利用转盘显微镜测量单极有丝分裂纺锤体中微管的动力学
2019年11月15日
本文介绍了一种利用活细胞旋转盘共聚焦显微镜和基于 MATLAB 的图像处理技术，对处于有丝分裂前期的细胞进行微管动力学分析的稳健且详细的方法。
本文介绍了一种利用活细胞旋转盘共聚焦成像技术分析微管动态的稳健且简便的方法，实验中细胞被同步在早前期，随后在基于MATLAB的平台上对图像进行分析。采用红移荧光蛋白结合旋转盘显微镜技术可降低光毒性，因此可在同一制备样本中对更多细胞进行成像。
大量病理条件下微管动态性会发生改变。因此，了解这些过程中微管动态的调控机制及其行为，有助于我们理解疾病的发生机制，并最终开发出相应的治疗策略以弥补这些异常。此外，该方法还具有可扩展性，未来可能应用于药物发现研究中。
通过改变荧光去同步化方案并从细胞周期的不同阶段获取细胞，可对本方法进行修改。在筛选作用于微管的药物以及鉴定分裂期和非分裂期细胞中的缺陷时，此方法可能具有重要用途。针对每种细胞类型，有必要优化转染方案和接种密度。
EB3的表达水平应保持较低，以便检测单个生长中的微管。首先用DPBS冲洗处于异步生长状态的HeLa细胞，然后在37摄氏度下用胰蛋白酶-EDTA孵育五分钟。通过加入RPMI-1640培养基（添加10%热灭活FCS）终止消化反应，加入的培养基与之前添加的胰蛋白酶-EDTA体积比为3:1。
根据手稿说明计算细胞浓度，并将50,000个细胞接种至已准备好的带孔盖玻片的每个孔中。将盖玻片放回培养箱，在37°C和5%二氧化碳条件下培养24小时。次日，从培养箱中取出细胞，逐滴加入100 µL转染混合物至每个孔中。
将细胞放回培养箱，在孵育4小时后为细胞补充新鲜培养基，并继续孵育20小时。用不含酚红的DMEM培养基（添加10% FCS和2 mmol/L L-谷氨酰胺）配制2.5 μmol/L的二甲基萘嵌苯（dimethylenastron，简称DME）溶液。将腔室盖玻片中的生长培养基更换为含DME的生长培养基，并将细胞放回培养箱中。
孵育3.5小时后，将带孔盖玻片装入设定为37°C和5%二氧化碳并配有成像用遮光板的环境培养箱中，转移至显微镜下。随后继续孵育，使总孵育时间达到4小时。使用倒置显微镜、100倍油镜（数值孔径1.49）、共焦双转盘系统以及可靠的自动对焦系统进行延时成像。
按照文稿中所述定义成像参数。找到一个处于前期的细胞，并在Z平面上聚焦于单极有丝分裂纺锤体的中心位置。随后，在一分钟内每5秒采集一次图像，不进行像素合并，且在曝光间隔期间不进行照明。
首先启动数值分析软件，并将 u-track V2.2.0 文件夹添加到软件搜索路径中，即在命令窗口中调用“movie selector GUI”。然后导入图像采集软件生成的原始文件。手动输入物镜的数值孔径以及成像时使用的时间间隔。
所有图像加载完毕后，通过选择对话窗口右侧的“保存为电影列表”和“u-track”选项，将输入的时间序列保存为视频。在弹出菜单中选择微管正端，然后单击“确定”，这将打开一个新的对话窗口以设定分析三个步骤的参数。在第一步中，单击“设置”并在下拉菜单中选择彗星检测。
根据文稿中所述，设定高斯差分滤波器和分水岭分割的参数。然后选择将设置应用于所有视频，并点击应用。在第二步中，选择微管正端动态，根据文稿内容使用设置选项定义用于轨迹连接、间隙闭合、合并、分裂以及卡尔曼滤波功能的参数值。
针对维度问题，从下拉菜单中选择两个选项，并将最大间隙闭合设为5帧，将第一步中轨迹片段的最小长度设为3帧。与之前相同，选择“将设置应用于所有视频”并点击“应用”。在第三步中，选择微管动力学分类作为轨迹分析方法，并通过设置按钮定义参数。
选中以移除视频开头和结尾轨迹的复选框，并生成统计直方图。从下拉列表中分别选择“前向间隙前 2 至 3 帧”和“前向间隙速度分布的第 95 百分位数”，用于前向和后向重新分类。定义所有参数后，选中控制面板 u-track 窗口中的“对所有视频应用勾选/取消勾选”和“运行所有视频”复选框，然后点击“运行”。
视频处理完成后会显示一条消息。pEB3-tdTomato 质粒在 HeLa 细胞中进行了瞬时表达。细胞通过 DME 处理进行了同步化。
对微管生长的延时电影进行了分析，并绘制了相应的生长速度和动态性结果。针对同一组延时电影，调整了影响分析的参数，如最大间隙长度和最大缩短因子，并计算了对应的生长速度和动态性数值。
尽管最终的生长速度未受到显著影响，但在改变最大间隙长度时，微管动态性表现出差异。在三种情况下，微管亚轨迹的检测结果相似，但当最大间隙长度设置为15时，完整微管轨迹的重建受到的影响最为明显。为了评估成像条件是否干扰了微管的行为，将时间序列的前半部分和后半部分分别进行分析，并比较了相应的生长速度和动态性。
正如预期，未检测到显著差异。需要注意的是，由于细胞处于早中期同步状态，微管密度非常高。因此，必须非常谨慎地设置分析参数，以避免错误识别不同的微管。
利用该方法对微管动态的测量可直接或间接地与其他调控微管的生物学靶标的研究进行比较。
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概述
本研究介绍了一种用于分析处于早前期同步化细胞中微管动态的稳健方法，该方法结合了活细胞旋转盘共聚焦显微镜与基于MATLAB的图像处理技术。该技术可降低光毒性，从而实现对更多细胞的成像，有助于深入理解微管在正常及病理条件下的动态行为。
关键研究组成部分
研究领域
- 微管动力学
- 细胞同步化
- 活细胞成像
背景
- 微管动态对细胞分裂至关重要，并在多种疾病中发生改变。
- 了解其调控机制有助于阐明疾病的发病机理。
- 该方法还可适用于药物发现研究。
使用的方法
- 活细胞转盘共聚焦显微镜
- 处于早前期的同步化HeLa细胞
- 使用红移荧光蛋白进行同步成像
主要结果
- 对微管正端动态的全面分析。
- 数据表明成像参数对微管生长速度影响较小，但对动态性有显著影响。
- 在细胞分裂过程中实现了对微管行为的稳定追踪与特征刻画。
结论
- 本研究展示了一种用于探究微管动态的详细方法，该方法可能适用于临床研究和药物开发。
- 该项工作加深了对细胞内微管行为的理解，并为相关疾病的潜在治疗靶点提供了新的认识。
常见问题
行业应用价值
理解微管动态对于肿瘤学和神经退行性疾病项目中的靶点验证至关重要，因为细胞骨架失调是这些疾病病理过程的驱动因素。本方法可实现对同步有丝分裂细胞中微管行为的定量、高内涵分析，有助于对靶向微管蛋白或相关调控因子的化合物进行机制性风险评估。通过降低光毒性并实现可扩展成像，该方法提高了早期发现工作流程中数据的稳健性和转化可信度。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：能够以微管正端动态变化作为功能读数，检测有丝分裂通路中靶点的结合情况。
- 操作价值：利用 EB3-tdTomato 和转盘显微镜检测单个生长中的微管，光毒性低，支持可重复测量。
- 预测价值：提供与化合物对有丝分裂保真度影响相关的动态性指标，有助于先导化合物的识别与优先排序。
筛选与检测方法开发
- 检测准备就绪：通过 U-Track 软件生成定量的微管生长速度和动态性输出，可实现对微管调节剂的标准化筛选。
- 可扩展性：可在标准培养条件下对更大规模的细胞群体进行成像，提高化合物表征的通量。
- 可重复性：由人工监督的自动分析确保了重复实验间的数据统计稳健性，支持检测方法的转移与复用。
转化与临床前研究
- 疾病相关性：直接测量病理条件下发生改变的微管动力学，将体外研究结果与疾病机制相联系。
- 转化连续性：通过提供保守且可量化的细胞骨架表型，支持从靶点验证到临床前模型的研究推进。
- 风险降低：能够早期检测微管的脱靶效应，减少因细胞毒性或基因组不稳定性导致的后期研发失败。
流程与工作流整合
该方法适用于从靶点验证到先导化合物优化的整个发现流程，尤其适用于专注于有丝分裂抑制剂、微管稳定剂或去稳定剂的研发管线。
- 发现生物学：通过量化同步化细胞中微管的生长与缩短动力学，支持对微管调控因子的假设验证。
- 筛选：提供适用于高内涵筛选项目的、即用型的定量检测结果（如生长速度、动态性）。
- 分析：采用U-Track进行自动化的轨迹分析，实现药物处理组与对照组之间的统计学比较。
- 转化研究：通过在与疾病相关的有丝分裂背景下测量微管动力学，将细胞骨架表型与临床前研究结果相关联。
- 企业级复用：建立可重复使用的成像与分析平台，适用于多个靶向微管蛋白的研究项目。
运营与企业影响
- 科学价值：通过降低微管靶向化合物的作用机制模糊性，提高靶点验证的预测可信度。
- 操作价值：利用同步化细胞、降低光毒性及自动化追踪，实现微管动力学测量的标准化。
- 战略价值：通过提供早期、定量的细胞骨架安全性和有效性信号，优化决策推进（推进/终止）判断。
- 项目组合影响：通过识别具有理想微管调节特征的化合物，实现基于风险评估的化合物推进。
实施注意事项
- 需要具备活细胞成像、转染条件优化以及微管生物学方面的专业知识。
- 依赖于转盘共聚焦显微镜、环境控制培养室以及高数值孔径的油浸物镜。
- 需要在不同细胞类型之间标准化转染方案、接种密度和同步化时间。
- 需调整 U-Track 参数（例如间隙长度、收缩因子），以避免在高密度微管环境中发生误识别。
- 受限于需低水平 EB3 表达以分辨单个微管正端，因此每种细胞系均需进行表达量滴定。
