Name: 硅氮化物膜的细胞培养和同步加速器X射线荧光纳米分析的冷冻制备 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: 学习硅氮化物膜细胞培养与同步加速器X射线荧光纳米分析的冷冻制备方法。该技术通过快速冷冻固定保存细胞结构完整性，实现钾、硫、锌等元素的亚细胞水平分布成像分析。

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在纳米成像光束线ID16A上进行的实验是在ESRF提案LS2430、LS2303和LS2765的框架下完成的。

<ol><li>Lewis, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+synchrotron+nanoimaging+and+DNA+damage%2Fgenotoxicity+screening+of+novel+lanthanide-coated+nanovectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Intracellular synchrotron nanoimaging and DNA damage/genotoxicity screening of novel lanthanide-coated nanovectors.</a> Nanomedicine. 5 (10), 1547-1557 (2010).</li>
<li>Fus, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intracellular+localization+of+osmocenyl-tamoxifen+derivatives+in+hormone-independent+breast+cancer+cells+revealed+by+2D+and+3D+nano+X-ray+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Angwendte+Chemie%22%5BJournal%5D)">The intracellular localization of osmocenyl-tamoxifen derivatives in hormone-independent breast cancer cells revealed by 2D and 3D nano X-ray fluorescence imaging.</a> Angwendte Chemie. , (2019).</li>
<li>Janssens, K., Adams, F., Rindby, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJanssens%2C+K+%22Microscopic+X-Ray+Fluorescence+Analysis%22">Microscopic X-Ray Fluorescence Analysis</a>. , Wiley. Chichester, UK. (2000).</li>
<li>Carmona, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uranium+exposure+of+human+dopaminergic+cells+results+in+low+cytotoxicity%2C+accumulation+within+sub-cytoplasmic+regions%2C+and+down+regulation+of+MAO-B%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology%22%5BJournal%5D)">Uranium exposure of human dopaminergic cells results in low cytotoxicity, accumulation within sub-cytoplasmic regions, and down regulation of MAO-B.</a> Neurotoxicology. 68, 177-188 (2018).</li>
<li>Leapman, R. D., Hunt, J. A., Buchanan, R. A., Andrews, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+low+calcium+concentrations+in+cryosectioned+cells+by+parallel-EELS+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Measurement of low calcium concentrations in cryosectioned cells by parallel-EELS mapping.</a> Ultramicroscopy. 49 (1-4), 225-234 (1993).</li>
<li>Saubermann, A. J., Echlin, P., Peters, P. D., Beeuwkes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+scanning+electron+microscopy+to+X-ray+analysis+of+frozen+hydrated+sections.+I.+Specimen+handling+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Application of scanning electron microscopy to X-ray analysis of frozen hydrated sections. I. Specimen handling techniques.</a> Journal of Cell Biology. 88 (2), 257-267 (1981).</li>
<li>Saubermann, A. J., Heyman, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+digital+X-ray+imaging+using+frozen+hydrated+and+frozen+dried+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Quantitative digital X-ray imaging using frozen hydrated and frozen dried tissue sections.</a> Journal of Microscopy. 146, Pt2 169-182 (1987).</li>
<li>Wroblewski, J., Roomans, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+microanalysis+of+single+and+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scanning+Electron+Microscopy%22%5BJournal%5D)">X-ray microanalysis of single and cultured cells.</a> Scanning Electron Microscopy. , Pt 4 1875-1882 (1984).</li>
<li>Wroblewski, J., Müller, R. M., Wroblewski, R., Roomans, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+X-ray+microanalysis+of+semi-thick+cryosections%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry%22%5BJournal%5D)">Quantitative X-ray microanalysis of semi-thick cryosections.</a> Histochemistry. 77 (4), 447-463 (1983).</li>
<li>Zierold, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreparation+of+mammalian+tissue+for+X-ray+microanalysis+in+STEM%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Cryopreparation of mammalian tissue for X-ray microanalysis in STEM.</a> Journal of Microscopy. 125, Pt2 149-156 (1982).</li>
<li>Harkiolaki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-soft+X-ray+tomography%3A+Using+soft+X-rays+to+explore+the+ultrastructure+of+whole+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Topics+in+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cryo-soft X-ray tomography: Using soft X-rays to explore the ultrastructure of whole cells.</a> Emerging Topics in Life Sciences. 2 (1), 81-92 (2018).</li>
<li>McDermott, G., Le Gros, M. A., Knoechel, C. G., Uchida, M., Larabell, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+X-ray+tomography+and+cryogenic+light+microscopy%3A+the+cool+combination+in+cellular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Soft X-ray tomography and cryogenic light microscopy: the cool combination in cellular imaging.</a> Trends in Cell Biology. 19 (11), 587-595 (2009).</li>
<li>Schneider, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cellular+ultrastructure+resolved+by+X-ray+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cellular ultrastructure resolved by X-ray microscopy.</a> Nature Methods. 7 (12), 985-987 (2010).</li>
<li>Sorrentino, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MISTRAL%3A+a+transmission+soft+X-ray+microscopy+beamline+for+cryo+nano-tomography+of+biological+samples+and+magnetic+domains+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Synchrotron+Radiation%22%5BJournal%5D)">MISTRAL: a transmission soft X-ray microscopy beamline for cryo nano-tomography of biological samples and magnetic domains imaging.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 22 (4), 1112-1117 (2015).</li>
<li>Carzaniga, R., Domart, M. C., Duke, E., Collinson, L. M. Correlative cryo-fluorescence and cryo-soft X-ray tomography of adherent cells at European synchrotrons. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCarzaniga%2C+R+%22Methods+in+Cell+Biology%22">Methods in Cell Biology</a>. 124, Academic Press. 151-175 (2014).</li>
<li>Perrin, L., Carmona, A., Roudeau, S., Ortega, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+sample+preparation+methods+for+single+cell+quantitative+elemental+imaging+using+proton+or+synchrotron+radiation+focused+beams%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Analytical+Atomic+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Evaluation of sample preparation methods for single cell quantitative elemental imaging using proton or synchrotron radiation focused beams.</a> Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 30 (12), 2525-2532 (2015).</li>
<li>Jin, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preserving+elemental+content+in+adherent+mammalian+cells+for+analysis+by+synchrotron-based+x-ray+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Preserving elemental content in adherent mammalian cells for analysis by synchrotron-based x-ray fluorescence microscopy.</a> Journal of Microscopy. 265 (1), 81-93 (2017).</li>
<li>Daoust, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+manganese+on+primary+hippocampal+neurons+from+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Impact of manganese on primary hippocampal neurons from rodents.</a> Hippocampus. 24 (5), 598-610 (2014).</li>
<li>Daoust, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manganese+Cytotoxicity+Assay+on+Hippocampal+Neuronal+Cell+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Manganese Cytotoxicity Assay on Hippocampal Neuronal Cell Culture.</a> Bio-protocol. 5 (1), 1368(2015).</li>
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<li>Vavpetič, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elemental+distribution+and+sample+integrity+comparison+of+freeze-dried+and+frozen-hydrated+biological+tissue+samples+with+nuclear+microprobe%5BTitle%5D)+AND+%22Nuclear+Instruments+and+Methods+in+Physics+Research+Section+B%3A+Beam+Interactions+with+Materials+and+Atoms%22%5BJournal%5D)">Elemental distribution and sample integrity comparison of freeze-dried and frozen-hydrated biological tissue samples with nuclear microprobe.</a> Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section B: Beam Interactions with Materials and Atoms. 348, 147-151 (2015).</li>
<li>Guerquin-Kern, J. L., Bordat, C. Cryo-preparation procedures for elemental imaging by sims and eftem. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGuerquin-Kern%2C+JL+%22Handbook+of+Cryo-Preparation+Methods+for+Electron+Microscopy%22">Handbook of Cryo-Preparation Methods for Electron Microscopy</a>. , CRC Press. 499-536 (2008).</li>
<li>Gramaccioni, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+quantification+of+intracellular+element+concentration+by+X-ray+fluorescence+microscopy+combined+with+X-ray+phase+contrast+nanotomography%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Physics+Letters%22%5BJournal%5D)">Nanoscale quantification of intracellular element concentration by X-ray fluorescence microscopy combined with X-ray phase contrast nanotomography.</a> Applied Physics Letters. 112 (5), 053701(2018).</li>
<li>Perrin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+and+Copper+Effects+on+Stability+of+Tubulin+and+Actin+Networks+in+Dendrites+and+Spines+of+Hippocampal+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Zinc and Copper Effects on Stability of Tubulin and Actin Networks in Dendrites and Spines of Hippocampal Neurons.</a> ACS Chemical Neurosciences. 8 (7), 1490-1499 (2017).</li>
<li>Ortega, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B1-synuclein+over-expression+induces+increased+iron+accumulation+and+redistribution+in+iron-exposed+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">α-synuclein over-expression induces increased iron accumulation and redistribution in iron-exposed neurons.</a> Molecular Neurobiology. 53 (3), 1925-1934 (2016).</li>
<li>Fartmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+imaging+of+atomic+and+molecular+species+in+cancer+cultures+with+TOF-SIMS+and+Laser-SNMS%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Surface+Sciences%22%5BJournal%5D)">Quantitative imaging of atomic and molecular species in cancer cultures with TOF-SIMS and Laser-SNMS.</a> Applied Surface Sciences. 231 (2), 428-431 (2004).</li>
<li>Pålsgård, E., Lindh, U., Roomans, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+freeze-substitution+techniques+for+X-ray+microanalysis+of+biological+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+and+Techniques%22%5BJournal%5D)">Comparative study of freeze-substitution techniques for X-ray microanalysis of biological tissue.</a> Microscopy Research and Techniques. 28 (3), 254-258 (1994).</li>
</ol>

作者无利益冲突。

冷冻电子显微技术（cryo-EM）获得了2017年诺贝尔化学奖，以表彰J. Dubochet在生物材料玻璃化方面的贡献，该技术实现了溶液中生物大分子高分辨率结构的测定25。正如Dubochet在其诺贝尔奖演讲中所述：“掌握如何将一滴水玻璃化是一回事，而为生物学观察制备生物样品则是另一回事”25。目前，冷冻制样步骤已被视为减轻辐射剂量损伤、并在接近天然状态下研究细胞的标准技术。然而，样品制备过程仍然十分繁琐。这是因为电子显微技术具有无与伦比的空间分辨率，对样品制备过程中产生的任何超微结构伪影均极为敏感。同步辐射冷冻纳米探针目前也正面临类似的挑战，其在高能X射线范围内的空间分辨率已接近低至13 nm的水平26。硬X射线显微技术能够对完整细胞进行分析，而电子显微技术则受限于电子穿透能力较差，只能观察非常薄的细胞切片。
细胞单层足够薄，通过在液态乙烷中快速浸入冷冻，即可达到水玻璃化所需的冷却速率。理论上，使用高压冷冻可实现高达108 K/s的冷却速率27，从而能够对过厚而不适合浸入冷冻的样品进行玻璃化。使用本文介绍的自动浸入冷冻装置及参数，可重复稳定地达到在常压下实现样品完全玻璃化所需的105 K/s冷却速率28。这使得研究人员能够通过在液态乙烷中浸入冷冻的方法，对较薄的生物样品（&#60;10 µm）如细胞单层12,13,14,15,29,30进行玻璃化处理。
该方案的一个重要挑战是尽可能保持细胞内含物的化学完整性，以在二维或三维条件下提供细胞内可靠的元素分布。如其他文献2,16,17,31所述，在亚细胞水平进行元素成像时，应考虑分析冷冻水合状态下的细胞。否则，可采用将细胞快速冷冻后冻干的方法，以便在室温下进行分析。在后一种方法中，非晶态冰通过升华过程去除，而结合水分子则通过解吸过程去除。与冷冻水合样品相比，该过程可能远非理想，因为可能导致细胞膜及某些亚细胞结构形态的改变32。此外，在化学形态研究中，脱水过程可能导致金属形态的人为假象。尽管如此，该方法已被成功应用，并且是在亚100 nm水平进行元素成像时，除冷冻水合样品外的最佳选择2,16,17,18,20,33,34,35,36。
据已有报道37，冷冻保存细胞制剂的质量可通过钾钠比（K/Na）进行评估。然而，由于本研究中所用硬X射线纳米探针配备的硅漂移探测器在检测元素X射线荧光光子时存在较低的能量截止限制（E ≥ 1.3 keV 镁），目前尚无法测定该比值。事实上，较高的K/Na比值（&#62;10) 可通过飞行时间二次离子质谱（TOF-SIMS）、电子探针显微分析（EPMA）或核微探针PIXE测量16,37 表明细胞的化学完整性得以保持，相较于活细胞中预期的25的K/Na比值37这可以通过同时较低的 Cl/K 比值来支持38然而，玻璃化过程若不完善，特别是当样品冷却速度过低时，可能导致形成较大的冰晶，从而损伤细胞膜和细胞器，继而改变化学元素的分布。尽管目前尚无常规方法用于监测此类潜在损伤及其对细胞内元素分布的影响，但上述元素比例分析，以及利用X射线相位衬度成像或低温软X射线显微镜对细胞进行高分辨率成像的能力，可能是评估细胞内区室结构良好保存且元素完整性得以维持的最佳手段。结合这些技术，并使用新开发的低温相关荧光光学显微镜，将有助于评估此类损伤发生的程度及其对细胞内元素分布的影响。
总体而言，本文提供了一套详细且全面的细胞样品制备方案，用于同步辐射X射线荧光纳米分析。该方案为科研界提供了一个良好的起点，有助于解决如何为（冷冻）硬X射线纳米探针下的二维和三维元素成像制备合适细胞样品这一难题。这些方法可与光学荧光显微和电子显微技术相结合，实现对细胞进行深入的化学与结构关联成像研究。

新设计的同步辐射X射线荧光（SR-XRF）纳米探针能够以完全定量的方式可视化元素在亚细胞结构中的分布。例如，这种分析能力可用于研究纳米颗粒1或基于锇的金属有机分子复合物等有机金属分子的摄取情况2，从而深入了解具有强效抗癌特性的金属基分子在细胞内的摄取过程。作为一种多元素分析技术，结合纳米探针的SR-XRF3可同时对大多数生物学重要元素进行定量和定位，包括磷、硫、钾、钙、铁、铜和锌。实际上，利用硬X射线可实现较大的穿透深度，从而以无标记的方式对完整冷冻水合细胞进行成像。此外，X射线荧光能够高效激发，因为它可覆盖大多数目标元素的K边。采用低温方法可减少辐射损伤，并优化细胞结构及元素分布的保存。
目前可用于研究细胞中金属元素的大多数空间分辨分析技术均为表面分析技术，需要制备非常薄且平整的细胞切片。这些技术主要包括配备能量色散X射线分析的扫描透射电子显微镜（STEM–EDX）、能量过滤透射电子显微镜（EF-TEM）以及纳米二次离子质谱（nanoSIMS）。其中，nanoSIMS 无法用于分析冷冻含水状态的细胞切片，而冷冻电子显微技术虽可在无与伦比的空间分辨率下进行低温分析，但其元素检测灵敏度较低。粒子诱导X射线发射（PIXE）技术则实现了对完整细胞内元素分布的研究，具有全定量分析的优势，并在微米尺度甚至亚微米分辨率下具备良好的元素灵敏度。4，但存在辐射损伤问题，且缺乏低温能力来研究冷冻水合状态的细胞。上述所有分析技术在细胞元素成像方面相互补充，但对于所有技术而言，样品制备过程都是至关重要的步骤。该过程应尽可能简化，以最大限度减少可能的污染以及元素的再分布或泄漏，从而获得有意义的结果。正如电子显微镜中所展示的，采用低温工作流程，包括细胞的低温固定以及向低温扫描载台的低温转移，可实现接近天然状态的亚细胞水平上的最佳元素保存5,6,7,8,9,10这一理解已成功应用于同步辐射冷冻软X射线显微镜（如全视野显微镜和扫描显微镜）的开发中，用于对完整冷冻水合细胞进行二维或三维超微结构成像。已开发出多种低温工作流程11 美国劳伦斯伯克利国家实验室先进光源2.1光束线（XM-2）的软X射线显微镜12，德国电子储存环BESSY II的U41-XM光束线13中国台湾，ALBA光源（西班牙）MISTRAL光束线14，以及 Diamond 光源的 B24 光束线15，以及其他方法。最近有研究显示，类似的流程是利用X射线微探针对细胞内元素进行分析时最可靠的样品制备与保存方法16,17.
尽管X射线纳米探针技术，特别是低温同步辐射X射线荧光（SR-XRF）技术，已开始广泛应用于细胞元素分析，但迄今为止，尚未向科研界发布过系统的操作流程。本文提供了一种详细的实验方案，用于制备在氮化硅膜上以单层培养并经冷冻固定的贴壁细胞，以便在低温条件下进行分析。此外，还提供了一个冻干步骤，适用于在室温下进行X射线分析的情况。虽然该方案已成功应用于人乳腺癌细胞MD-MB-2312，且冻干步骤已在小鼠神经元等多种细胞中得到验证18,20,21，但该方法可轻松推广至多种人类或动物细胞类型。

<table><tbody><tr><td>乙酸铵溶液，BioUltra，分子生物学用，~5M in H2O</td><td>SIGMA</td><td>09691-250mL</td><td>可使用高纯度乙酸铵粉末和超纯水配制所需溶液，但需调节pH值和渗透压。</td></tr><tr><td>B27添加剂，50倍浓缩液</td><td>Life Technologies，Invitrogen</td><td>17504-044</td><td>用于海马神经元培养</td></tr><tr><td>杜尔贝科&amp;rsquo;磷酸盐缓冲液，DPBS（不含 CaCl₂，不含 MgCl₂）</td><td>GIBCO</td><td>14190-094</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>含酚红/谷氨酰胺I的DMEM培养基（ATCC改良型）</td><td>GIBCO</td><td>21885025</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>杜尔贝科&amp;rsquo;DMEM（杜尔贝科改良伊格尔培养基）</td><td>Life Technologies，Invitrogen</td><td>31966-02</td><td>用于海马神经元培养</td></tr><tr><td>Dumont 镊子 #5，直头自闭合，尖端尺寸 0.05×0.01 mm，生物学用</td><td>世界精密仪器公司</td><td>501202</td><td></td></tr><tr><td>Emitech K750X 帕尔贴冷却式电子显微镜冷冻干燥仪</td><td>Quorum Technology</td><td>EK3147</td><td></td></tr><tr><td>乙烷 N45</td><td>空气液体</td><td>p0505s05r0a001</td><td>C2H6 &gt; 99,995 %</td></tr><tr><td>胎牛血清，性能增强型，经认证一次性使用包装，美国来源</td><td>GIBCO</td><td>A31604-02</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>HBSS 10倍浓缩液</td><td>Life Technologies，Invitrogen</td><td>14185-052</td><td>用于海马神经元培养</td></tr><tr><td>Leica GP 快速释放镊子</td><td>Leica</td><td>16706435</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-231细胞系，一种上皮性人乳腺腺癌细胞</td><td>ATCC</td><td>ATCC HTB-26</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>Neurobasal 培养基</td><td>Life Technologies，Invitrogen</td><td>21103-049</td><td>用于海马神经元培养</td></tr><tr><td>Nunc 4孔板</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>176740</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>Osmo1 单样本微渗透压计</td><td>高级仪器</td><td>Osmo1</td><td>替代品可在 Fisher Scientific（Wescor Inc. VAPRO）找到&amp;reg; 蒸汽压渗透压计</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>SIGMA</td><td>P4333</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸</td><td>SIGMA</td><td>P4707</td><td>可依据拟在膜上培养的细胞类型选择其他类型的包被材料，可相应测试其他黏附因子，如纤连蛋白、胶原蛋白、多聚鸟氨酸等。细胞可直接在氮化硅膜上培养，但此类膜略具疏水性，除非经过亲水化处理（如辉光等离子体放电处理），否则建议使用黏附因子。</td></tr><tr><td>Leica EM GP 主机（冷冻载网制备仪）</td><td>Leica</td><td>16706401</td><td>自动压片机的替代设备包括 Vitrobot Mark IV (FEI)、CryoPlunge 3 (Gatan) 和 MS-002 Rapid Immersion Freezer (EMS)。也可使用手动自制系统，但冷冻压片过程若在环境可控的密闭腔室内进行将更具优势。</td></tr><tr><td>氮化硅膜（Si3N4）</td><td>Silson Ltd.</td><td>SiRN-5.0(o)-200-1.5-500-NoHCl</td><td>建议的氮化硅膜类型已针对ESRF ID16A线站的X射线纳米探针分析进行了优化。本方案中选择500 nm厚度的膜，因其在细胞操作和冷冻固定过程中具有更高的机械强度。也可使用200 nm或更薄的膜，但其较为脆弱。其他类型的氮化硅膜（例如适用于透射电镜的膜）可从Sislon或Norcada、SPI Supplies、Ted Pella、EMS、LabTech、Neyco等公司购买。</td></tr><tr><td>0.4% 台盼蓝溶液</td><td>GIBCO</td><td>15250061</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>0.05% 胰蛋白酶-EDTA</td><td>GIBCO</td><td>25300-054</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>超痕量元素分析级超纯水</td><td>Fisher Chemicals</td><td>W9-1</td><td>可使用MilliQ水，但必须使用例如ICP-MS分析等方法检测其痕量元素污染水平。</td></tr><tr><td>预切孔的沃特曼1号滤纸</td><td>Leica</td><td>16706440</td><td>可使用其他滤纸，其外径必须为55 mm，可使用徕卡（Leica）的滤纸打孔系统（货号：16706443）。</td></tr></tbody></table>

在氮化硅膜上进行细胞培养及用于同步辐射x射线荧光纳米分析的低温制样

Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis

关于金属离子在亚细胞水平的分布，目前所知甚少。然而，这些化学元素具有重要的调控功能，其稳态失衡与多种疾病相关。先进的同步辐射X射线荧光纳米探针技术具备足够的灵敏度和空间分辨率，能够揭示整个细胞内细胞器水平上金属元素的二维（2D）和三维（3D）分布及其浓度。这为研究金属在细胞生理与病理过程中的作用开辟了全新的、令人振奋的科学领域。细胞样品制备是其中关键且往往复杂的步骤，尤其对于基础分析而言更是如此。尽管X射线荧光技术现已广泛应用，并已采用多种样品制备方法，但针对如何最佳保留细胞内元素含量的研究仍极为有限，迄今为止尚无关于贴壁细胞用于X射线荧光纳米探针分析的冷冻制备步骤的详细分步方案发布。本文描述了一种分步细胞制备方案，通过快速冷冻固定，实现在具备低温环境与转移条件时，对处于冷冻水合状态的细胞进行同步辐射X射线荧光纳米分析。若需在室温下进行纳米分析，则额外提供了一种对冷冻固定的贴壁细胞样品进行冷冻干燥的处理步骤。所提出的这些方案已在先前的研究中成功应用，最近一次用于研究有机金属化合物在乳腺癌细胞内的二维和三维细胞内分布。

聚-L-赖氨酸包被的硅片上继代培养的冷冻水合MDA-MB-231细胞的典型光学视频显微镜图像3N4 膜支撑结构如图所示 图7A在ESRF的ID16A光束线上，使用专用的在线视频显微镜以反射模式获取了真空腔室内样品的光学图像。22。尽管电子显微镜或软X射线显微镜要求包埋细胞的冰层尽可能薄（通常 &lt;0.5 µm），硬X射线（&gt;10 keV）具有穿透深度大得多和剂量沉积低的优势。因此，冰层厚度可以更大，通常 &lt;10 µm 包括细胞，使包埋细胞的冰层略厚几微米 µm 厚度。这可以通过测量样品透射的X射线强度与无样品时的强度进行比较来估算，同时考虑500 nm厚Si的吸收影响。3N4 膜。通过本方案所述的手动 blotting 方法可达到此冰层厚度。在牛顿环区域，冰层可更薄（未测量）。
近天然状态下冷冻水合细胞的X射线荧光元素分布图如图7B所示，展示了钾（K）、硫（S）和锌（Zn）等生理元素的典型分布情况。这些图谱表示的是元素的面密度（即元素的投影质量）。尽管本研究未进行归一化处理，但此类图谱可通过基于X射线传播的相位衬度成像进行归一化，从而获得样品投影质量的估算值23。许多研究报道指出，在接近天然状态保存的细胞中，高度可扩散的K离子被认为在整个细胞内均匀分布23,24,16。如图7B中的二维X射线荧光元素图像所示，与K类似，紧密结合的元素S在细胞内也呈均匀分布，可较好地反映细胞的质量分布轮廓。Zn在细胞核中的信号强于细胞质，并清晰勾勒出细胞核的轮廓。值得注意的是，在核区域可于空间分辨率（50 nm）下检测到若干富锌的小区域。
现有的X射线纳米探针或即将建造的设备未必具备低温功能。在此情况下，获得空间分辨率优于100 nm的细胞X射线荧光图像的最佳替代方法是：在将细胞进行浸入式冷冻后，按照本方案所述进行冷冻干燥处理。图8A展示了直接培养在Si3N4膜上的小鼠原代海马神经元经冷冻干燥后的典型明场显微镜图像。此类样品若保存在洁净且干燥的干燥环境中，可提前1−2周制备，并可用普通直立光学显微镜观察以定位感兴趣区域。应特别注意避免样品暴露于环境湿度中，因为冷冻干燥后的样品可能吸收水分，从而在X射线纳米束照射下造成损伤。该方法已成功应用于极为敏感的细胞（如神经元细胞），而对于其他更为稳定的细胞类型（如癌细胞），所获结果甚至更佳。与浸入式冷冻的细胞类似，整个冷冻干燥细胞上K、S和Zn的X射线荧光图像与上文所述相似，能够代表在50−100 nm空间分辨率下各类冷冻干燥细胞中元素分布的典型特征。尽管对完整细胞进行冷冻干燥是一种保持元素完整性的替代方法，但其代价是无法完美保留细胞形态16，尤其是细胞膜结构。
<img alt="带有传感器胶囊的电子药丸；医疗诊断技术，创新药物递送系统。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 1"> 
图 1：X射线荧光纳米分析的典型样品支撑装置。 位于保护胶囊内的Si3N4薄膜支撑。此类基底既可用于常温分析（先进行样品速冻制备，再经低温低真空冷冻干燥过程），也可用于低温X射线荧光分析。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="用于实验分析的聚-L-赖氨酸涂层氮化硅膜上的细胞黏附示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：细胞接种后氮化硅窗口的示意图。 细胞直接培养在涂有聚-L-赖氨酸的 Si3N4 膜支撑的平坦表面上。有时气泡会滞留在 Si3N4 膜支撑的背面空腔中，需按照本方案所述方法予以去除。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="3D打印组件、两种几何设计的比较、环形结构、视觉分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3：自主开发的3D打印冷冻盒，用于在液氮杜瓦瓶中长期保存浸入式冷冻的Si3N4薄膜支撑片。（A）冷冻盒拆解状态，包含容器和盖帽（下部）；（B）盖帽锁紧后的组装状态。盖帽可用镊子操作，通过旋转实现开启或锁定。详细的3D打印设计图可向ESRF ID16A申请获取。该设计专为容纳氮化硅透射电镜载网而设计。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="使用镊子在微孔板装置中进行固体取样，用于材料分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig4.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 4"> 
图 4：在氮化硅（Si3N4）上培养的细胞的吸液处理。 在进行冷冻浸入前，需先将生长在氮化硅（Si3N4）膜上的细胞单层用醋酸铵溶液清洗（A），然后使用滤纸小心地手动吸除多余液体（B）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="切片与电子显微镜设备；切片刀（A），用于样品切片的超薄切片机（B-D）" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图5"> 
图5：自动浸入式冷冻电镜EM-GP设备。（A）自动浸入式冷冻仪。（B）环境控制室，镊子已锁定在其中。（C）盛有乙烷的容器，上方连接着徕卡液化装置，并与乙烷气瓶相连。（D）浸入式冷冻装置，显示装满液态乙烷的黑色容器，以及用于后续将玻璃态Si3N4膜在液氮（LN2）中储存的冷冻盒。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="冷冻研磨装置，包含旋转研磨机和研杵；示意图突出显示了处理步骤。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig06.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图6"> 
图6：冻干程序的样品冷冻转移装置示例。 (A第一个用于硅的黄铜接收器3N4 膜被安装在冻干机供应商提供的样品转移架顶部。B）和（C显示第二个扁平黄铜圆盘用作盖子，并作为冷阱腔室插入冷冻干燥机的真空腔室内。D) 带弹簧加载转移杆的完整组件。E) 携带玻璃化细胞样品的样品台，该细胞样品在硅片上培养3N4 膜必须进一步插入液氮中2-冷冻干燥机。组装的所有步骤均在液氮（LN）中进行2 在泡沫塑料箱中。为清晰起见，所有图像均在无液氮条件下生成2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="显微结构分析示意图；Si框架，Si₃N₄膜；元素分布图：K、S、Zn分布。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig07.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图7"> 
图7：利用硬X射线纳米探针获得的冷冻水合细胞的低温X射线荧光图像。（A）在ESRF ID16A光束线专用光学视频显微镜下，以反射模式进行的典型在线观察图像。经过手动 blotting 后，冰层总厚度约为5−10 µm，可清晰观察到冷冻水合细胞。图中可见具有牛顿环的区域，表明该处冰层更薄。（B）生理元素钾（K）、硫（S）和锌（Zn）的代表性低温X射线荧光细胞分布图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig7large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="使用映射技术对钾、硫、锌进行细胞元素分析。显微镜与光谱成像结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig08.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图8"> 
图8：利用硬X射线纳米探针对冻干神经元细胞进行X射线荧光成像。 （A）直接培养在Si3N4膜上的冻干细胞的典型明场显微图像。比例尺 = 200 µm。（B）单个冻干海马神经元在室温下的代表性X射线荧光图像，显示生理元素钾（K）、硫（S）和锌（Zn）的分布情况。比例尺 = 2 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig8large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本文介绍了一种在氮化硅膜上进行细胞培养，并在利用同步辐射低温X射线纳米探针进行X射线荧光成像前进行 plunge-freezing（骤冷）的实验方案。若仅需室温纳米分析，冷冻样品可进一步进行冷冻干燥。这些步骤对于获取细胞内元素组成信息至关重要。

在氮化硅膜上进行细胞培养及用于同步辐射X射线荧光纳米分析的低温制样

关于金属离子在亚细胞水平的分布，目前所知甚少。然而，这些化学元素具有重要的调控功能……

新设计的同步辐射X射线荧光纳米探针可实现对样品元素分布的可视化。必须采用低温技术以减缓X射线辐射造成的损伤。因此，快速冷冻固定对于获得处于水合冻结状态的细胞至关重要，以最大限度地保持细胞结构及其化学完整性的原貌。用于同步辐射研究的细胞样品制备具有较高的特异性，因此本方案已优化用于获取冷冻水合的单层细胞。直观演示对于理解如何操作单层细胞样品至关重要，以确保可重复地获得包埋在薄冰层中的冷冻固定细胞。在准备氮化硅膜支撑片时，打开装有膜支撑片的胶囊，轻轻挤压胶囊，使支撑片略微松动。使用细镊子夹住硅胶框架的一角，注意不要触碰到框架中心的氮化硅膜，将框架放入超净工作台中的无盖培养皿内。然后对膜进行25至30分钟的紫外灭菌。灭菌结束后，加入10微升的包被因子，如聚-L-赖氨酸。在37摄氏度、5%二氧化碳及湿度条件下孵育25分钟。然后向无菌48孔板的每孔中加入200至250微升经0.22微米滤膜过滤的超纯水和超微量级水。使用精细镊子，在一个水孔中将膜垂直浸入，并连续进行三次、每次10秒的漂洗。清洗后，将膜垂直放置于超净工作台中的无菌96孔板的空孔内，静置过夜直至干燥。接种目标细胞时，将包被好的膜平面向上放入无菌4孔板的一个孔中。在不接触膜表面的前提下，将5 × 10⁴个细胞溶于10 µL适当培养基中，加至氮化硅膜表面。液滴应覆盖整个膜表面。随后在37摄氏度、5%二氧化碳及湿润条件下培养细胞。当细胞开始贴附于基质时，沿每个孔的孔壁缓慢加入一毫升完全培养基，使培养基覆盖每张膜。然后将细胞在37摄氏度、5%二氧化碳及湿度条件下进行培养。对于细胞样品的冷冻固定，首先打开自动浸入式冷冻仪，并在12孔塑料板中加入适当数量的37摄氏度乙酸铵缓冲液。在冲洗并进行膜样品浸入冷冻前，立即从培养箱中取出样品，并使用一对快速释放镊子的黑色夹紧环来解锁镊子。使用解锁的镊子夹住膜支撑架，并将膜垂直浸入乙酸铵缓冲液中约五秒钟。为去除多余的缓冲液，将膜支撑架底部轻压在滤纸上，并将框架的每一侧在滤纸上轻轻吸干，注意使膜不接触滤纸。当多余缓冲液去除后，打开环境舱门，迅速将镊子滑入镊子联锁装置内，然后关闭舱门。按压印迹A的骤冷装置。夹持氮化硅膜的镊子将迅速浸入冷冻剂中。骤冷完成后，用预冷的镊子取下转移容器的盖子，并按压转移。将氮化硅膜略微移至低温液体上方。通过一次快速的单向动作，将镊子从镊子互锁装置中滑出并略微倾斜，使镊子直接进入装有液氮的转移容器中冷冻盒的空槽内。然后松开黑色夹紧环，释放膜片。对于浸入式冷冻细胞的冷冻干燥，使用冷冻干燥仪后侧面板上的摇杆开关打开仪器电源。当显示屏显示“准备加载样品，请按 Enter 键”时，将氮化硅膜铜质支架安装在供应商提供的聚苯乙烯储存容器内的样品转移支架顶部，并保持液氮液面位于第一块铜件顶部边缘下方约一至两毫米处。将膜的细胞样品面朝上放入黄铜支架的编号腔室中，并在装有液氮的聚苯乙烯泡沫盒中预冷转移杆。用该杆固定整个组件，按回车键打破真空以打开冷冻干燥室的盖子，立即把样品转移到冷冻干燥室内，并关闭冷冻干燥室的盖子。随后立即按开始键继续进行冷冻干燥循环。冻干循环结束后，按停止键释放真空腔内的压力，取下整个组件以获取冻干样品。此处展示的是将乳腺癌细胞系细胞传代培养于聚-L-赖氨酸包被的氮化硅膜支撑体上后，处于冷冻水合状态的典型光学视频显微镜图像。对这些冷冻水合细胞进行X射线荧光元素成像，可揭示钾、硫和锌等生理元素的分布情况。在此代表性示例中，紧密结合的硫元素在细胞内的分布均匀，其分布模式与钾元素相似，能够较好地反映细胞的质量分布特征。然而，锌元素的分布则在细胞核内的信号强于细胞质，且细胞质与细胞核之间的信号界限清晰分明。在此典型的明场显微镜图像中，经冷冻干燥后直接培养于氮化硅膜上的原代小鼠海马神经元呈现出典型的神经元形态，其形态未受到培养或保存方法的影响。对浸入式冷冻细胞进行X射线荧光成像，同样可在50至100纳米的空间分辨率下揭示这些代表性冷冻干燥细胞所表现出的典型元素分布。绘制氮化硅窗口对于在浸入冷冻后获得尽可能薄的细胞冰层至关重要。在亚细胞水平上保持细胞的化学完整性，使得研究人员能够利用同步辐射纳米探针以及其他微区分析技术对细胞的金属组学进行探索。由于并非所有同步辐射纳米探针分析都能在低温条件下进行，因此可将冷冻水合的细胞进一步冷冻干燥，以便在室温下进行分析。操作液氮时请务必佩戴合适的人体防护装备，并始终在通风橱内远离火焰处使用乙烷气体。

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Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

硅氮化物膜的细胞培养和同步加速器X射线荧光纳米分析的冷冻制备

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用于液相电子显微镜的化学固定哺乳动物细胞石墨烯封装

我们提出了一种用于大分子高分辨率结构研究的冷冻生物样品冷冻聚焦离子束微加工薄片制备方案 原位 使用冷冻电子断层扫描技术。本方案提供了制备高质量、高重复性薄片的指南，用于对细胞内大分子的结构进行表征 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）.

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利用硅纳米膜分析流程对饮用水中微塑料进行多模态分析

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