利用 Tg(Vtg1:mcherry) 斑马鱼胚胎检测内分泌干扰物的雌激素效应

环境中存在大量内分泌干扰物（EDC）化学物质，主要是雌激素类物质。由于属于该类别的物质化学结构多样，因此检测难度较大，需要采用不同的方法进行检测。仅根据化学结构，很难判断一种物质是否真正具有雌激素活性。

此外，这些物质在环境中从不以纯态存在，因此其效应也可能受到其他化合物的影响。这一问题可通过效应导向分析方法解决，例如利用生物监测和对雌激素效应敏感的生物指示生物。已知某些基因在生物体内对雌激素会表现出敏感反应。

通过分子方法检测基因产物可在蛋白质或 mRNA 水平进行，但通常需要牺牲实验动物。动物保护法规日益严格，人们对替代性检测系统的需求不断增长。跨基因技术顺应了这一发展趋势，而荧光蛋白的发现则为生物标志物的创建开辟了道路。

通过此类方法，可体内检测雌激素敏感基因的激活情况。本视频展示了一种利用vtg:1mCherry转基因斑马鱼胚胎检测雌激素类物质的可能方法，并以两种化合物为例进行说明。该实验方案可作为研究不同化学物质或环境样品对生物标志物胚胎产生雌激素效应的基础。

本实验所用的斑马鱼品系为卵黄原蛋白报告基因转基因斑马鱼品系。该品系利用 Tol2 转座子系统构建而成。用于品系构建的转基因载体包含较长的天然卵黄原蛋白-1 启动子序列，并含有大量 ERI 位点。

在性成熟雌性个体中，荧光信号的表达是持续的。然而，在雄性胚胎中，该信号仅在雌激素类物质的作用或存在下才会出现，因此后者更适用于检测。该品系胚胎对多种雌激素类化合物以及环境样品的敏感性和可用性均已得到验证。

所有涉及活体动物的实验均依照匈牙利动物福利法进行，且所有研究均在动物达到自由摄食阶段前完成。用系统水注满交配缸，并在收集卵子前将鱼类设置为交配状态。将雄性和雌性鱼放入缸中，并使用隔板将它们分隔开。

次日清晨灯光开启后，移除鱼缸中的隔离板。每15至20分钟检查一次交配缸中是否有卵。使用茶滤器或编织紧密的细网筛收集所有胚胎，并将其转移至一个大培养皿中，加入E3缓冲液或清澈的系统水。

将胚胎放入设定为25.5摄氏度的培养箱中。受精后1至1.5小时，在体视显微镜下用塑料移液管移除并丢弃未受精或分裂不充分的卵子。将筛选出的胚胎放入处理容器中，例如已标记并加入不同浓度测试物质的培养皿或组织培养板。

将胚胎在25.5摄氏度条件下孵育至实验结束。必要时更换测试溶液，以维持处理浓度。更换测试溶液时需小心操作，避免损伤胚胎。

预先配制4%的甲醇塞拉多塞（methoseladose）与MS 222。用塑料移液管将每组处理的5日龄幼虫转移至直径5厘米的培养皿中。用塑料移液管吸除幼虫中的处理液，然后向培养皿中加入2 mL 0.02%的MS 222麻醉溶液。

用4%的甲基氨基乙酸甲酯（methoseladose ms 222）填充特制的10厘米培养皿中的每个方格。将麻醉后的幼虫连同少量水一起转移到两个方格之一的甲基氨基乙酸甲酯溶液中。从第一个方格将幼虫转移至第二个方格。

在第二个方格中，使用截短至两厘米的微加载移液器吸头将幼虫旋转并调整至左侧，并轻轻将其压至底部。为了评估表达报告基因的信号，需在相同的视野和设置下对胚胎进行成像。将培养皿放置在显微镜的载物台上。

聚焦于胚胎的肝脏，使用配套软件拍摄明场图像。将显微镜切换至mCherry滤光片，使用配套软件在荧光光线下拍摄肝脏的荧光图像。重复上述两个步骤，直至完成实验中所有胚胎的成像。

打开 ImageJ，然后通过拖放图像或单击“文件”>“打开”来上传待分析的荧光图像。单击“图像”>“颜色”>“拆分通道”，根据 RGB 颜色图将荧光滤光片生成的图像拆分为各个通道。使用红色通道图像光谱进行分析。

关闭其他通道。在图像中指定一个大小相似的椭圆形区域，以避免完整信号干扰评估。使用椭圆工具尽可能准确地在高亮的肝脏区域上绘制一个椭圆。

如果信号较弱，可使用明场显微图像（荧光图像对应的明场图像）来确定肝脏的位置。点击“分析”菜单中的“测量”功能，以测定信号强度和受影响区域的大小。软件将自动计算积分密度值，并在图表的对应列中显示结果。

通过重复上述步骤继续分析，直至完成对处理组中所有胚胎的全部荧光图像的分析。保存数据，然后分析积分密度值。在实验中，生物标志物斑马鱼品系的雌激素敏感胚胎在受精后至五日龄期间，分别用 0.5 和 8 微摩尔浓度的 α-和 β-玉米赤霉醇（Zearalenol）或 ZOL 进行处理。

我们研究了实验结束时鱼类肝脏中是否因物质作用而出现荧光信号，以及两种物质的雌激素活性是否存在差异。结果根据荧光图像和积分密度值进行评估。在α-玉米赤霉醇（alpha-ZOL）处理组中，最高测试浓度下所有个体均死亡。

因此，在这种情况下无法检测荧光信号。在较低浓度下，可在胚胎肝脏中观察到强烈的荧光信号，且荧光信号强度和发光区域大小无显著差异。

整合密度值与处理之间也无显著差异。使用β-ZOL处理期间未出现死亡现象。该物质在所有处理浓度下均诱导了转基因活性。

随着浓度的增加，荧光信号强度以及照明区域的大小在荧光图像中均可被观察到。通过检测β-ZOL的积分值，也可发现这一变化。在最低与最高处理浓度之间，平均积分密度值几乎增加了一倍。

然而，在β-ZOL的情况下，我们未发现各浓度之间的积分密度值存在显著差异。通过比较两种物质在相同处理浓度下获得的积分密度值，可以说，在每种情况下，α-ZOL的积分密度平均值均高于β-ZOL，这与荧光图像中观察到的信号强度差异一致。这种差异在所有浓度下均具有显著性。

雌激素效应生物指示剂的使用在毒理学研究中日益广泛。已有多种显示雌激素效应的转基因斑马鱼品系被培育出来，其中 vtg:1mCherry 被用于我们的研究。本文所述方法展示了对该品系胚胎进行检测的一种可能方案，以便在使用纯物质时能够实现雌激素活性的活体检测。

需要指出的是，对于胚胎而言，外源基因的表达与内源性卵黄蛋白原的产生类似，均表现出较大的个体差异，在实验设计时应考虑个体敏感性的不同。确定处理浓度时一个重要因素是，胚胎的细胞（包括肝细胞）可能因高毒物质的浓度过高而受损，从而导致卵黄蛋白原诱导作用下降。因此，实验应在低于L-C 10的浓度下进行。

根据计划的检测终点和待测样品的不同，该方案可在多个方面进行调整。它还可与其他检测方法结合使用，例如分子生物学方法。因此，我们希望 vtg:1mCherry 品系的应用能够成为雌激素活性检测的模型，并有望成为标准化检测方法的范例。