测定法，通过95摄氏度热灭活痰液样本后进行实时PCR定量检测。该方法无需高等级生物安全实验室即可安全监测患者治疗反应及疾病负担变化。

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本研究得益于欧洲及发展中国家临床试验伙伴关系（EDCTP）——泛非生物标志物扩展计划（PanBIOME）项目资助（项目编号 SP.2011.41304.008），以及圣安德鲁斯大学医学院研究基金的支持。本论文及结核病磁珠发光检测（TB-MBLA）方案作为可视化资源的发表，得到了苏格兰资助委员会和全球挑战研究基金对圣安德鲁斯大学的资助支持。感谢马普托妇产医院和马瓦拉内卫生中心提供临床痰标本，以及马普托结核病治疗单位团队在临床痰标本热灭活实验中提供的协助。

1. 样品制备
<ol>
	<li>培养
	<ol>
		<li>在洁净台或1级生物安全柜中，将处于对数生长期的卡介苗（Bacillus Calmette-Guérin, BCG）培养物1 mL分装至15 mL塑料离心管中。盖紧管盖。 
		注意：处理完整的5 mL样本需要五个15 mL离心管。 
		注意：操作任何结核分枝杆菌培养物时，必须使用生物安全柜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>患者痰标本
	<ol>
		<li>在通风良好的环境中操作，并佩戴鼻罩，小心打开标本杯，用移液器将1 mL分装至15 mL塑料离心管中，并盖紧管盖。 
		注意：建议使用宽口吸头吸取痰液。可用剪刀剪去1 mL吸头前端细部，以制成宽口吸头。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 热灭活
<ol>
	<li>在样品制备前，将水浴锅预热至 95 °C。 
	注意： 95 °C 的温度有助于降低 RNase 活性，从而为后续的 TB-MBLA 实验保留更多的 RNA。</li>
	<li>将样品管转移至浸没于水浴中的试管架上，确保每个样品管的四分之三部分浸入水中。</li>
	<li>在 95 °C 下加热 20 分钟，然后将试管转移至实验台，在室温下冷却 5 分钟，随后开始 RNA 提取。 
	注意： 通过将加热灭活的样品与对照组在 37 °C 下培养 42 天以检测是否生长，验证了结核分枝杆菌（M. tuberculosis）和卡介苗（BCG）的完全热灭活。在培养开始时及此后每周测量 600 nm 波长下的光密度值（OD600），持续 42 天。</li>
</ol>
3. RNA 提取
注意：此处描述的RNA提取过程适用于材料表中列出的RNA试剂盒。也可使用其他厂商的合适RNA提取试剂盒。
<ol>
	<li>提取对照（EC）添加
	<ol>
		<li>将灭活后的样本各1 mL转移至1.5 mL离心管中。向每个样本中加入100 µL的EC，盖紧管盖，倒置混匀3次。 
		注意：EC随TB-MBLA活性细菌检测试剂盒提供（材料表）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞沉淀
	<ol>
		<li>使用台式微量离心机，在室温下以20,000 × g离心10分钟。用移液器吸除上清液，保留约50 µL沉淀物。</li>
		<li>用移液器反复吹打，将沉淀重悬于950 µL裂解缓冲液中，并将全部悬液转移至RNA提取试剂盒提供的裂解基质管中（材料表）。确保管盖拧紧，并在管盖和管壁上做好标记。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行细胞裂解时，将步骤3.2.2中的管子转移至均质器中。在6,000 rpm条件下均质40秒。</li>
	<li>核酸纯化
	<ol>
		<li>将步骤3.3所得裂解液在室温下以12,000 × g离心5分钟。</li>
		<li>准备新的1 mL离心管，每管加入300 µL氯仿。</li>
		<li>使用1 mL吸头小心吸取上清液，避免接触裂解基质。</li>
		<li>将上清液转移至含氯仿的离心管中，涡旋振荡5秒。静置5分钟或更长时间，直至出现清晰的三层（上层、中间层和底层）。</li>
		<li>在室温下以12,000 × g离心5分钟。小心吸取上层液体，转移至新的1.5 mL离心管中。</li>
		<li>向步骤3.4.5中的各管加入500 µL预冷的100%乙醇，盖紧管盖，轻柔倒置混匀3次。将管子在-80 °C孵育15分钟，或在-20 °C孵育30分钟，随后继续提取；也可在-20 °C过夜，次日完成提取。</li>
		<li>将微量离心机预设为4 °C，并冷却至温度不高于12 °C后再开始离心。将管子放入离心机，在13,000 × g条件下离心20分钟。弃去上清液，加入70%预冷乙醇，再次在13,000 × g条件下离心10分钟。 
		注意：70%乙醇应使用分子级无核酸酶水配制。</li>
		<li>弃去步骤3.4.7中的全部上清液，将离心管转移至设定为50 °C的孵育器中。孵育20分钟以干燥RNA/DNA沉淀。保持管盖部分开启，以便乙醇完全蒸发。</li>
		<li>向干燥的沉淀中加入100 µL无核酸酶水，在室温下孵育5分钟。涡旋振荡3秒以混匀内容物。 
		注意：此时提取物可在冰箱中保存2–3天，或在-80 °C长期保存，直至进行第3.5节操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>DNA去除 
	注意：此步骤至关重要，因为提取物中残留的DNA会导致MBLA结果无效。本步骤基于DNA去除试剂盒（材料表）进行。
	<ol>
		<li>根据样本数量配制DNase I 10×缓冲液与DNase I酶的混合液（每样本10 µL缓冲液和1 µL DNase），额外增加10%以补偿移液损耗。涡旋混匀后，向每管RNA提取物中加入11 µL混合液。</li>
		<li>涡旋振荡3秒混匀，短暂离心（13,000 × g，10秒）以去除管壁上的液滴。在金属浴或孵育器中37 °C孵育30分钟。向每管直接加入额外1 μL DNase I酶，充分涡旋混匀，继续在37 °C孵育30分钟。</li>
		<li>在DNase孵育结束前10分钟取出DNase失活试剂，使其融化。涡旋20秒以确保形成均匀的乳白色悬液，然后向步骤3.5.2所得各RNA提取物中加入10 μL DNase失活试剂。</li>
		<li>在室温下孵育5分钟。孵育期间涡旋混匀3次。</li>
		<li>在13,000 × g条件下离心2分钟。小心将上清液转移至1.5 mL无RNase的离心管中，避免接触失活基质。</li>
		<li>若当天进行RT-qPCR，可将RNA提取物短期存放于冰箱；若需长期保存，则置于-80 °C。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 逆转录 qPCR
<ol>
	<li>对于未知样本，将所有待用的RNA提取物用无RNase水按1:10的比例稀释。涡旋振荡5秒以充分混匀，并短暂离心去除液滴或气泡。</li>
	<li>对于标准曲线用的标准品，从-80 °C冰箱中取出结核分枝杆菌（Mtb）和提取对照（EC）RNA标准品，在室温下解冻。分别对Mtb和EC标准品进行七次和六次10倍梯度稀释。每次将混合液从一个管转移至另一个管前，均需更换移液枪头。 
	注意： 标准品随TB-MBLA试剂盒提供。</li>
	<li>预混液配制 
	注意： 预混液（MM）是包含足够用于扩增所有样本、标准品以及无模板对照（NTC）的PCR试剂的混合溶液。NTC所用水应与提取过程及预混液配制中使用的水相同。确保每个标准品、每份RNA样本及其十倍稀释液均进行2次逆转录酶阳性（RT+）反应和1次逆转录酶阴性（RT-）反应。RT-反应用于评估DNA去除效率（表1）。
	<ol>
		<li>向每个PCR反应管中加入16 µL预混液。</li>
		<li>向每个RT+和RT-反应管中加入4 µL RNA提取物，向NTC反应管中加入水。</li>
		<li>将反应管放入实时PCR仪中，并设置PCR程序如下：50 °C反应30分钟，95 °C预变性15分钟，随后进行40个循环（94 °C变性45秒，60 °C退火延伸1分钟），并在绿色和黄色荧光通道进行信号采集。 
		注意： 绿色通道为Mtb检测用荧光染料，黄色通道为提取对照检测用荧光染料。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>结果解读 
	注意： 同一样本的重复反应Cq值差异不应超过1个标准差。Mtb和EC的Cq值高于30时判为阴性。更多解读细节参见表2。
	<ol>
		<li>为评估治疗反应，利用标准曲线将Cq值转换为细菌载量（eCFU/mL）。根据治疗随访期间细菌载量的变化来判断治疗反应。 
		注意： 治疗后细菌载量下降提示治疗反应良好（即抗结核药物正在杀灭结核杆菌）；若细菌载量无变化或升高，则提示治疗反应不佳，可能意味着结核杆菌对药物耐药或患者未依从治疗方案。TB-MBLA检测到的细菌载量下降与MGIT培养阳性时间（TTP）延长呈正相关。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 透射电子显微镜
<ol>
	<li>将2 mL的热灭活培养物及对照样品分装至2 mL微量离心管中，在20,000 × g 条件下离心10分钟。</li>
	<li>弃去上清液，将沉淀物重悬于700 µL细胞固定缓冲液中，室温孵育5分钟以固定细胞。</li>
	<li>将悬液在16,000 × g 条件下离心30分钟，获得致密沉淀。弃去上清液，替换为含1%蔗糖的磷酸盐缓冲液（PBS）。将沉淀物在4 °C的蔗糖溶液中保存，直至进行电镜切片。</li>
	<li>切片与透射电子显微镜观察 
	注意： 以下方案改编自Griffiths等人的研究28。
	<ol>
		<li>将细胞沉淀在含2.1 M蔗糖的PBS中4 °C过夜，进行低温保护处理。用冰预冷的水洗涤3次。</li>
		<li>将经低温保护处理的细胞沉淀在液氮中冷却，并安装至低温切片机样品 stub 上。使用低温切片机切割90 nm的超薄切片。</li>
		<li>使用钨丝环，以PBS中含2%甲基纤维素与2.1 M蔗糖的1:1混合液捞取切下的切片。</li>
		<li>将切片转移至表面涂有Pioloform的150目六边形铜网（TEM载网）上，可在4 °C保存，或直接进行步骤5.4.5。</li>
		<li>将载网在醋酸铀中染色，并在甲酸甲酯液膜中空气干燥。用冰预冷的水清洗载网，随后在5分钟内用两滴PBS洗涤，干燥15−30分钟。按照仪器制造商的说明，在透射电子显微镜下观察切片。 
		注意： 除洗涤步骤在室温下进行外，所有标记步骤均在冰温（液体温度）下进行。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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作者无任何利益冲突需要披露。

本文表明，在80 °C、85 °C和95 °C条件下加热处理20分钟可有效灭活结核病样本，从而使结核分枝杆菌最低抑菌浓度测定（TB-MBLA）能够在非生物安全三级（CL3）实验室中安全开展，避免对实验室工作人员造成感染风险。研究结果与以往部分研究的观察一致，但与另一些关于热灭活结核分枝杆菌（Mtb）有效性的研究存在差异25,30。例如，有报告指出，在菌量较高的样本中，80 °C加热处理效果不佳25,31,32,33。本研究通过确保所有痰液样本和纯培养物均以每15 mL离心管1 mL的体积进行加热，提供了足够的空间使样本各部分充分接触沸热环境，从而避免了高密度接种物效应27。
热灭活后RNA的保存使得TB-MBLA检测成为可能。该发现与两项已证明热灭活后RNA仍可保存的研究结果一致12,34。我们证实，热灭活样本中的RNA在37 °C下可稳定保存4天，这意味着实验室可通过将灭活样本在室温下保存一周来集中进行批次检测。使用需要冷藏或冷冻的RNA提取试剂盒时，在室温下保存热灭活样本的能力消除了在资源有限环境中开展TB-MBLA检测对冷链运输和生物安全三级实验室的需求。
使用16S rRNA作为标记时，细菌载量的损失不到1个对数级。尽管活菌样本与热灭活样本之间存在差异，但热灭活造成的损失极小，不足以影响下游实验结果。升高温度并未增加RNA的损失量，表明观察到的损失与热处理无关。高温热处理很可能导致细胞裂解，使RNA暴露于RNase而发生降解。事实上，在热灭活组分中外源添加RNase A会加快RNA降解速率。煮沸不能降低RNase的活性，说明该蛋白具有极强的稳定性。
需要注意的是，平均1.5 log10&#160;eCFU/mL 的RNA降解量并不算显著损失。基于此，我们推测加热仅裂解了少量结核分枝杆菌（Mtb）杆菌，从而仅暴露了少量RNA至RNase。通过透射电子显微镜（TEM）我们证实，95 °C加热对Mtb的细胞形态及细胞壁完整性几乎无影响。这意味着，要显著降解RNA，可能需要多种生理因素以及充足的RNase供应，例如在宿主环境中才具备这些条件35,36。此外，由于16S rRNA是核糖体的结构组分，其对RNase的敏感性可能较低37,38。单个Mtb细胞含有约700个核糖体/0.1 mm3细胞质37，表明每个细胞中rRNA的含量较高。因此，少量RNase对其影响可能较小38。大量核糖体的存在使得TB-MBLA在检测灵敏度以及检出结核病低菌荷患者方面具有优势。
TB-MBLA测定的细菌载量与MGIT培养TTP之间存在强相关性。这在一定程度上证实了细菌载量是培养阳性结果的驱动因素。然而，TB-MBLA的优势在于其能够直接定量样本中存在的分枝杆菌载量，且在检测前无需结核分枝杆菌（Mtb）细胞增殖。相比之下，培养法的阳性时间取决于细菌载量水平以及Mtb细胞的增殖速率。未来的研究将在常规临床环境中评估TB-MBLA的工作流程，包括热灭活步骤。该研究还将探讨具有不同细菌载量的样本，以了解在热灭活后可能由阳性转为阴性（即细菌数量减少）的样本数量。
用于细菌载量分子定量的结核病-细菌载量测定（TB-MBLA）方案是细菌学领域的首个此类方法。该方法可直接从患者痰液中定量结核分枝杆菌（Mtb）的杆菌载量，且无需进行培养。这使其速度更快，并提高了在临床决策中评估患者病情进展的潜力。热灭活步骤降低了感染风险，使得TB-MBLA在不具备三级生物安全实验室条件的环境中也具有更高的适用性。在样本完成热灭活后，共有三个步骤可获得TB-MBLA结果：RNA提取、逆转录（RT）-qPCR，以及qPCR结果分析。
从患者样本中分离结核分枝杆菌（Mtb）RNA的效率越高，结果的质量就越高。需要注意的是，痰液样本的质量会影响所分离RNA的产量。例如，唾液性痰液被视为低质量样本，通常与较低的杆菌负荷量相关。这意味着对患者进行高质量痰液咳出的培训非常重要。为了评估提取过程的效率，需在RNA提取前向样本中加入提取对照（即已知数量的非Mtb细胞）。成功回收提取对照可证实RNA提取过程的有效性。除非成功回收提取对照，否则RNA分离过程不能视为有效。鉴于Mtb是一种具有较强抵抗力的生物体，机械裂解成为该过程中的关键步骤。在珠粒（即裂解基质）存在下以高速（600 rpm）均质化样本可有效裂解细胞。对裂解物进行纯化后得到含有RNA和DNA的提取物。去除DNA是RNA提取过程中至关重要的最后一步。结核病信使RNA检测法（TB-MBLA）旨在通过定量RNA来测量活菌数量。因此，若未能去除基因组DNA，则检测结果中将包含来自DNA的信号，而DNA并非细胞活力的良好指标6。
RT-qPCR 采用双重标记探针同时检测结核分枝杆菌（Mtb）和提取对照。该过程包括三个步骤：在 50 °C 下由逆转录酶进行 30 分钟逆转录，95 °C 下变性 15 分钟，以及在 94 °C 和 60 °C 下进行 40 个循环的扩增。荧光信号的采集发生在 60 °C（即片段延伸阶段）。需要注意的是，TB-MBLA 已针对特定的 qPCR 仪器进行了优化，因此使用其他 qPCR 平台的操作人员应根据自身设备优化反应条件。通过在无逆转录酶（RT）的情况下对每个样本运行单次反应，以控制 DNA 去除的效率。该反应若出现阳性结果，则表明 DNA 未完全去除。对于 DNA 含量较高的高载量样本，可能需要加倍使用 DNase 酶以彻底去除 DNA。幸运的是，在细菌载量较高的样本中，少量 DNA 的存在对 RNA 检测结果的影响较小。核糖体 RNA（rRNA）是 TB-MBLA 的检测靶标，其天然含量约为 DNA 的两倍37。在 PCR 中，以溶解 PCR 试剂所用水作为无模板对照（NTC），用于监控是否存在外源性 DNA 或 RNA 的交叉污染。若 NTC 出现阳性信号，则提示存在交叉污染，该结果视为无效。这意味着所有使用该批水配制的溶液均需丢弃，并使用新开封的水重新配制。建议将 PCR 用水分装保存，以避免整批水被污染。阳性对照（Mtb RNA）用于监控 PCR 整体扩增效率。
结果分析需利用标准曲线将PCR的Cq值转换为细菌载量（即每毫升的估计菌落形成单位）。建立并优化标准曲线是此步骤的关键。推荐标准曲线的扩增效率为0.95–1。在对患者或其他检测样本进行仪器检测之前，应先建立并优化结核分枝杆菌（MTb）和提取对照的标准曲线。TB-MBLA试剂盒中已提供标准品。建议将RNA提取物进行10倍稀释后用于PCR检测。这意味着最终每毫升的细菌载量结果需将检测结果乘以10。需要注意的是，TB-MBLA检测中Cq值高于30被视为阴性。为评估治疗反应，至少需要两个不同时间点测得的前瞻性细菌载量结果。强烈建议其中至少一个结果为治疗前的基线值。然而，若患者的首次细菌载量评估是在治疗过程中进行的，则必须再获取一个时间点的细菌载量测量值，以评估治疗反应。TB-MBLA可在治疗期间相隔3天的时间内区分细菌载量变化，但理想情况下应间隔7天进行两次细菌载量测量。
尽管该方案能够产生有关治疗反应的 informative 定量结果，但其过程仍主要依赖人工操作，需要大量时间进行 RNA 提取。繁忙实验室的技术人员可能无法投入如此多的时间。目前正在进行相关安排，以实现 RNA 提取和 PCR 过程的自动化。

结核病由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）引起，全球每年报告的新发病例超过 7 × 106 例，其中每年死亡人数超过 1 × 106 例1,2。为扭转这一趋势，世界卫生组织（WHO）提出了包含开发有效诊断和治疗工具在内的三支柱策略3。根据联合国分类，Mtb 属于危险生物物质 B 类，处理疑似 Mtb 阳性的样本需在生物安全三级（CL3）实验室中进行。CL3 实验室的建设和维护成本高昂，因此大多数国家将结核病培养服务集中在区域或国家级机构。这意味着在基层医疗卫生机构中，涂片显微镜检查是最可及的诊断工具。
世界卫生组织（WHO）已批准在第4级医疗卫生机构（主要位于区级）实施Xpert MTB/RIF等快速分子检测技术4,5。一些区级区域面积较大，部分人群难以到达。尽管Xpert MTB/RIF具有优势，但其原理是检测结核分枝杆菌（Mtb）的DNA。DNA是一种稳定的分子，可在细胞死亡后长期存留，因此不适合作为衡量活菌数量以监测治疗反应的可靠标准5,6。基于RNA的检测方法为活菌的准确测定提供了替代方案7,8,9,10,11,12,13。RNA存在多种稳定性不同的类型，包括核糖体RNA（rRNA）、转运RNA（tRNA）和信使RNA（mRNA）。信使RNA与基因表达相关，因此与细胞活性和存活状态关系最为密切14。需要指出的是，基因表达缺失并不等同于细胞死亡，因为像结核分枝杆菌（Mtb）这样的病原体已知可处于无活性（休眠）但仍有活力的状态15,16。因此，rRNA等稳定的RNA分子是活细胞（包括活跃和非活跃状态）更理想的标志物。
Sheridan 利用 Escherichia coli 证明，16S rRNA 的含量随着通过菌落形成单位（CFU）计数测定的细菌生长呈比例增加17。当 E. coli 细菌暴露于抗生素时，CFU 计数和 16S rRNA 含量同时下降。细胞死亡后 rRNA 的减少表明其可作为细胞活力的标志物13,17。基于这一原理，开发了结核病分子细菌载量检测法（TB-MBLA），通过靶向 M. tuberculosis 的 16S rRNA 来测量存活结核杆菌的载量，作为接受抗结核治疗患者治疗反应的指标11,18,19。我们进一步开发并优化了 TB-MBLA，加入了细胞提取对照，以反映 M. tuberculosis 杆菌的裂解情况，并确保该方法在不同环境条件下均具有稳健性20。TB-MBLA 检测的第一步需要从结核分枝杆菌（Mtb）中分离 RNA，此过程必须在三级生物安全实验室（CL3 实验室）中进行，直至 Mtb 细胞完全裂解，以确保操作人员的安全。此外，该方法还包括样本保存步骤，以便后续批量分析，样本需在硫氰酸胍（一种四级毒性物质）中于 -80 °C 保存。为此，我们采用加热法灭活 Mtb，使样本在涂片显微镜检查级别实验室中即可安全地进行 TB-MBLA 检测。
在实验室和临床应用中使用热处理已有数百年历史21,22。然而，某些微生物（如结核分枝杆菌 Mtb）难以杀灭，短时间的热处理不足以杀死所有细胞23,24。一项研究表明，在 80 °C 下加热结核菌培养物 20 分钟可完全杀灭所有 Mtb 杆菌，同时不破坏用于 PCR 扩增所需的 DNA25。此后，目前已有多种实验室 DNA 提取技术采用 95 °C 的加热步骤。我们应用相同原理证明，将结核病样本在 80 °C、85 °C 或 95 °C 下煮沸，均可使 Mtb 失活，同时保留足够的 RNA，以供进行 TB-MBLA 检测。失活后的培养物或痰标本可在密闭容器中于室温或冷藏条件下保存 7 天，而可定量的 rRNA 含量不会降低。
结核病多重液态生物标志物检测（TB-MBLA）目前作为仅用于研究（RUO）的检测方法，具有良好的适应性，已应用于痰液、肺组织和脑脊液等多种样本类型。该技术尚未应用于支气管肺泡灌洗液、血液及其他类型的样本。以痰液为样本时，非洲多中心评估研究的结果（未发表数据）以及既往发表的研究18,26表明，MBLA的敏感性与分枝杆菌生长指示管（MGIT）液体培养法相当。然而，TB-MBLA检测速度更快，可在数小时内获得结果，而培养法则需数天至数周；同时具有高度特异性，不受样本中非结核分枝杆菌微生物的干扰，并可提供疾病严重程度的定量评估。世界卫生组织（WHO）近期已认可TB-MBLA作为替代涂片显微镜检查和培养法用于结核病治疗监测的候选方法2。
本文详细描述了Sabiiti等人发表的热灭活和结核病多药联用生物发光法（TB-MBLA）方案27。该详细方案将为全球TB-MBLA使用者提供一站式的可视化资源。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;热灭活：&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL 离心管</td><td>Fisher-Scientific</td><td>10136120</td><td>若样品体积较大，可使用 50 mL 管</td></tr><tr><td>15 mL 金属丝试管架</td><td>Fisher-Scientific</td><td>11749128</td><td>可使用其他具有相似结构的品牌</td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>Fisher-Scientific</td><td>15700619</td><td>可使用其他具有相似结构的品牌</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;RNA 提取：&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Sigma</td><td>372978-1L</td><td>其他 RNA 提取试剂盒品牌中非必需</td></tr><tr><td>无水乙醇（99–100%）</td><td>Sigma</td><td>51976-500ML-F</td><td>有更大包装可选</td></tr><tr><td>提取对照</td><td>SOI group St Andrews</td><td>VitalbacteriaEC</td><td>随 TB-MBLA Vitalbacteria 试剂盒提供</td></tr><tr><td>FASTRNA Pro blue 试剂盒</td><td>MP Biomedicals</td><td>116025050</td><td>配套提供裂解基质管</td></tr><tr><td>分子级水（无 RNase）</td><td>Sigma</td><td>W4502-1L</td><td>Qiagen、Fisher-Scientific 也可提供相同产品</td></tr><tr><td>Precellys 24 匀浆仪</td><td>VWR</td><td>432-3750</td><td>也可使用 FastPrep（MP Biomedicals）</td></tr><tr><td>冷冻微量离心机，Fresco 21，Heraeus</td><td>Fisher-Scientific</td><td>15352117</td><td>可使用具有相似容量的其他品牌</td></tr><tr><td>恒温混匀仪</td><td>Eppendorf</td><td>BLD-455-010C</td><td>适用于 1–2 mL 管</td></tr><tr><td>TURBO DNA-free</td><td>Fisher-Scientific</td><td>AM1907M</td><td>耗时较长，但比短时去 DNA 方法更有效</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;RT-qPCR：&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>引物和 TaqMan 探针</td><td>SOI group St Andrews</td><td>VitalbacteriaPP</td><td>随 TB-MBLA Vitalbacteria 试剂盒提供。探针荧光基团为 Mtb 使用 FAM（绿色），提取对照（EC）使用 HEX（黄色）。Applied Biosystems qPCR 平台使用 VIC 代替 HEX。</td></tr><tr><td>QuantiTect Multiplex RT-PCR NR 试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>204845</td><td>包含 PCR 混合液及逆转录酶</td></tr><tr><td>RotorGene Q 5plex 仪器</td><td>Qiagen</td><td>9001580</td><td>其他 qPCR 仪器如 Vii7、QuantStudio、StepOnePlus 等也可使用</td></tr><tr><td>0.1 mL 联排管及管盖</td><td>Qiagen</td><td>981103</td><td>根据转子尺寸可选用其他规格管。其他 PCR 平台需使用 96 孔 PCR 板。</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;非热灭活样本保存材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl（pH 7.5）</td><td>Sigma</td><td>93313</td><td>即用型</td></tr><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>Sigma</td><td>63689</td><td>多家合格供应商可提供</td></tr><tr><td>硫氰酸胍（GTC）</td><td>Promega</td><td>V2791</td><td>推荐使用 Promega 品牌以保证质量</td></tr><tr><td>分子级水（无 RNase）</td><td>Sigma</td><td>W4502-1L</td><td>确保 GTC 溶液无核酸酶污染</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;通用材料（使用但非 TB-MBLA 特有）&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>500 mL 塑料容器</td><td></td><td>734-5087</td><td>推荐使用 Nalgene 品牌</td></tr><tr><td>生物废弃物收集罐</td><td></td><td></td><td>多家合格供应商可提供</td></tr><tr><td>化学废弃物收集罐</td><td></td><td></td><td>多家合格供应商可提供</td></tr><tr><td>一次性耐化学手套</td><td></td><td></td><td>多家合格供应商可提供</td></tr><tr><td>冷冻柜（-20 &amp;deg;C）</td><td></td><td></td><td>多家合格供应商可提供</td></tr><tr><td>超低温冰箱（-80 &amp;deg;C）</td><td></td><td></td><td>多家合格供应商可提供</td></tr><tr><td>冰箱（0–8 &amp;deg;C）</td><td></td><td></td><td>多家合格供应商可提供</td></tr><tr><td>通风橱</td><td></td><td></td><td>用于安全操作有毒试剂</td></tr><tr><td>实验室天平</td><td></td><td></td><td>用于试剂的精确称量</td></tr><tr><td>塑料量筒</td><td></td><td></td><td>确保试剂的准确量取</td></tr><tr><td>PCR 反应管</td><td></td><td></td><td>应与所用 PCR 仪器兼容</td></tr><tr><td>移液器及配套无菌滤芯吸头</td><td></td><td></td><td>无 DNA 酶和 RNA 酶，推荐使用 P1000、P200、P10、P2 范围</td></tr><tr><td>Qiagility 加样板</td><td>Qiagen</td><td></td><td>5 孔预混液板、16 孔试剂板、32 孔样本板、72 孔和 96 孔反应板</td></tr><tr><td>QIAgility 移液机器人</td><td>Qiagen</td><td></td><td>对高通量移液至关重要</td></tr><tr><td>1.5 mL 和 2 mL 微量离心管架，以及 15 mL 和 50 mL Falcon 管架</td><td></td><td></td><td>推荐耐化学腐蚀且可高压灭菌的类型</td></tr><tr><td>RNase Away（清除工作区域中的 RNase 酶）</td><td>Fisher Scientific</td><td>10666421</td><td>确保台面和设备无 RNase 酶污染</td></tr><tr><td>耐化学护目镜</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>也可从 Sigma 购得。用于保护眼睛免受有毒试剂伤害。</td></tr><tr><td>无菌巴斯德吸管（1.5–3 mL）</td><td></td><td></td><td>多家合格供应商可提供</td></tr><tr><td>无菌无 RNase 微量离心管</td><td></td><td></td><td>推荐使用适用于 -80 &amp;deg;C 冻存的 1.5 mL 管</td></tr><tr><td>结核病消毒剂，例如 Tristel Fuse</td><td></td><td></td><td>确保新鲜配制或在一周内配制</td></tr><tr><td>涡旋振荡器</td><td></td><td></td><td>推荐 Genie 2 品牌</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;透射电子显微镜&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>戊二醛（8%）</td><td>Sigma</td><td>G7526-10ML</td><td>细胞固定缓冲液（HEPES 缓冲液）的组成部分</td></tr><tr><td>HEPES（pH 7.4，100 mM）</td><td>Sigma</td><td>H4034-25G</td><td>细胞固定缓冲液（HEPES 缓冲液）的组成部分</td></tr><tr><td>Leica FCS 超低温切片机</td><td>Leica</td><td></td><td>用于组织切片的冷冻切片机</td></tr><tr><td>甲基纤维素</td><td>Agar Scientific</td><td>AGG6425</td><td>低温包埋树脂</td></tr><tr><td>多聚甲醛（4% PBS 溶液）</td><td>Sigma</td><td>P6148-500G</td><td>细胞固定缓冲液（HEPES 缓冲液）的组成部分</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma</td><td>84097-250G</td><td>保存和封固介质</td></tr><tr><td>醋酸铀</td><td>Agar Scientific</td><td>AGR1260A</td><td>通用电子显微镜染色剂</td></tr></tbody></table>

结核病分子细菌负荷检测（tb-mbla）

A Tuberculosis Molecular Bacterial Load Assay (TB-MBLA)

结核分枝杆菌（Mtb）是引起结核病的病原体，被联合国（UN）归类为危险的B类生物物质。为保障工作人员安全，所有疑似含有Mtb的样本操作必须在三级防护（CL 3）实验室中进行。结核病分子细菌负荷检测（TB-MBLA）是一种逆转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）检测，利用针对16S rRNA的引物和双标记探针来定量Mtb的杆菌负荷。本文描述了通过热灭活处理使结核病样本失去感染性，同时保留RNA以用于TB-MBLA检测的方法。取1 mL痰液样本置于密闭的15 mL离心管中，分别在80 °C、85 °C或95 °C下煮沸20分钟，以灭活Mtb杆菌。将热灭活样本与对照（活菌）样本培养42天，证实结核杆菌已被杀死。随后向灭活样本中加入100 µL提取对照物，并按照标准RNA提取流程进行RNA提取。经热处理的样本在培养中未观察到任何生长。所提取的RNA进行实时RT-qPCR检测，扩增Mtb 16S rRNA基因中的特异性靶序列，结果以定量循环数（Cq）形式输出。通过标准曲线将Cq值转换为细菌负荷，即每毫升估计菌落形成单位（eCFU/mL）。Cq值与样本的细菌负荷呈反比关系。该方法的局限性在于热灭活会导致部分细胞裂解，使RNA暴露于RNase酶中，造成小于&#60;1 log10eCFU/mL（即&#60;10 CFU/mL）的损失。后续研究将确定因热灭活导致极低负荷患者出现假阴性结果的比例。

加热可灭活所有M. tuberculosis杆菌 
对照组（活菌）的光密度（OD）随时间逐渐增加（0.04OD–0.85OD），而加热灭活样本的光密度无变化，分别表明有生长和无生长（图1）27。类似地，对照临床痰标本在MGIT中第3天即显示阳性生长，而加热灭活的临床样本在整个培养期间均未报告阳性。MGIT中结核分枝杆菌（Mtb）的生长通过Ziehl-Neelsen抗酸染色显微镜检查及MPT64抗原检测确认29。
灭活样品中的 RNA 在 37 °C 下可稳定保持 4 天 
将热灭活的样品在 37 °C 下孵育，以确定细胞热灭活后 RNA 是否发生降解。在 BCG 培养物（图 2A-C）和结核病阳性痰液（图 2D）中，热灭活后立即（第 0 天）收获的 RNA 与第 1、2、3 和 4 天分离的 RNA 之间均未发现差异。
外源性RNase可提高热灭活组分中RNA的降解速率 
为确定RNA未发生降解的原因，在热灭活前和/或热灭活后外源性添加RNase A酶（1,000 U/mL）。结果导致RNA减少量相当于细菌载量分别降低1.5 ± 0.3、1.8 ± 0.2 和 1.3 ± 0.1 – log10 eCFU/mL（在80 °C、85 °C 和 95 °C下孵育4天）。在热灭活前后添加RNase的样品中，RNA降解程度存在差异（图3A-C）。
使用16S rRNA作为参考标记物可保留足够的RNA用于TB-MBLA 
热灭活对结核分枝杆菌BCG菌株培养物及结核病阳性患者痰液中rRNA的影响进行了测定。对照组BCG培养物的细菌载量为5.3 ± 0.2 log10 eCFU/mL，为 0.2 ± 0.1 log10 高于联合的 5.1 ± 0.3 log eCFU/mL10 热灭活培养物的eCFU/mL（ANOVA p &lt; 0.0001）在 80 °C, 85 °C，以及 95 °C (图4A)27同样，对照患者痰液中的细菌载量为 7.1 log10 eCFU/mL，为 0.8 ± 0.1 log10 高于联合值 6.3 ± 0.41 log eCFU/mL10eCFU/mL 80 °C, 85 °C，以及 95 °C (图 4B)27细菌负荷的减少程度 &lt;两种被测样本中均存在1log。
Sidak 多重比较检验显示，95 °C 时的细菌载量与 80 °C 和 85 °C 时相比存在显著差异（p = 0.001）。在所有温度下，结核病（TB）样本之间均未发现差异，p = 0.8。
大多数结核分枝杆菌细胞的细胞壁完整性在加热过程中未被破坏 
通过透射电子显微镜（TEM）我们检测了细胞是否因热灭活而发生裂解。将经多聚甲醛固定的细胞沉淀制成超薄切片，并嵌入富电子介质中，随后进行TEM观察。在低倍和高倍镜下观察细胞，均可见完整的细胞壁以及明显的细胞内脂质体。细胞在形态上呈拉长状，但并未发生裂解。图5展示了分枝杆菌细胞在不同放大倍数下的形态特征。上方两幅图像显示了细胞内脂质体以及未受干扰的绳索样菌索结构，后者是分枝杆菌属典型的形态学特征。下方两幅图像为更高倍数的放大视图，进一步展示了脂质体的细节，并揭示了一些微细的细胞内结构。
通过结核分枝杆菌最低检测限扩增法（TB-MBLA）测定的细菌载量与MGIT培养阳性时间呈负相关 
对于治疗有反应的患者，在整个治疗过程中，细菌载量平均每周下降1 log10 eCFU/mL。快速应答者下降速度更快，通常在治疗2周内转为阴性（细菌载量为零）。TB-MBLA测得的细菌载量下降与MGIT培养阳性时间（TTP）的延长相对应。图6展示了细菌载量与MGIT TTP之间存在的负相关关系。然而，两者的区别在于，TB-MBLA结果可在4小时内获得，且检测时间不依赖于细菌载量水平；相比之下，MGIT培养检测则需要5–25天。此外，非结核细菌污染会进一步影响培养检测结果的可靠性。
<img alt="光密度生长曲线；600 nm 下活菌与热灭活样品在 40 天内的比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60460/60460fig1v3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 1"> 
图 1：在 80 °C（点状曲线）、85 °C（点划线曲线）和 95 °C（虚线曲线）下 BCG 灭活效果的验证。对照组（黑色曲线）为未加热的活 BCG 菌液，接种于相同的培养基中。通过培养期间菌液 OD 值的上升确认了对照组中的生长。该图改编自 Sabiiti 等人27。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60460/60460fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="细菌生长曲线；培养天数与载量（log10 CFU/mL）；多组数据比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60460/60460fig2v3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2：在 37 °C 下孵育 4 天（D0–D4）的热灭活样本中可定量 RNA 的稳定性。（A）、（B）和（C）分别显示在 80 °C、85 °C 和 95 °C 下灭活的 BCG 培养物。（D）显示在 80 °C 下灭活的结核病痰液样本。对照组为同一样本未经处理（活菌）的部分。误差线 = 标准差。每次实验重复三次，每轮九个重复。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60460/60460fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细菌载量柱状图，RNase作用研究，CFU/mL随天数变化，不同孵育条件比较结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60460/60460fig3v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：外源添加RNase A酶后RNA降解程度更高。（A）80 °C热失活，（B）85 °C热失活，以及（C）95 °C热失活。误差线 = 平均值的标准误差。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60460/60460fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="热灭活BCG和结核分枝杆菌的细菌载量比较；带统计显著性的散点图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60460/60460fig4v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图4"> 
图4：利用16S rRNA作为标记物，通过TB-MBLA测定细菌载量时RNA的充分保存情况。（A）来自体外BCG培养物的细菌载量估计值。（B）来自结核病阳性痰液样本的细菌载量估计值。误差条表示均值标准误（A和B分别为n = 18和20个重复）。该图改编自Sabiiti等人的研究27。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60460/60460fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="真菌菌丝的电子显微镜图像，显示不同放大倍数下的超微结构。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60460/60460fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 5"> 
图5：结核分枝杆菌（Mtb）杆菌经95 °C加热灭活20分钟后完整的电子显微镜图像。 透射电子显微镜（TEM）下可见清晰完整的细胞壁以及大量脂质体。上方：低倍镜图像显示一群细胞，呈现出未受干扰的分枝杆菌绳索样索状形态及细胞内脂质体。下方：对上图区域的高倍放大，以更清晰地展示脂质体及部分细胞内微细结构。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60460/60460fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清大图。</a>
<img alt="细菌载量与MGIT TTP随周数变化；折线图显示治疗效果；微生物学数据。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60460/60460fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 6"> 
图6：一名接受抗结核治疗的患者在12周内的治疗反应曲线，显示TB-MBLA测得的细菌载量与MGIT TTP呈负相关。随着患者对治疗产生反应，细菌载量（蓝色曲线）下降，而TTP（红色曲线）上升。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60460/60460fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td rowspan="2">主混合液</td>
			<td>反转录阳性反应</td>
			<td>反转录阴性反应</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>每反应体积 × 反应数 + 5</td>
			<td>每反应体积 × 反应数 + 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantitect 混合液</td>
			<td>10.0 μL</td>
			<td>10.0 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mtb16S 引物混合液（F + R）</td>
			<td>0.4 μL</td>
			<td>0.4 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mtb16S 探针</td>
			<td>0.2 μL</td>
			<td>0.2 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EC 引物混合液（F + R）</td>
			<td>0.4 μL</td>
			<td>0.4 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EC 探针</td>
			<td>0.2 μL</td>
			<td>0.2 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>反转录酶（RT enzyme）</td>
			<td>0.2 μL</td>
			<td>-------</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>无 RNase 水</td>
			<td>4.6 μL</td>
			<td>4.8 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>总体积</td>
			<td>16 µL</td>
			<td>16 μL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：结核病-MBLA qPCR 的主混合液制备指南。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>类型</td>
			<td>MTB 通道</td>
			<td>EC 通道</td>
			<td>结果判读</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>样本</td>
			<td>阳性</td>
			<td>阳性</td>
			<td>有效</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>样本</td>
			<td>阳性</td>
			<td>阴性</td>
			<td>不确定</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>样本</td>
			<td>阴性</td>
			<td>阳性</td>
			<td>有效</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>样本</td>
			<td>阴性</td>
			<td>阴性</td>
			<td>无效</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTB + 对照</td>
			<td>阳性</td>
			<td>阴性</td>
			<td>有效</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>提取对照 (EC)</td>
			<td>阴性</td>
			<td>阳性</td>
			<td>有效</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA 对照</td>
			<td>阴性</td>
			<td>阴性</td>
			<td>有效</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>阴性对照 (NTC)</td>
			<td>阴性</td>
			<td>阴性</td>
			<td>有效</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：结核病MBLA结果解读指南。

我们介绍一种在痰液经加热灭活后进行的结核病分子细菌载量检测方法。加热灭活可使痰液样本失去传染性，从而无需在生物安全三级实验室中进行结核病分子检测。

结核病分子细菌负荷检测（TB-MBLA）

结核病由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）引起，该病原体被联合国（UN）归类为危险的B类生物……

该结核病分子细菌检测可回答三个关键问题。第一：患者的疾病负荷程度如何？第二：患者的疾病负荷对抗结核药物的治疗反应如何？第三：疾病负担与治疗反应之间存在怎样的关系？该检测可定量测定患者结核病的疾病负担，并在短时间内评估治疗过程中疾病负担的变化情况。经过适当改进后，该方法还可应用于其他细菌性病原体。我们已经开发出类似的检测技术，用于诊断非结核分枝杆菌以及与慢性阻塞性肺疾病相关的细菌。首次操作该技术时，请观看视频并练习各个步骤。务必使用不需要用于患者诊断结果的样本进行练习。直观演示至关重要，因为它有助于简化学习和掌握实验步骤，特别是那些难以用文字描述的方法环节。首先准备细胞培养物。在洁净的实验台或一级生物安全柜中，将1 mL对数生长期的卡介苗（Bacille Calmette-Guerin 或 BCG）培养物分装至15 mL塑料离心管中，并 tightly close them。在处理患者的痰液样本时，应在通风良好的环境中操作，并遵循《GL One Stop 结核病手册》中的指南。小心打开样本杯，用移液器将一毫升等分试样加入15毫升塑料离心管中，然后紧紧盖上管盖。将样本管转移至已预热至95摄氏度的水浴中的支架上，确保每支管子有3/4部分浸入水中。将样本煮沸20分钟。随后，将管子转移至实验台，于室温下冷却5分钟。若使用含酚氯仿或高浓度乙醇的试剂盒，应在通风橱内进行RNA提取。此处展示的RNA提取方法为酚氯仿提取法。但也可采用其他RNA提取方法。将灭活后的样品各1毫升分装至1.5毫升离心管中，并向每个样品中加入100微升提取对照。盖紧管盖，通过倒置混匀三次。在20,000 × g离心10分钟。然后，吸除上清液，留下 50 微升沉淀。用移液器将沉淀重悬于 950 微升裂解缓冲液中，并将整个悬液转移至 RNA 提取试剂盒提供的裂解矩阵管中。 tightly close the tubes and ensure that they are labeled on both the lid and the side.然后，在6,000 rpm条件下匀质化样品40秒。在室温下以12,000 ×g离心裂解液5分钟。同时，准备新的1毫升离心管，并加入300微升氯仿。使用1 mL移液器小心吸取上清液，避免接触裂解基质，并将其转移至含有氯仿的离心管中。涡旋振荡离心管5秒，静置5分钟，或直至出现清晰的三层相。在12,000 × g条件下离心5分钟。然后，小心吸取上层相并转移至一个 1.5 毫升离心管中。向样品中加入 500 微升预冷的 100% 乙醇，盖紧管盖，倒置混匀三次。将离心管置于 -80 °C 冰箱中孵育 15 分钟，或置于 -20 °C 冰箱中孵育 30 分钟。然后，将离心管放入预冷的微量离心机中，在4°C条件下以13,000 × g离心20分钟。弃去上清液，加入500 µL预冷的70%乙醇，再在13,000 × g条件下离心10分钟。弃去所有上清液。将离心管置于50摄氏度孵育20分钟，以干燥核酸沉淀，注意保持离心管部分开启，以便乙醇蒸发。随后，向沉淀中加入100 µL无核水，在室温下孵育5分钟。涡旋混匀样品3秒，然后进行DNA去除步骤，或于-80摄氏度保存至后续使用。根据说明书指示配制DNA预混液，取11微升加入每管含有RNA提取物的试管中。涡旋振荡3秒，短暂离心以去除管壁上的液滴。然后将试管置于金属浴或培养箱中，在37摄氏度下孵育30分钟。孵育结束后，直接向管中加入额外的一微升 DNA 的一酶，并通过涡旋充分混匀。然后，在 37 摄氏度下再孵育管子 30 分钟。解冻 DNA 失活试剂，并进行涡旋。然后，向每份RNA提取物中加入10 µL。在室温下孵育5分钟，在孵育过程中涡旋振荡试管3次。然后，将混合物在13,000 × g条件下离心2分钟，并小心地将上清液转移至一个1.5毫升的无RNA酶的离心管中，注意避免接触任何失活基质。将所有未知RNA样本用无RNA酶的水按1:10的比例稀释，随后涡旋混匀5秒，并短暂离心。解冻MTB和EC-RNA样本，并分别制备7个和6个10倍系列稀释样本，用于标准曲线的绘制。根据手稿说明配制含逆转录酶和不含逆转录酶的PCR预混液。涡旋混匀含逆转录酶的预混液，取16 µL加入每个含逆转录酶的PCR管中。然后涡旋混匀不含逆转录酶的预混液，取16 µL加入每个不含逆转录酶的PCR管中。向 RT 加管中加入 4 µL RNA 提取物或水，并做重复。水作为无模板对照（NTC）。向 RT 减管中加入 4 µL RNA 提取物或水。将反应管放入实时PCR仪中，按照文稿中所述程序设置反应并运行。为解读治疗反应，使用标准曲线将CQ值转换为细菌载量，并计算治疗随访期间细菌载量的变化以评估反应。治疗后细菌载量下降表示呈阳性反应，而细菌载量无变化或升高则提示为阴性反应。为了验证所有结核分枝杆菌杆菌是否均已热灭活，检测了细胞的光密度，并与活细胞的光密度进行了比较。热灭活样品在培养过程中未观察到OD值随时间发生变化，表明无细菌生长。将热灭活样品在37摄氏度下孵育，以确定细胞热灭活后RNA是否发生降解。在BCG培养物和结核病阳性痰液样本中，热灭活后立即提取的RNA与热灭活后1天、2天、3天及4天提取的RNA之间未发现差异。当在热灭活前后向样本中外源添加RNA的A酶时，在4天培养期间，所有经热灭活的样本均出现RNA降解。在BCG培养物和结核病阳性患者痰液中检测了热灭活对核糖体RNA的影响。对照培养物的细菌载量高于BCG和痰液样本在80摄氏度、85摄氏度和95摄氏度下热灭活培养物的总细菌载量。样本的热灭活仅导致RNA的轻微损失，仍可保留足够的RNA用于后续的结核病分子检测（TB-MBLA）及其他下游分子检测。采用透射电子显微镜检测热灭活是否导致细胞裂解。在低倍和高倍镜下观察细胞，可见完整的细胞壁以及明显的细胞内脂质体。细胞呈伸长状，但未发生裂解。在进行该操作时，必须注意加入提取对照，以排除因RNA提取效果不佳而导致的假阴性结果。该方法可应用于与慢性阻塞性肺疾病、非结核分枝杆菌感染以及其他呼吸道病原体相关的细菌研究。TB-MBLA 提供的定量结果使得研究人员能够对患者对结核病治疗的反应进行数学建模和药理学建模。我们期待将该技术应用于结核病患者的常规临床管理中。

a-tuberculosis-molecular-bacterial-load-assay-tb-mbla

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

结核病分子细菌负荷测定（TB-MBLA）

我们介绍一种结核分枝杆菌计数的替代方法...

一种功能性全血检测法，用于测定分枝杆菌的存活能力，使用报告基因标记的卡介苗或结核分枝杆菌（BCG lux/M.Tb lux）

Xpert MTB/RIF 检测整合了样本去污染、免手动操作、仪器内置样本处理以及超灵敏的半巢式 PCR 技术，可在约两小时内对咳出的痰液或浓缩痰沉淀物中的结核分枝杆菌（Mycobacterium...

使用Xpert MTB/RIF检测法诊断肺结核

在此，我们介绍一种表型检测方法，适用于小干扰合成RNA（siRNA）、化学化合物的高通量/高内涵筛选 结核分枝杆菌 突变文库。该方法依赖于荧光标记的检测 结核分枝杆菌...

一种用于高通量/高内涵筛选的细胞内分枝杆菌定量显微表型检测方法

扩增微阵列将不对称PCR扩增与微阵列杂交整合于同一反应腔室中，显著简化了终端用户的微阵列操作流程。简化微阵列操作流程是开发适用于资源有限环境的微阵列诊断技术的必要第一步。...

展示一种多重耐药性Mycobacterium tuberculosis扩增微阵列

显微解剖已广泛用于组织内DNA、RNA和蛋白质的检测。激光捕获显微切割（LCM）是最常用的方法，但一种新的研磨技术——中解剖（mesodissection）最近也已出现。我们展示了从中解剖的结核分枝杆菌Mycobacterium...

一种用于回收的新型显微解剖方法 结核分枝杆菌 福尔马林固定石蜡包埋肺肉芽肿中的特异性转录本

我们开发了一种模块化的高通量筛选系统，用于发现针对Mycobacterium...

靶向细胞内目标抑制剂的药效与细胞毒性筛选系统 结核分枝杆菌

开发能够改进下一代抗结核药物早期药物研发流程的新模型和新检测方法具有重要意义。本文介绍了一种快速、经济且符合生物安全二级（BSL-2）标准的检测方法，可用于评估药物对结核分枝杆菌（Mycobacterium...

一种适用于高通量筛选的药物疗效评估方法，用于检测药物对巨噬细胞传代后病原体的有效性 结核分枝杆菌

快速高效地定量细胞内结核分枝杆菌（M.

用于结核病宿主导向疗法临床前测试的自动化培养系统

菌落形成单位（CFU）的测定是定量细菌（包括需要数周时间才能形成可见菌落的Mycobacterium...

用于评估结核病疫苗效力的微菌落形成单位检测法

本文描述了在活体动物中进行细菌感染生物发光成像的方法。通过改造病原体使其表达荧光素酶，从而实现对活体动物体内感染的光学整体成像。可利用表达荧光素酶的病原体感染动物模型，并通过生物发光成像实时观察疾病的发展过程。...

利用荧光素酶对小鼠细菌感染进行成像

了解结核病分子细菌负荷测定法，通过95摄氏度热灭活痰液样本后进行实时PCR定量检测。该方法无需高等级生物安全实验室即可安全监测患者治疗反应及疾病负担变化。

结核病分子细菌负荷检测（TB-MBLA）

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