结核病分子细菌负荷检测（TB-MBLA）

该结核病分子细菌检测可回答三个关键问题。第一：患者的疾病负荷程度如何？第二：患者的疾病负荷对抗结核药物的治疗反应如何？

第三：疾病负担与治疗反应之间存在怎样的关系？该检测可定量测定患者结核病的疾病负担，并在短时间内评估治疗过程中疾病负担的变化情况。经过适当改进后，该方法还可应用于其他细菌性病原体。

我们已经开发出类似的检测技术，用于诊断非结核分枝杆菌以及与慢性阻塞性肺疾病相关的细菌。首次操作该技术时，请观看视频并练习各个步骤。务必使用不需要用于患者诊断结果的样本进行练习。

直观演示至关重要，因为它有助于简化学习和掌握实验步骤，特别是那些难以用文字描述的方法环节。首先准备细胞培养物。在洁净的实验台或一级生物安全柜中，将1 mL对数生长期的卡介苗（Bacille Calmette-Guerin 或 BCG）培养物分装至15 mL塑料离心管中，并 tightly close them。

在处理患者的痰液样本时，应在通风良好的环境中操作，并遵循《GL One Stop 结核病手册》中的指南。小心打开样本杯，用移液器将一毫升等分试样加入15毫升塑料离心管中，然后紧紧盖上管盖。

将样本管转移至已预热至95摄氏度的水浴中的支架上，确保每支管子有3/4部分浸入水中。将样本煮沸20分钟。随后，将管子转移至实验台，于室温下冷却5分钟。

若使用含酚氯仿或高浓度乙醇的试剂盒，应在通风橱内进行RNA提取。此处展示的RNA提取方法为酚氯仿提取法。但也可采用其他RNA提取方法。

将灭活后的样品各1毫升分装至1.5毫升离心管中，并向每个样品中加入100微升提取对照。盖紧管盖，通过倒置混匀三次。在20,000 × g离心10分钟。

然后，吸除上清液，留下 50 微升沉淀。用移液器将沉淀重悬于 950 微升裂解缓冲液中，并将整个悬液转移至 RNA 提取试剂盒提供的裂解矩阵管中。 tightly close the tubes and ensure that they are labeled on both the lid and the side.

然后，在6,000 rpm条件下匀质化样品40秒。在室温下以12,000 ×g离心裂解液5分钟。同时，准备新的1毫升离心管，并加入300微升氯仿。

使用1 mL移液器小心吸取上清液，避免接触裂解基质，并将其转移至含有氯仿的离心管中。涡旋振荡离心管5秒，静置5分钟，或直至出现清晰的三层相。在12,000 × g条件下离心5分钟。

然后，小心吸取上层相并转移至一个 1.5 毫升离心管中。向样品中加入 500 微升预冷的 100% 乙醇，盖紧管盖，倒置混匀三次。将离心管置于 -80 °C 冰箱中孵育 15 分钟，或置于 -20 °C 冰箱中孵育 30 分钟。

然后，将离心管放入预冷的微量离心机中，在4°C条件下以13,000 × g离心20分钟。弃去上清液，加入500 µL预冷的70%乙醇，再在13,000 × g条件下离心10分钟。弃去所有上清液。

将离心管置于50摄氏度孵育20分钟，以干燥核酸沉淀，注意保持离心管部分开启，以便乙醇蒸发。随后，向沉淀中加入100 µL无核水，在室温下孵育5分钟。涡旋混匀样品3秒，然后进行DNA去除步骤，或于-80摄氏度保存至后续使用。

根据说明书指示配制DNA预混液，取11微升加入每管含有RNA提取物的试管中。涡旋振荡3秒，短暂离心以去除管壁上的液滴。然后将试管置于金属浴或培养箱中，在37摄氏度下孵育30分钟。

孵育结束后，直接向管中加入额外的一微升 DNA 的一酶，并通过涡旋充分混匀。然后，在 37 摄氏度下再孵育管子 30 分钟。解冻 DNA 失活试剂，并进行涡旋。

然后，向每份RNA提取物中加入10 µL。在室温下孵育5分钟，在孵育过程中涡旋振荡试管3次。

然后，将混合物在13,000 × g条件下离心2分钟，并小心地将上清液转移至一个1.5毫升的无RNA酶的离心管中，注意避免接触任何失活基质。将所有未知RNA样本用无RNA酶的水按1:10的比例稀释，随后涡旋混匀5秒，并短暂离心。解冻MTB和EC-RNA样本，并分别制备7个和6个10倍系列稀释样本，用于标准曲线的绘制。

根据手稿说明配制含逆转录酶和不含逆转录酶的PCR预混液。涡旋混匀含逆转录酶的预混液，取16 µL加入每个含逆转录酶的PCR管中。然后涡旋混匀不含逆转录酶的预混液，取16 µL加入每个不含逆转录酶的PCR管中。

向 RT 加管中加入 4 µL RNA 提取物或水，并做重复。水作为无模板对照（NTC）。向 RT 减管中加入 4 µL RNA 提取物或水。

将反应管放入实时PCR仪中，按照文稿中所述程序设置反应并运行。为解读治疗反应，使用标准曲线将CQ值转换为细菌载量，并计算治疗随访期间细菌载量的变化以评估反应。治疗后细菌载量下降表示呈阳性反应，而细菌载量无变化或升高则提示为阴性反应。

为了验证所有结核分枝杆菌杆菌是否均已热灭活，检测了细胞的光密度，并与活细胞的光密度进行了比较。热灭活样品在培养过程中未观察到OD值随时间发生变化，表明无细菌生长。将热灭活样品在37摄氏度下孵育，以确定细胞热灭活后RNA是否发生降解。

在BCG培养物和结核病阳性痰液样本中，热灭活后立即提取的RNA与热灭活后1天、2天、3天及4天提取的RNA之间未发现差异。当在热灭活前后向样本中外源添加RNA的A酶时，在4天培养期间，所有经热灭活的样本均出现RNA降解。在BCG培养物和结核病阳性患者痰液中检测了热灭活对核糖体RNA的影响。

对照培养物的细菌载量高于BCG和痰液样本在80摄氏度、85摄氏度和95摄氏度下热灭活培养物的总细菌载量。样本的热灭活仅导致RNA的轻微损失，仍可保留足够的RNA用于后续的结核病分子检测（TB-MBLA）及其他下游分子检测。采用透射电子显微镜检测热灭活是否导致细胞裂解。

在低倍和高倍镜下观察细胞，可见完整的细胞壁以及明显的细胞内脂质体。细胞呈伸长状，但未发生裂解。在进行该操作时，必须注意加入提取对照，以排除因RNA提取效果不佳而导致的假阴性结果。

该方法可应用于与慢性阻塞性肺疾病、非结核分枝杆菌感染以及其他呼吸道病原体相关的细菌研究。TB-MBLA 提供的定量结果使得研究人员能够对患者对结核病治疗的反应进行数学建模和药理学建模。我们期待将该技术应用于结核病患者的常规临床管理中。