使用胎儿肠道有机体在体外重述吸吮到发胶过渡

该协议描述了小鼠胎儿肠道细胞的培养，最适合在体外达到成人阶段的成熟。这种体外方法可用于研究吸吮到奶农过渡的分子机制以及这个过程的调制器，并更有效地利用实验动物。这种肠道成熟体外模型在胚胎18天至20日之间，从晚期发育阶段使用原发性肠道细胞至关重要。

用两个小钳子，伸展肠子。使用胃和附录作为导轨，切开小肠的近位和远距离部分。使用附录作为参考，将结肠分开。

使肠道纵向开放，沿肠道纵向放置剃刀刀片，然后沿着剃须刀刀片滑动钳子拉肠。随后，将打开的肠切成一厘米。准备三个50毫升管与10毫升的冰冷PBS。

将小肠和结肠的近位和近部分开转移到管子上。在解剖其他小鼠的肠道时，将管子放在冰上。在同一管中收集一个垃圾的所有肠道部分。

用冰冷PBS清洗肠道后，用两毫摩尔EDTA孵育30分钟。为了将墓穴与组织分离，用冰冷的PBS和10%的小牛血清部分清洗，并通过70微米细胞滤株过滤成一个新的管子。重复清洗组织两次，并结合过滤溶液。

在4摄氏度下将含有墓穴的过滤溶液以150倍G离心5分钟，以将墓穴收集为颗粒。将墓穴转移到15毫升管中，然后再次离心。要板井，将所需的细胞外基质凝胶的总量加入管中并溶解颗粒。

将溶解的墓穴的20微升加入温暖的48井板的每个井中。电镀第一个井后，在显微镜下观察，确认每井约250至300个墓穴的密度。将板放在37摄氏度的培养箱中10分钟，让细胞外基质凝胶凝固。

然后，准备 ENR 介质。将 250 微升的 ENR 介质添加到凝胶中。每周更换三次介质，每周通过一次器官。

一个月内，每三天每次通过后，分析文化。每次通过后三天，通过添加200微升RNA解解缓冲液，并辅以两微升β甲醇，将RNA从一口井中分离出RNA。然后，将样品从井中转移到无 RNAse 的 1.5 毫升管中。

在我们的体外实验中，我们使用了德卡美托松作为外部因子的例子，已知可以加速体内肠道成熟。为了分离蛋白质，每口井中加入250微升的冰冷细胞回收溶液，并把它们全部收集在15毫升的管中。在冰上孵育至少30分钟，溶解细胞外基质凝胶。

用冰冷的PBS清洗，加入250微升的细胞解液缓冲液，储存在零下80摄氏度。为了分析酶活性，首先在pH6和0.05摩尔溶液中准备0.625摩尔雄性缓冲液，以乳糖、蔗糖、麦芽糖和曲霉素，并将其储存在冰上。通过用超纯水稀释5.56摩尔葡萄糖溶液，获得5种不同浓度的溶液，制定测定标准。

然后，放入一个96井的板中，在各自的基材中加入8组不同的有机体来亚酸盐，包括根据手稿进行标准和控制。在37摄氏度下孵育60分钟。为了确定有机体解酶中存在的酶产生的葡萄糖量，快速加入200微升新鲜准备好的PGO色溶液，并在分光光度计上测量吸收度，每5分钟450纳米，在37摄氏度下30分钟。

在此协议中，近向肠和远肠从E18分离到E20小鼠胎儿。分离后，上皮细胞在细胞外基质凝胶圆顶中播种。经过大约28至30天的培养，胎儿器官发育成成熟的成人状态。

近近标记 Onecut2 和 Gata4 主要表示在近向器官培养中，而近近标记 Fabp6 和 Guca2a 主要表现在近向器官培养中。胎儿标记乳糖酶，屁股1，布林普-1和新生儿Fc受体在他们的相对表达和成人标记苏克拉塞等酶，阿根酶2，trehalase和莱索酶随着时间的推移增加的近体和远端器官培养。外在因素的影响不一定应该是基因组学。

与控制器官相比，胎儿标记Blimp-1的基因表达在第12天减少了对细胞体治疗的德萨梅松治疗的器官。然而，成人标记素酶的基因表达和酶活性均增加。当使用这个协议时，重要的是要认识到，只有晚期胎儿阶段器官能够传递到成人器官体外。

六到十个胎儿的数量作为这种培养的起点可以进一步减少使用整个肠道来研究整体成熟。该模型的转化价值在于高组极端效应器能够调节肠道成熟的可能性，这是一个在吮吸哺乳动物之间保存的过程。