利用胎儿肠类器官在体外模拟哺乳到断奶的过渡过程

本方案描述了一种小鼠胎儿肠道细胞的培养方法，该方法最适合在体外实现细胞向成年阶段的成熟。这种体外方法可用于研究哺乳期向断奶期转变的分子机制以及该过程的调控因子，并有助于更高效地利用实验动物。对于这种肠道成熟体外模型而言，必须使用发育晚期（胚胎第18至20天）的原代肠道细胞。

用两把小镊子拉伸肠道。以胃和阑尾为参考，剪开小肠的近端和远端部分。以阑尾为参考，剪开结肠。

为使肠管纵向打开，将剃刀刀片沿肠管长轴放置，然后用镊子沿刀片滑动牵拉肠管。随后，将打开的肠管切成每段1厘米的小段。准备三个50毫升的离心管，每管加入10毫升预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）。

将小肠的近端和远端部分以及结肠分别转移至不同的离心管中。在解剖其他小鼠肠道时，将离心管置于冰上保存。同一窝小鼠的所有肠段收集至同一个离心管中。

用预冷的 PBS 清洗肠段后，加入 2 毫摩尔的 EDTA 孵育 30 分钟。为从组织中解离隐窝，先用预冷的 PBS 和 10% 小牛血清部分清洗组织片段，然后通过 70 微米细胞筛过滤至新离心管中。再重复清洗组织两次，并合并滤液。

将含有隐窝的滤液在 4 摄氏度下以 150 × g 离心 5 分钟，使隐窝沉淀成团。将隐窝转移至 15 毫升离心管中，再次离心。为包被培养孔，向离心管中加入所需总量的细胞外基质凝胶，并溶解沉淀物。

将20微升溶解的隐窝加入到预热的48孔板的每个孔中。接种第一个孔后，在显微镜下观察，确认每孔隐窝密度约为250至300个。将培养板置于37°C培养箱中孵育10分钟，使细胞外基质凝胶固化。

然后，制备ENR培养基。将250微升ENR培养基加入至凝胶上的每个孔中。每周更换培养基三次，并每周传代类器官一次。

持续一个月，每次传代后每隔三天分析一次培养物。每次传代后的第三天，通过向孔中加入 200 微升含有 2 微升 β-巯基乙醇的 RNA 裂解缓冲液，从一个孔中提取 RNA。然后将样本从孔中转移至无 RNA 酶的 1.5 毫升离心管中。

在体外实验中，我们采用地塞米松作为外部因子的示例，该因子已知可在体内加速肠道成熟。为提取蛋白质，向类器官的五个孔中每孔加入250 µL冰上预冷的细胞回收溶液，并将所有孔中的溶液收集至一个15 mL离心管中。置于冰上孵育至少30分钟，以溶解细胞外基质凝胶。

用预冷的PBS洗涤，加入250微升细胞裂解缓冲液，于-80摄氏度保存。为分析酶活性，首先配制pH为6的0.625摩尔马来酸缓冲液，以及乳糖、蔗糖、麦芽糖和海藻糖酶的0.05摩尔溶液，并将这些溶液置于冰上保存。通过将5.56摩尔葡萄糖溶液用超纯水稀释，配制出5种不同浓度的溶液，作为检测标准品。

然后，根据实验方案，将八组不同的类器官裂解液及其相应的底物（包括标准品和对照）加入96孔板中。在37摄氏度下孵育60分钟。为了测定类器官裂解液中酶产生的葡萄糖量，迅速加入200微升 freshly prepared PGO显色溶液，并在37摄氏度下每隔5分钟于分光光度计上测定450纳米处的吸光度，持续30分钟。

本方案中，从 E18 至 E20 的小鼠胎儿中分离出近端和远端肠道。分离后，将上皮细胞接种于细胞外基质凝胶滴中。经过约 28 至 30 天的培养，胎儿类器官发育至成熟的成年状态。

近端标志物 Onecut2 和 Gata4 主要在近端类器官培养物中表达，而远端标志物 Fabp6 和 Guca2a 主要在远端类器官培养物中表达。乳糖酶、Ass1、Blimp-1 和新生儿 Fc 受体等胎儿标志物的相对表达水平在近端和远端类器官培养物中随时间逐渐降低，而蔗糖酶-异麦芽糖酶、精氨酸酶 2、海藻糖酶和溶菌酶等成体标志物的表达则随时间逐渐升高。外源性因素的作用并不一定需要通过基因组途径介导。

与对照类器官相比，地塞米松处理的类器官在第12天时胎儿标志物Blimp-1的基因表达降低。然而，成体标志物蔗糖异麦芽糖酶的基因表达和酶活性均有所升高。使用本方案时需注意，只有晚期胎儿阶段的类器官才具备在体外转化为成体类器官的能力。

作为该培养的起始点，六至十个胎仔的数量可通过使用完整肠道来研究整体成熟过程而进一步减少。该模型的转化价值在于其能够研究高剂量组极端效应因子对肠道成熟过程的调节作用，而这一过程在哺乳期哺乳动物之间是保守的。