Name: 通过清除心脏三维成像捕获目标细胞群的心脏损伤反应 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: 了解心脏再生研究中利用被动CLARITY技术和三维共聚焦显微镜追踪心肌细胞增殖动态的方法。该技术可识别参与心脏修复的关键细胞群，为发育生物学和再生医学研究提供重要工具。

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本项目由威斯康星州合作伙伴计划（A.I.M.）提供的威斯康星大学医学院和公共卫生学院资助，以及美国心脏协会职业发展奖19CDA34660169（A.I.M.）资助。

所有实验均遵循《实验动物使用与护理指南》进行，并符合威斯康星大学麦迪逊分校医学院和公共卫生学院机构动物护理和使用委员会的规定。所有方法均在野生型 C57BL/6J (B6) 和来自杰克逊实验室的转基因小鼠品系上实施。
1. 通过结扎1日龄新生小鼠左前降支动脉（LAD）诱导冠状动脉闭塞（心肌梗死）6
<ol>
	<li>将出生1天的新生幼鼠与母鼠分离，将其放入一个清洁的笼子中，并加入一些原有的筑巢材料。</li>
	<li>将笼子的一半置于设定为中等温度的加热垫上。幼鼠应留在笼子未加热的一侧，仅在手术后才将其移至加热侧。</li>
	<li>在手术显微镜下建立无菌手术区域。准备已灭菌的手术器械（表1）。</li>
	<li>通过低温麻醉幼鼠：用纱布包裹幼鼠以避免皮肤直接接触冰块，然后将其埋入冰床中约3–4分钟。定期通过脚趾夹捏测试小鼠的低温麻醉状态。新生幼鼠对低温耐受性良好，但长时间暴露于低温可能导致冻伤及后续死亡。</li>
	<li>麻醉成功后，将小鼠仰卧位放置于手术区域，用胶带固定四肢。使用消毒液对小鼠手术区域进行消毒。</li>
	<li>定位胸部下部区域，使用小型解剖剪在皮肤上做横向切口。为扩大肋骨的手术视野，用敷料镊轻轻提起皮肤，并用闭合的小剪刀轻压肋间肌，以分离皮肤与肌肉。</li>
	<li>定位第四肋间间隙（图1A），使用尖头镊子进行小而表浅的穿刺，注意避免刺破任何内脏器官。使用敷料镊在肋间肌之间进行钝性分离以扩大操作区域。切口的正确解剖位置对于充分暴露心脏至关重要。</li>
	<li>将手指置于腹部左侧并逐渐施加压力，同时用敷料镊保持肋间间隙开放，轻柔地将心脏推出胸腔（图1B）。心脏完全移出胸腔后，移除敷料镊，释放压力，使心脏自然 resting 在肋间肌上。</li>
	<li>定位左前降支（LAD），其特征为血流较少且处于正确解剖位置的心肌区域（图1C）。若在手术开始后数分钟内完成心脏暴露，则仅能在显微镜下观察到LAD。</li>
	<li>使用6-0缝线结扎LAD以完成LAD结扎术（图1D）。打两次方结以诱导心肌梗死（图1E）。缝线进入心肌的深度可能有所不同，但LAD结扎的准确解剖定位对实验可重复性至关重要。结扎LAD时应适度拉紧缝线，避免切断LAD。结扎后可立即观察到心尖部位变白（图1E）。</li>
	<li>轻柔地使心脏滑回胸腔，可用敷料镊辅助此过程。使用外科结随后接方结缝合肋骨，用钝头镊提起上部肋骨，同时将6-0缝线穿过上下两组肋骨进行缝合。</li>
	<li>移除用于固定幼鼠后肢的胶带。</li>
	<li>在上腹部涂抹少量皮肤粘合剂使皮肤闭合。然后用精细镊子夹住下腹部皮肤，覆盖暴露的胸部区域。尽量减少幼鼠体表残留的多余粘合剂，因其可能增加母鼠排斥和同类相食的风险。</li>
	<li>立即将幼鼠置于设定为中等温度的加热垫上，以促进其从麻醉中恢复。定期调整幼鼠位置，使其身体各部位均匀受热。</li>
	<li>让幼鼠直接停留在加热垫上10–15分钟。通常在放置于热源后5分钟内即可恢复活动。</li>
	<li>使用酒精棉片清洁残留的血液和粘合剂。</li>
	<li>用原笼中的垫料擦拭幼鼠全身，以掩盖外来气味。在其他手术进行期间，将幼鼠放置于笼子的加热侧。</li>
	<li>待所有手术完成且幼鼠体温恢复并能自主活动后，将整窝幼鼠连同原有筑巢材料一并转移至母鼠笼中。</li>
	<li>术后监测小鼠30–60分钟，观察母鼠是否接受幼鼠，表现为筑巢行为和/或理毛行为。</li>
	<li>术后次日早晨检查小鼠状况。若母鼠表现出焦虑且未对幼鼠进行筑巢，应考虑为幼鼠更换寄养母鼠。</li>
</ol>
2. 通过被动CLARITY技术清除小鼠心脏21,22,23
<ol>
	<li>使用异氟烷麻醉小鼠。通过夹捏脚趾确认小鼠已完全镇静。</li>
	<li>将小鼠仰卧置于干净的手术区域，并用胶带固定四肢。</li>
	<li>通过鼻罩持续给予异氟烷以维持小鼠的镇静状态，直至心脏被取出。</li>
	<li>用组织镊夹住剑突下方的毛发，使用大型解剖剪沿肋骨宽度做一横向切口，打开下胸部。</li>
	<li>用手术剪沿肋骨远端边缘进行剪切。</li>
	<li>用组织镊夹住剑突，暴露膈肌；使用弯头镊子将膈肌分离。</li>
	<li>在保持夹持剑突的同时，将组织向头侧牵拉，直至暴露出跳动的心脏。</li>
	<li>用弯头镊子夹住心脏基部，使用虹膜剪剪断主动脉和上腔静脉，将心脏从胸腔中分离出来。</li>
	<li>在心脏仍在跳动时，将其放入盛有PBS的培养皿中，使心脏在持续跳动过程中将内部血液泵出。可通过检查缝线位置是否位于左前降支结扎的正确解剖位置，以确认心肌梗死模型是否成功。</li>
	<li>用镊子轻轻挤压心脏，促使心脏排出残留血液。</li>
	<li>将小鼠心脏转移至含有2 mL PBS的一次性2.5 mL玻璃螺口瓶中。在室温（RT）下于摇床上孵育10分钟，多次洗涤以去除残留血液。每次更换PBS溶液，直至PBS保持澄清。</li>
	<li>弃去PBS，向瓶中加入2 mL冰冷的4%多聚甲醛（PFA）。在室温下孵育4小时（图2A）。</li>
	<li>孵育结束后，弃去PFA，向瓶中加入2 mL PBS。在室温下于摇床上洗涤心脏10分钟。重复洗涤步骤两次，每次均弃去旧液并更换新鲜PBS，以彻底清除残留的PFA。</li>
	<li>弃去PBS，向瓶中加入2 mL含4%丙烯酰胺和0.5% VA-044的溶液。在4 °C下孵育过夜。</li>
	<li>次日，将瓶子转移至设定为37 °C的加热块中，进行3小时的聚合反应。</li>
	<li>将心脏转移至新的玻璃螺口瓶中，并重复步骤2.12（PBS洗涤循环）。</li>
	<li>弃去PBS，向瓶中加入2 mL透明化溶液（表2）。在37 °C下孵育，直至心脏完全透明。每2–3天更换一次溶液，并补充新鲜透明化溶液。透明化过程可能持续数周（图2B-C）。 
	注意：P1期心脏通常需要约3–5天，而P21期心脏在透明化溶液中孵育可能需要近一个月才能完成透明化。</li>
	<li>弃去PBS，向瓶中加入2 mL PBS，并重复步骤2.12（PBS洗涤循环）。补充新鲜PBS，于37 °C孵育过夜。</li>
	<li>若需进行免疫染色，则跳过步骤2.21–2.22，直接进入第3节进行免疫染色。若仅依赖内源性荧光信号，则继续执行步骤2.21–2.22，并跳过第3节。</li>
	<li>弃去PBS，更换为折射率匹配溶液（RIMS）（表3）。在37 °C下孵育过夜。</li>
	<li>孵育完成后，透明化组织可在RIMS溶液中于室温下长期保存。组织刚转入RIMS时中心可能呈现白色不透明状；在室温下孵育数周后，组织应逐渐变为透明（图2D）。</li>
</ol>
3. 可选：小鼠完整心脏的免疫组织化学染色
<ol>
	<li>从 RIMS 溶液中取出已透明化的心脏，放入含有 2 mL PBST（含 0.1% Triton-X 100 的 PBS）的洁净 2.5 mL 玻璃小瓶中</li>
	<li>在旋转摇床中用 PBST 洗涤心脏 3 次，每次孵育 30 分钟，室温进行</li>
	<li>将心脏浸入 2 mL 20% 封闭缓冲液（用 PBST 稀释）中，以封闭非特异性抗体结合位点，在室温下旋转孵育 3 小时。随后转移至 4 °C，继续旋转孵育过夜。 
	注意：封闭缓冲液应使用与二抗宿主物种相匹配的正常血清配制</li>
	<li>在室温下用 PBST 旋转洗涤心脏 3 次，每次孵育 5 分钟</li>
	<li>将心脏浸入一抗溶液（用含 2% 封闭缓冲液的 PBST 稀释）中，并用铝箔包裹玻璃小瓶以避光。在室温下旋转孵育过夜。 
	注意：自此步骤起，应持续使用铝箔保护二抗免受环境光照射</li>
	<li>在 4 °C 下继续旋转孵育额外 24 小时</li>
	<li>完成一抗染色后，重复步骤 3.2（长时间 PBST 洗涤周期），以去除组织中未结合的一抗。延长洗涤时间，在室温下旋转孵育过夜</li>
	<li>在光线受限的环境中操作，以避免二抗暴露于光下，将心脏浸入二抗溶液（用含 2% 封闭缓冲液的 PBST 稀释）中，在室温下旋转孵育 3 小时。随后转移至 4 °C，继续旋转孵育过夜</li>
	<li>次日，重复步骤 3.2（长时间 PBST 洗涤周期），以去除未结合的二抗</li>
	<li>将溶液更换为 2% 封闭缓冲液（用 PBST 稀释）。在室温下旋转洗涤过夜，以去除残留的未结合抗体</li>
	<li>次日，使用共聚焦显微镜检测是否已完全去除多余的二抗。根据需要延长洗涤时间，每天更换 2% 封闭缓冲液，直至几乎无非特异性二抗信号为止</li>
	<li>将完成免疫染色的心脏保存在 PBS 中，置于 4 °C</li>
	<li>在进行整体封片显微成像前，将心脏在 RIMS 溶液中于 37 °C 孵育过夜。若组织仍未完全透明，可额外延长孵育 24 小时</li>
	<li>将完全透明且完成免疫染色的心脏保存在 RIMS 溶液中，置于室温</li>
</ol>
4. 利用单光子共聚焦显微镜对透明化小鼠心脏进行三维成像以可视化非心肌细胞群体
注意：如果小鼠心脏为胚胎期获取，请继续进行第4.1节操作；若为出生后获取的小鼠心脏，请继续进行第4.2节操作。
<ol>
	<li>成像透明化的小鼠胚胎心脏
	<ol>
		<li>用 PBS 溶液填充显微镜凹面载玻片。</li>
		<li>用弯头镊子小心夹起透明化的心脏组织，并将其放置在载玻片上。</li>
		<li>加盖玻璃盖玻片。此时可在共聚焦显微镜下对组织进行成像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>成像透明化的小鼠出生后心脏
	<ol>
		<li>用 PBS 溶液填充凹面载玻片腔室的一半。为了创建足够容纳成年小鼠心脏的腔室，特别定制了3D打印的聚丙烯凹面载玻片（图4）。</li>
		<li>用弯头镊子小心夹起透明化的心脏组织，并将其放入腔室内。用 PBS 填充腔室的剩余空间。</li>
		<li>继续加入 PBS 至液面在腔室顶部形成凸面。加盖盖玻片。此时可在直立式共聚焦显微镜下对组织进行成像。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Lazar, E., Sadek, H. A., Bergmann, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyocyte+renewal+in+the+human+heart%3A+insights+from+the+fall-out%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Cardiomyocyte renewal in the human heart: insights from the fall-out.</a> European Heart Journal. 38 (30), 2333-2342 (2017).</li>
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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

心肌细胞与非心肌细胞群体之间的细胞间相互作用是决定心脏在损伤后发生纤维化还是修复的关键因素。研究发现，多种细胞类型，包括神经14、心外膜细胞24、腹膜巨噬细胞25、小动脉12,13以及淋巴管内皮细胞26，均在介导心脏修复过程中发挥重要作用。通过在小鼠中应用Cre-lox和CRISPR-Cas9技术，可在发育、疾病及再生过程中对这些细胞谱系及其他感兴趣的细胞进行遗传谱系追踪。当该技术与器官透明化和先进显微成像方法相结合时，可准确评估非心肌细胞群体的贡献，从而为揭示损伤后心肌再生的细胞与分子靶点提供可能。
该方案的效率取决于在冠状动脉结扎手术期间对左前降支（LAD）结扎的一致性和可重复性。新生小鼠对长时间低温暴露非常敏感；因此，手术不仅需要精确操作，还必须在数分钟内完成。从开始到结...

长期以来，心脏被认为是一个有丝分裂后器官，但最近的证据表明，成人心脏中心肌细胞的更新率约为每年1%1。然而，这种低水平的心肌细胞更替速率不足以弥补损伤后所发生的大量组织丢失。发生心肌梗死的心脏会损失约十亿个心肌细胞，这常常是心力衰竭和猝死的前兆2,3。全球有超过2600万人受心力衰竭影响，目前仍缺乏能够逆转心脏病造成损害的治疗手段4。
为了弥补治疗手段上的这一空白，科学家们开始研究损伤后内源性再生所依赖的进化上保守的机制。研究哺乳动物心脏再生的一个模型是新生小鼠。出生后一周内，新生小鼠在心脏受损后具有强大的再生能力5。我们先前已证明，新生小鼠可通过心肌细胞增殖实现心脏再生，该过程可在心尖切除术后被激活5。尽管该技术可在新生小鼠中诱导心脏再生，但该手术与人类心脏损伤的临床情况缺乏相关性。为了在新生小鼠模型中模拟人类心脏损伤，我们建立了一种通过冠状动脉闭塞诱导心肌梗死的技术6。该技术需要手术结扎左前降支动脉（LAD），该动脉负责向左心室心肌输送40%–50%的血液6,7。因此，该手术会导致影响左心室壁较大区域的梗死。这种心肌损伤将刺激新生小鼠中心肌细胞的增殖及心脏再生5。
冠状动脉闭塞手术为揭示心脏再生的内在机制提供了一种高度可重复且具有直接转化价值的方法。新生小鼠手术模型模拟了人类心脏中的冠状动脉粥样硬化，即动脉内壁斑块积聚可导致血管闭塞并继发心肌梗死8。由于目前针对心力衰竭患者的治疗手段存在空白，左前降支（LAD）发生闭塞后，患者在损伤一年内的死亡率可高达26%9，因此该病变被称为&#34;寡妇制造者&#34;。治疗手段的进步需要一个能够准确反映心脏损伤后复杂生理与病理效应的模型。我们建立的新生小鼠心脏损伤手术方案，为研究人员提供了一个可用来探究哺乳动物心脏在损伤后启动再生的分子与细胞信号机制的研究平台。
近期研究揭示了细胞外环境与增殖性心肌细胞之间的动态关系。例如，通过降低心脏周围细胞外基质的硬度，可以延长出生后的再生时间窗10。来自新生个体细胞外基质的生物材料也能促进成年哺乳动物心脏在心肌损伤后的再生11。伴随心肌细胞增殖的同时还存在血管生成反应12,13；研究发现，新生小鼠再生心脏中特有的侧支动脉形成对于促进心脏再生至关重要12。此外，我们的实验室已证明，神经信号可通过调节生长因子水平以及损伤后的炎症反应，来调控心肌细胞的增殖和心脏再生14。这些发现强调了追踪非心肌细胞群体在心脏损伤后反应的必要性。为实现这一目标，我们利用了转基因小鼠品系中的Cre-lox重组系统，以实现荧光报告蛋白的组成型或条件型表达，从而进行谱系示踪。此外，我们还可利用Rainbow小鼠品系的先进方法来确定克隆扩增模式，该品系依赖于Cre依赖性的多色荧光报告基因的随机表达，以确定靶向细胞群体的克隆扩增情况15。结合新生小鼠冠状动脉结扎手术与谱系示踪技术，是解析心脏再生复杂细胞机制的有力工具。
利用传统的切片与重建技术，通过三维（3D）全器官成像追踪荧光标记细胞的谱系十分困难——尤其是当细胞群体较为脆弱时，例如神经纤维或血管。虽然通过光学切片对器官进行直接整体成像能够捕获表层的细胞群体，但位于组织深层的结构仍无法被有效观察。为克服这些障碍，已开发出组织透明化技术，以降低全器官组织的不透明度。近年来，Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging compatible Tissue hYdrogel（CLARITY）技术取得了显著进展，该方法通过提取固定组织中的脂质实现透明化16。此外，还采取步骤均一化组织的折射率，从而在成像过程中减少光散射17。其中一种方法是主动式CLARITY（active CLARITY），它利用电泳将去垢剂导入组织内部，从而加速脂质的分解过程18。尽管该方法有效，但需要昂贵的设备，且可能造成组织损伤，因此不适用于心脏神经等脆弱细胞群体19。因此，我们采用被动式CLARITY（passive CLARITY）方法，该方法依赖加热温和促进去垢剂渗透，有助于保留精细的细胞结构20,21。
通常认为，被动型CLARITY技术的效率低于主动型CLARITY18，因为该技术常面临两大主要障碍：无法完全清除整个器官的深度组织，以及清除成年组织所需时间过长。我们的被动型CLARITY方法通过一种加速的透明化流程，克服了上述两项限制，能够实现对新生及成年心脏组织的完全透明化。我们所采用的被动型CLARITY组织透明化技术已达到较高的效率，可实现对多种心脏细胞群体的可视化观察，包括分布在成年心脏中的稀有细胞群体。当透明化后的心脏组织通过共聚焦显微镜成像时，即可清晰揭示发育、疾病及再生过程中细胞特异性分布模式的结构特征。

<table><tbody><tr><td>1-硫代甘油</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>6-0 Prolene 缝线</td><td>Ethicon</td><td>8889H</td><td>聚丙烯缝线</td></tr><tr><td>丙烯酰胺</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>硼酸</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>弯头镊子</td><td>Excelta</td><td>16-050-146</td><td>半弯带齿，4 英寸</td></tr><tr><td>敷料镊</td><td>Fisherbrand</td><td>13-812-39</td><td>解剖用，4.5 英寸</td></tr><tr><td>玻璃小瓶</td><td>Fisherbrand</td><td>03-339-26A</td><td>12 × 35 mm 带盖小瓶</td></tr><tr><td>Histodenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>密度梯度介质</td></tr><tr><td>虹膜剪</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-03</td><td>2 mm 刃口</td></tr><tr><td>大型解剖剪</td><td>Fisherbrand</td><td>08-951-20</td><td>直头，6 英寸</td></tr><tr><td>持针器</td><td>Fisherbrand</td><td>08-966</td><td>Mayo-Hegar 型，6 英寸</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>尖头镊</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z168777</td><td>细尖直头，4.25 英寸</td></tr><tr><td>小型解剖剪</td><td>Walter Stern Inc</td><td>25870-002</td><td>30 mm 刃口</td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠 (SDS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>组织镊</td><td>Excelta</td><td>16050133</td><td>中型组织镊，1×2 齿</td></tr><tr><td>VA-044</td><td>Wako Chemicals</td><td></td><td>水溶性偶氮引发剂</td></tr></tbody></table>

通过透明化心脏三维成像捕获靶向细胞群体的心肌损伤反应

Capturing the Cardiac Injury Response of Targeted Cell Populations via Cleared Heart Three-Dimensional Imaging

心血管疾病是全球首要死因，占全球死亡总数的31%。该疾病主要表现为心脏损伤，尤其是急性心肌梗死。心脏在受损后自我修复能力有限，原本健康的心肌组织将被纤维化、无收缩功能的瘢痕组织取代，常常成为心力衰竭的前兆。为了探索再生医学中的新型治疗策略，研究聚焦于具有天然再生能力的脊椎动物。新生小鼠便是其中一种模式生物，其在心脏损伤后可发生显著的心肌再生。为了在新生小鼠中诱导出具有临床相关性的损伤，我们开发了一种手术方法，通过结扎左前降支冠状动脉（LAD），模拟人类心脏因动脉粥样硬化引发的心肌梗死。结合可追踪心肌细胞及非心肌细胞群体变化的技术，该模型为我们提供了识别心脏再生机制的研究平台。过去，研究心脏细胞群体在损伤后的变化主要依赖组织切片和组织学检查等方法，但这些方法仅能进行二维分析，且常在处理过程中损伤组织。此外，这些方法无法追踪细胞谱系的动态变化，仅能提供损伤反应的静态图像。本文中，我们介绍如何利用先进的谱系追踪模型、全器官透明化技术以及三维（3D）整体成像显微技术，阐明心脏修复的机制。通过我们建立的新生小鼠心肌梗死手术、组织透明化及三维全器官成像方案，可解析诱导心肌细胞增殖的复杂通路，揭示心脏再生的新型治疗靶点。

通常最具挑战性的两个步骤是将心脏从胸腔中引出以及结扎左前降支冠状动脉（LAD）。为解决这两个步骤中的问题，可调整在第四肋间肌之间进行初次穿刺的位置；如果穿刺和钝性分离的位置距离胸骨过近，心脏可能无法从胸腔中顺利引出（图1A）。
此外，可能需要增加对左侧腹部的压力以促进此过程（图1B）。当将心脏放置在肋间肌上时，也可能出现并发症。我们发现，当钝性分离的范围保持在最小程度并主要沿水平方向进行时，心脏可保持在体腔外而不回缩。这种操作方向还有利于清晰显露和接近前降支冠状动脉（图1C）。
在将缝合针置于LAD后方时，建议深入左心室前壁进行穿刺，因为浅表结扎在最终缝合位置调整时余地较小（图1<stron...

心肌细胞在损伤后的增殖是一个动态过程，需要来自非心肌细胞群体的多种细胞外信号协同作用。通过利用谱系示踪、被动透明化（passive CLARITY）以及三维整体共聚焦显微镜技术，我们可以分析多种细胞类型对心脏修复与再生的影响。

心血管疾病是全球死亡的首要原因，占全球死亡总数的31%。该疾病表现为……

内源性心脏再生是一个动态过程，涉及多种细胞类型协同作用，以启动强大的再生反应。通过透明化处理后的心脏组织进行三维成像，观察损伤后再生组织，有助于重建指导心脏再生反应的细胞动态过程。我们的实验方案专门设计用于在发育和再生过程中追踪细胞。我们预计，将本研究中的透明化、染色和成像技术广泛应用于其他器官类型时不会存在明显局限性。对于LAD诱导的冠状动脉闭塞，首先使用消毒液对麻醉后的一日龄新生幼鼠手术区域进行消毒。在胸部区域做一横向皮肤切口。为了分离皮肤与肌肉，使用一把敷料镊子小心地提起皮肤，同时将剪刀闭合，轻轻抵住肋间肌。找到第四肋间间隙，用小镊子进行浅表穿刺，注意避免损伤内脏器官。采用钝性分离法，配合敷料镊子逐步扩大肋间肌之间的区域，直至能够将手指置于腹部左侧，同时用敷料镊子撑开肋间间隙，轻柔地引导心脏从胸腔中移出。心脏取出后，将其置于肋间肌上静置，并根据心肌中血液积聚较少的区域定位前降支（LAD）。为诱导心肌梗死，使用6-0缝线在血管上绕两圈并打方结，结扎紧密但不切断动脉。结扎后应立即观察到心尖部位出现苍白。 沿左前降支（LAD）进行缝合时，保持缝合位置的一致性对于获得相似大小的梗死区域至关重要。最理想的方法是在血液仍流经动脉时迅速暴露心脏。缝合完成后，让心脏自然滑回胸腔内。使用钝头镊子提起上部肋骨，同时用6-0缝线穿过上、下两组肋骨，由一名外科医生打一个方结将肋骨缝合在一起。在上腹部涂抹少量皮肤胶，用精细镊子将下腹部皮肤覆盖于暴露的胸腔区域。然后将幼鼠置于加热垫上，并对下一只动物进行结扎操作。完成所有手术后，将温暖且能自由活动的仔鼠放回母鼠的饲养笼中。为了便于清晰获取所收获的心脏组织，在手术后21天确认小鼠对脚趾夹捏无反应后，将小鼠置于清洁的手术区域，仰卧位固定四肢。用组织镊夹住剑突下方的毛发，沿肋骨宽度做一切口。沿肋骨远端部位剪开，用镊子提起剑突以暴露膈肌。用弯镊分离膈肌，并将组织向头侧牵拉，直至暴露出跳动的心脏。用弯镊在心脏基部夹住心脏，使用虹膜剪剪断主动脉和上腔静脉。将跳动的心脏放入盛有 PBS 的培养皿中，使心脏泵出残留的血液。通过观察左前降支结扎是否处于正确的解剖位置，可确认心肌梗死已成功建立。当心脏停止跳动后，用镊子轻轻挤压器官以排出残余血液，并将组织样本转移至一次性 2.5 毫升玻璃螺口小瓶中，瓶内含 2 毫升 PBS。将小瓶置于摇床上，室温下振荡至少30分钟，每10分钟更换一次PBS溶液，直至溶液中无血液残留。当PBS溶液变得澄清后，弃去PBS，加入2毫升冰冷的4%多聚甲醛，室温孵育4小时，随后在摇床上用2毫升新鲜PBS洗涤3次，每次10分钟。最后一次洗涤后，向小瓶中加入2毫升含0.5% VA-044的4%丙烯酰胺溶液，4°C孵育过夜。第二天，将小瓶置于37摄氏度的加热块中放置三小时。聚合结束后，将心脏转移至新的玻璃小瓶中，用两毫升新鲜PBS清洗心脏组织，每次10分钟，并在每次孵育结束时更换新的PBS。当PBS变得澄清后，用两毫升透明溶液替换清洗缓冲液。将样本在 37 摄氏度下孵育数周，直至心脏组织透明，每两到三天更换一次透明化溶液。当器官完全透明后，按照前述方法在摇床上用 PBS 清洗样本，然后向小瓶中重新加入新鲜 PBS，在 37 摄氏度下孵育 24 小时。次日，将 PBS 替换为 RIMS，在 37 摄氏度下继续孵育 24 小时。孵育结束后，组织将完全透明化。组织通常在数周后变得透明。若需对心肌梗死诱导后的透明化新生小鼠心脏进行成像，可将自制凹面载玻片的一个腔室填充一半体积的 PBS，并使用弯头镊子小心地将透明化后的心脏转移至腔室内。用 PBS 补充填充腔室的剩余体积。然后继续加入 PBS，直至液面在腔室顶部形成凸面，随后在共聚焦显微镜成像前安装盖玻片，并按照标准成像方案对组织进行成像。如果穿刺和钝性分离的位置距离胸骨过近，心脏可能无法从胸腔中脱出。如果心脏不易从腔内取出，可对左侧腹部施加压力以促进该过程。若将心脏置于肋间肌上，可能会引发并发症。因此，重要的是将钝性分离的范围控制在最小，并保持水平方向，以便清晰观察和充分暴露左前降支（LAD）。请注意，浅表结扎在最终缝合位置上的调整空间较小，围绕左前降支（LAD）打结时应以受控且稳定的动作进行。在完成透明化步骤时，整个心脏应呈现均匀的不透明状态，中心区域无任何变色。在室温的RIMS溶液中放置数天后，心脏应完全透明，并可能观察到一定程度的组织膨胀。通过 tdTomato 报告蛋白表达观察到，心脏神经主要位于浅表，部分神经细胞群存在于心外膜层。重要的是，如图所示，在经过透明化处理（clarity protocol）后，报告蛋白的表达仍得以保留。对三维心脏进行透明化处理和成像，有助于深入了解心脏细胞群体的位置及其形态特征。这使我们能够识别细胞模式形成和细胞间相互作用中的新特征。

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

通过清除心脏三维成像捕获目标细胞群的心脏损伤反应

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成年心肌细胞的分离与遗传操作用于共聚焦成像

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一种用于心肌损伤精确可靠分析的显微级氯化三苯基四氮唑检测法

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