Name: 与拉林戈切尔·斯泰斯·斯泰斯特的小鼠中生物相容性药物-脱酸支架的设计 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-21T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: 了解经口气管支架置入技术在小鼠喉气管狭窄模型中的应用，使用PLLA-PCL药物洗脱支架进行局部给药研究。该方法为临床转化研究提供了可行的实验平台。

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美国国立卫生研究院耳聋与其他沟通障碍国家研究所资助项目编号1K23DC014082和1R21DC017225（Alexander Hillel）。本研究还获得耳鼻喉科学会和美国外科医师学会（Alexander Hillel）、美国医学会基金会，伊利诺伊州芝加哥（Madhavi Duvvuri）以及T32 NIDCD培训基金（Kevin Motz）的财务支持。

注意：此处描述的所有方法均经约翰斯·霍普金斯大学动物护理和使用委员会（MO12M354）批准。
1. 在 PLLA-PCL 中制备雷帕霉素
<ol>
	<li>准备两个（带盖）玻璃小瓶，分别装有70:30 PLLA-PCL聚合物溶液（特性粘度1.3−1.8 DL/G；材料表），其中一个玻璃小瓶中含有1.0%雷帕霉素，另一个不含雷帕霉素。
	<ol>
		<li>通过将6 mg雷帕霉素加入装有600 mg 70:30 PLLA-PCL的玻璃小瓶中，制备含1.0%雷帕霉素的聚合物溶液。</li>
		<li>对于不含雷帕霉素的聚合物溶液（对照组），仅向玻璃小瓶中加入600 mg 70:30 PLLA-PCL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在通风橱内，向每个玻璃小瓶中加入6 mL二氯甲烷。 
	警告：二氯甲烷具有腐蚀性，应仅使用玻璃移液管。需采取适当的安全防护措施，包括佩戴护目镜和手套。</li>
	<li>向每个玻璃小瓶中加入120 µL甘油（形成2%甘油溶液）。 
	注：添加甘油可提高支架结构的柔韧性并降低其刚度。</li>
	<li>盖上玻璃小瓶盖子，使含或不含雷帕霉素的70:30 PLLA-PCL聚合物溶液在6−12 h内充分溶解并均质化。 
	注：也可将玻璃小瓶置于旋转摇床上，以加快溶解过程。</li>
</ol>
2. 雷帕霉素释放测试
<ol>
	<li>将含有1%雷帕霉素的1 mL 70:30 PLLA-PCL溶液移入玻璃培养皿中。 
	注意：该体积的含1%雷帕霉素的70:30 PLLA-PCL溶液将含有120 µg雷帕霉素，代表每个构建体中雷帕霉素的总量。也可使用其他体积和浓度。</li>
	<li>让含1%雷帕霉素的70:30 PLLA-PCL在玻璃培养皿中固化成扁平圆盘状。</li>
	<li>固化后，将圆盘置于2 mL磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）中，并在37 °C培养箱中孵育。</li>
	<li>每24小时收集并更换PBS（2 mL），收集的PBS用于高效液相色谱法（HPLC）分析雷帕霉素含量。</li>
	<li>使用自动进样器和C18 4.6 cm x 250 mm HPLC色谱柱，将样品通过自动进样器进样，并与雷帕霉素的系列稀释液一同运行，以建立校准的标准曲线。每个样品需重复检测三次。 
	注意：待测的雷帕霉素系列稀释液包括10%、1%、0.1%和0.01%。</li>
	<li>流动相使用HPLC级水和乙腈，体积比为10/90，流速为2.0 mL/min。设置HPLC检测雷帕霉素时的吸收波长为280 nm。 
	注意：图1展示了雷帕霉素在14天内的洗脱情况。</li>
</ol>
3. 制备雷帕霉素缓释PLLA-PCL小鼠气道支架
注意：使用无菌材料和无菌技术进行步骤 3.2−3.9，以避免污染，从而影响体内和体外应用。
<ol>
	<li>按照第1节所述方法制备含有雷帕霉素的PLLA-PCL溶液。</li>
	<li>使用带有橡胶球的玻璃巴斯德吸管，将1 mL含1%雷帕霉素的PLLA-PCL溶液涂覆于基于22 G氟化乙烯丙烯的套管针的静脉插管部分（材料表）。一手持住套管针，另一手用玻璃吸管将PLLA-PCL溶液滴加到套管针表面。缓慢旋转套管针，确保PLLA-PCL溶液均匀覆盖整个套管针表面。 
	注意：初始阶段PLLA-PCL溶液较为稀薄，但在将其涂覆于套管针过程中，随着二氯甲烷的挥发，溶液将逐渐变得黏稠，从而更好地附着成型。在操作过程中持续转动套管针有助于均匀成膜。此步骤需缓慢且细致地进行，以确保支架涂层厚度一致。</li>
	<li>将成型后的套管针竖立放置，针尖朝下，针柄置于玻璃培养皿边缘，静置干燥。</li>
	<li>将支架在室温下置于真空干燥箱中干燥24小时（图2A）。</li>
	<li>通过轻轻扭转并抽出内部的套管针，将支架结构从其支撑的套管针上分离（图2B）。</li>
	<li>沿支架周向检查是否存在铸造过程中可能产生的缺陷。若发现缺陷，则弃用该支架。</li>
	<li>使用精细直剪刀修剪铸造成型支架的两端，使边缘保持轴向平整。</li>
	<li>使用精细直剪刀将铸造成型的支架切割为3 mm长的轴向节段，用于喉气管狭窄（LTS）小鼠模型实验（图2C）。 
	注意：每根铸造成型的套管针大约可制备8个支架，每个3 mm长的支架含有120 µg雷帕霉素。</li>
	<li>将3 mm长的支架装载至一根新的22 G静脉导管上，用于喉气管狭窄（LTS）小鼠模型实验（图1）。</li>
</ol>
4. 小鼠喉气管狭窄诱导
<ol>
	<li>在开展小鼠体内实验前，需获得动物护理与使用委员会的批准。</li>
	<li>通过腹腔注射给予一只9周龄雄性C57BL/6小鼠氯胺酮（80−100 mg/kg）和赛拉嗪（5−10 mg/kg）进行麻醉。 
	注意：可使用其他品系的小鼠，但建议小鼠体重在20−27 g之间。</li>
	<li>将小鼠随机分为实验组（化学机械损伤并植入含1%雷帕霉素的PLLA-PCL支架）和两个对照组：1）化学机械损伤并植入PLLA-PCL支架，2）仅化学机械损伤不植入支架。</li>
	<li>将小鼠仰卧位固定于手术平台。使用固定在平台顶部的小线环绕住门齿，以伸展颈椎。</li>
	<li>使用约5 cm长的胶带将小鼠的四肢固定在手术台上。轻捏小鼠足掌以确认其已充分麻醉。</li>
	<li>随后准备手术区域。应去除术区毛发，并用碘伏或氯己定消毒液与酒精或稀释皮肤消毒剂交替擦拭三次。术区应覆盖无菌巾，操作者佩戴无菌手套。未使用时，灭菌器械应放置于无菌表面上。</li>
	<li>使用精细弯头虹膜剪在小鼠颈部做一条1.5 cm长的正中垂直切口。分离覆盖其上的胸腺，将形成的两个叶向外侧牵开以暴露气管。双侧于上端附着处切开胸骨舌骨肌和胸骨甲状肌（带状肌）。 
	注意：至此应完全暴露整个喉气管复合体。</li>
	<li>经口将22 G套管针穿过喉部进入气管。使用小镊子对小鼠喉前部施加压力，以协助套管针正确置入。通过气管观察白色套管针以确认其位置正确（非食管内）。 
	注意：小鼠气管极薄，白色套管针可通过半透明气管清晰可见。</li>
	<li>将涂有博来霉素的金属丝刷经已插入的套管针送入。</li>
	<li>缓慢撤出套管针，仅保留金属丝刷于气管内。</li>
	<li>使用精细镊子对气管施加反向压力，利用金属丝刷机械破坏气管腔。</li>
	<li>将套管针重新经金属丝刷上方插入气管。</li>
	<li>取出金属丝刷并再次涂抹博来霉素。</li>
	<li>重复步骤4.8−4.12共5次。每次操作之间均需在刷头上重新涂抹博来霉素。 
	注意：该模型的验证与详细描述可参见Hillel等人的研究8。</li>
	<li>将套管针从小鼠气管中移除。 
	注意：如不植入支架，可用组织胶闭合切口。</li>
</ol>
5. 小鼠经口PLLA-PCL支架置入术
<ol>
	<li>将一个3 mm的铸造支架装载到空的22 G套管针上（图3A）。 
	注意：支架应位于套管针尖端近端5 mm处。</li>
	<li>在3 mm的铸造支架上绘制一条细的黑色垂直线。 
	注意：该线条有助于在气管内更清晰地观察支架位置。</li>
	<li>经口使用已预装支架的套管针对小鼠进行插管。</li>
	<li>通过颈前切口观察套管针上的支架在气管内的位置（图3B）。 
	注意：气管非常薄，使得支架上的黑色染料可通过气管壁被观察到。利用此特征确认支架是否正确放置于气管内。</li>
	<li>用精细镊子经颈前切口夹住气管，以固定支架位置。</li>
	<li>在用精细镊子夹稳支架的同时，经口移除套管针。 
	注意：移除套管针时切勿对支架施加过大压力，以免压瘪支架管腔。但需施加足够力量，确保支架不随套管针被带出。可使用0.8 mm的唾液腺内窥镜观察支架在气管内的位置和放置情况。</li>
	<li>使用组织胶封闭颈前切口。</li>
	<li>待每只小鼠恢复至正常活动水平后，再将其放回笼中。</li>
</ol>
6. 样本的组织学制备
<ol>
	<li>根据动物实验方案，使用吸入麻醉剂麻醉小鼠，并在第7、14或21天通过颈椎脱位法处死小鼠。 
	注意：根据研究的慢性程度，可采用不同的时间间隔（例如28天、30天等）。</li>
	<li>按照步骤4.4和4.5所述，将小鼠置于手术平台上。</li>
	<li>使用精细弯头虹膜剪刀重新打开小鼠颈部切口。</li>
	<li>按照步骤4.6暴露气管。</li>
	<li>使用精细弯头虹膜剪刀在支架水平以下切断远端气管。</li>
	<li>使用精细弯头虹膜剪刀在喉部以下、支架以上切断近端气管。 
	注意：为防止气管回缩至胸腔内，应先切断远端气管。</li>
	<li>从后方将已切断的气管与食管分离，并将气管从小鼠体内取出。 
	注意：支架仍保留在小鼠气管内。</li>
	<li>从气管中取出支架，并置于10%福尔马林中固定24小时。</li>
	<li>将经福尔马林固定的鼠气管标本包埋于石蜡中，远端朝上放置，以便在下一步进行气管的轴向切片。</li>
	<li>使用切片机对石蜡包埋的小鼠气管进行5 μm厚度的切片。 
	注意：应从远端气管开始，沿轴向进行切片。</li>
	<li>沿标本全长每隔250 μm获取一张5 μm的代表性切片。</li>
	<li>对每张代表性切片进行H&amp;#38;E染色。
	<ol>
		<li>将切片放入二甲苯中，每张切片处理两次，每次3分钟，以脱蜡。</li>
		<li>将切片依次放入100%乙醇中2分钟、95%乙醇中2分钟、70%乙醇中2分钟，进行水化。</li>
		<li>用流动自来水冲洗切片2分钟。</li>
		<li>将切片置于苏木精染液中染色3−5分钟。</li>
		<li>用流动自来水冲洗切片5分钟。</li>
		<li>将切片放入1%酸性乙醇中1分钟。</li>
		<li>用流动自来水冲洗切片1分钟。</li>
		<li>用0.2%氨水冲洗30秒。</li>
		<li>用流动自来水冲洗切片5分钟，随后在95%乙醇中浸洗10次。</li>
		<li>将切片置于伊红-品红染液中染色30秒，进行伊红染色。</li>
		<li>将切片依次放入95%乙醇中5分钟，再放入无水乙醇中两次，每次5分钟，进行脱水。</li>
		<li>将切片放入二甲苯中两次，每次5分钟。</li>
		<li>使用基于二甲苯的封片剂封片。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照Hillel等8所述方法测量固有层的厚度。</li>
</ol>
7. 支架在体内的生物相容性
<ol>
	<li>按照步骤 6.1−6.4 制备组织切片。不要从这些气管切片中移除支架，以便观察相对于支架在气管腔内位置的炎症变化。
	<ol>
		<li>为确定支架引起的急性异物反应，使用 CD3 和 F4/80 标记物观察巨噬细胞和 T 细胞的活性。 
		注意：也可使用其他标记物来评估支架引起的急性炎症反应。</li>
		<li>将包埋在石蜡中的气管组织切成 5 μm 厚的切片，置于市售的亲水性载玻片上（材料表），每张载玻片放置两个切片。 
		注意：这些切片应来自气管中放置 PLLA-PCL 支架的区域。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将载玻片置于二甲苯中脱蜡，每次 5 分钟，共 2 次。</li>
	<li>将载玻片置于 100% 乙醇中，每次 3 分钟，共 2 次。</li>
	<li>将载玻片置于 95% 乙醇中 1 分钟。</li>
	<li>将载玻片放入组织染色架中，使其完全浸入抗原修复缓冲液（材料表），然后放入盛有沸水的蔬菜蒸锅中蒸煮 20 分钟。</li>
	<li>从蒸锅中取出染色架，并弃去抗原修复缓冲液。</li>
	<li>用 1 mL PBS 替代缓冲液。</li>
	<li>将载玻片置于湿盒中孵育 1 分钟。</li>
	<li>弃去 PBS，加入含 10% 胎牛血清（FBS）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM），4 °C 孵育 30 分钟。</li>
	<li>弃去 DMEM，加入两种来自不同物种的一抗混合液。用石蜡膜覆盖载玻片，于 4 °C 黑暗环境中过夜孵育。 
	注意：本实验方案中使用了兔抗 CD3 抗体和大鼠抗 F4/80 抗体（材料表）。</li>
	<li>用 PBS 洗涤载玻片，每次 5 分钟，共 3 次。</li>
	<li>加入针对一抗物种的二抗（材料表），用含 10% FBS 的 DMEM 稀释后，在室温黑暗条件下孵育 0.5−1 小时。</li>
	<li>在黑暗条件下用 PBS 洗涤载玻片，每次 5 分钟，共 3 次。</li>
	<li>在盖玻片上滴加含 4'6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的封片剂，将载玻片封片。将载玻片避光保存于 20 °C 或 4 °C。</li>
	<li>使用激光扫描共聚焦显微镜观察染色后的载玻片并拍照。</li>
	<li>定量分析 DAPI 及目标抗体染色的细胞总数，并与未损伤气管进行比较。</li>
</ol>
8. 小鼠气管定量基因表达分析
<ol>
	<li>按照步骤 6.1−6.7 所述方法采集小鼠气管，并移除支架。 
	注意：收获的小鼠气管可在 -80 °C 冰箱中保存长达 2 年。</li>
	<li>使用精细剪刀对步骤 8.1 中收获的气管组织进行破碎处理，并使用装有 1.4 mm 陶瓷珠（材料表）的珠磨均质仪进一步均质化，该步骤作为市售柱式 RNA 提取试剂盒（材料表）的一部分进行。 
	注意：珠磨均质仪设置为以 6 m/s 运行一个 40 秒的循环。</li>
	<li>使用柱式提取与纯化试剂盒（材料表），按照制造商说明书从气管裂解物中提取 RNA。</li>
	<li>使用分光光度计（材料表）对每个样本的 RNA 进行定量。 
	注意：通过 260/230 nm 比值评估 RNA 纯度，纯 RNA 样本的读数应为 2.0。</li>
	<li>使用逆转录酶（材料表）和热循环仪，将提取的 RNA 反转录为互补 DNA（cDNA），程序设置如下：25 °C 反应 5 分钟（引物退火），46 °C 反应 30 分钟（逆转录），然后 95 °C 反应 1 分钟（灭活逆转录酶）。</li>
	<li>用无 RNase 水将互补 DNA 样本稀释至浓度为 10−25 ng/mL，用于定量实时 PCR。</li>
	<li>在一个 96 孔 PCR 板（材料表）的单个孔中，加入 1 µL 互补 DNA（10−25 ng/mL）、10 µL PCR 预混液（材料表）、8 µL ddH2O 以及 0.5 μL 10 μM 的目标基因特异性正向与反向引物。 
	注意：每孔总体积应为 20 μL。每个 96 孔板上的孔仅应包含一个样本和一个目标基因。</li>
	<li>对所有目标基因重复步骤 8.1–8.7，并对每个基因的每个样本进行三复孔检测。 
	注意：常用于研究纤维化标志物的基因特异性正向与反向引物（材料表）包括 I 型胶原、III 型胶原以及内参基因 β-actin。</li>
	<li>将 96 孔板放入实时定量 PCR 仪中，启动以下程序：95 °C 变性 15 秒，60 °C 退火与延伸 60 秒，共进行 40 个循环。</li>
	<li>将每个目标基因（GOI）检测的循环阈值（CT）归一化至各样本内参基因 β-actin 的 CT 值，得到每个 GOI 的 ΔCT 值。然后比较处理组与未处理组样本中各 GOI 的 ΔCT 值，计算出 ΔΔCT。 
	注意：循环阈值是指扩增曲线上达到预设基因产物量（ΔRn）的时间点。每个反应的 ΔRn 值应针对每个目标基因确定，并应落在扩增曲线的线性部分。 
	注意：ΔCT = CT（GOI） – CT（内参基因）；ΔΔCT = ΔCT（处理组） – ΔCT（未处理组）。</li>
	<li>通过计算 2ΔΔCT，得出处理组与未处理组之间基因表达的相对变化倍数（fold change）。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

成功构建和在体内使用载药支架最关键的步骤包括：1）确定实现理想药物释放速率所需的最优PLLA-PCL比例；2）确定应释放药物的适当浓度；3）将支架在血管导管周围塑形以用于体内实验；4）在诱导喉气管狭窄（LTS）后，经口将支架递送至小鼠体内，同时避免造成致命性气道阻塞。
尽管已有多种在气道疾病动物模型中利用支架进行药物递送的方法，但开发一种能够在患病小鼠模型中实现药物递送的生物相容性支架尚属首次。在建立该药物递送方法的过程中，对原有方法进行了多项改进。确定合适的PLLA-PCL配比至关重要，以确保所制备的支架具有足够的机械刚性，能够顺利置入气管，并在生理分泌物存在的情况下仍能稳定留置于气管内。最终选择70:30的PLLA-PCL配比用于支架制备，并采用血管导管作为模具，因为该配比的支架能够以可预测的方式稳定释放雷帕霉素，可在小鼠模型中安全、可靠地置入，且在生理条件下不会发生降解。该方法中一个困难且可能依赖于生产厂家的步骤是围绕血管导管进行支架成型。最初在构建体内支架时，将22 G血管导管插入玻璃移液管的尖端，然后将聚合物溶液注入血管导管与玻璃移液管之间的空隙，从而形成该间隙的铸型。然...

喉气管狭窄（LTS）是一种以气管病理性狭窄为特征的疾病，最常见原因是医源性插管后损伤。细菌定植、对气管造口管或气管内管的异物反应以及患者特异性因素共同导致异常的炎症反应。这种不良适应性免疫反应促使胶原蛋白在气管内沉积，造成管腔狭窄，进而引发狭窄1,2。目前该疾病的治疗主要依赖手术，因此研究人员已开始探索针对导致胶原过度沉积的异常炎症和促纤维化通路的非手术治疗方法。雷帕霉素可抑制mTOR信号复合物，已被证实具有免疫抑制作用以及显著的抗成纤维细胞效应。然而，当雷帕霉素通过全身给药时，常见的副作用（如高脂血症、贫血、血小板减少症）可能较为明显3。本研究方法的目的是开发一种适用于气道局部给药的载体，以减轻这些全身性不良反应。我们的评估重点在于研究该药物递送系统对局部免疫反应的影响，以及其抑制成纤维细胞功能和改变局部免疫微环境的能力。疾病特异性结局包括在体实验中对纤维化标志物的评估。
可生物降解的药物洗脱支架已在多种器官系统的疾病动物模型中得到应用，包括气道4。在治疗气道狭窄或塌陷方面，既往研究曾使用药物涂层硅胶支架和镍基支架5。本方法选择PLLA-PCL结构，因其在生理条件下持续3周的药物释放特性及良好的机械强度，这已在先前发表的研究中得到证实6。PLLA-PCL还是一种生物相容性良好且可生物降解的材料，已获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准4。已有研究在大型动物模型（如兔和犬）中评估了洗脱顺铂和丝裂霉素C（MMC）的生物相容性支架。然而，在这些动物模型中，支架并未植入疾病模型动物体内，且是经颈路径植入的。本研究提供了一种独特的方法，用于评估在气道损伤和喉气管狭窄（LTS）小鼠模型中经口植入的生物相容性药物洗脱支架。一种可局部释放免疫调节药物并能微型化用于小鼠模型研究的生物相容性支架，对转化性临床前研究具有重要价值。以往使用其他材料构建的支架常引发强烈的异物反应，从而加重LTS所特有的基础炎症7。据我们所知，本方法是首个在LTS小鼠模型中研究基于支架的药物递送系统的免疫调节和抗纤维化效应的研究。小鼠模型本身在研究免疫调节药物对气管作用方面具有多项优势：可利用基因修饰小鼠以及健康与疾病状态小鼠的实验队列进行研究，有助于提高实验的可重复性和成本效益。此外，经口将支架送入小鼠气管的方式模拟了该类支架在人类中的临床植入途径，进一步凸显了本方法的转化价值。最后，PLLA-PCL支架结合药物后相对易于制备，便于改造以递送其他旨在减少气管瘢痕形成的药物疗法。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;1. 支架制备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>22 号套管针</td><td>Jelco</td><td>4050</td><td></td></tr><tr><td>二氯甲烷</td><td>Sigma Aldrich</td><td>270997-100ML</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Fisher Scientific</td><td>56-81-5</td><td>亦可从其他供应商处获得。</td></tr><tr><td>PDLGA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>739955-5G</td><td></td></tr><tr><td>PLLA-PCL (70 : 30)</td><td>Evonik Industries AG</td><td>65053</td><td></td></tr><tr><td>雷帕霉素</td><td>LC Laboratories</td><td>R-5000</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;2. 动物手术&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>金属丝刷</td><td>Mill-Rose Company</td><td>320101</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;3. 免疫组织化学染色&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗原修复缓冲液</td><td>Abcam</td><td>ab93678</td><td>亦可从其他供应商处获得；需酸性 pH 条件</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Cell Signaling</td><td>8961S</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11965-092</td><td>亦可从其他供应商处获得。</td></tr><tr><td>FBS（胎牛血清）</td><td>MilliporeSigma</td><td>F4135-500ML</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗兔-488 抗体</td><td>Lif technology</td><td>a11008</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗大鼠-633 抗体</td><td>Lif technology</td><td>a21094</td><td></td></tr><tr><td>亲水载玻片</td><td>BSB7028</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>100-10023</td><td>亦可从其他供应商处获得。</td></tr><tr><td>兔抗 CD3 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab5690</td><td></td></tr><tr><td>大鼠抗 F4/80 抗体</td><td>Biolengend</td><td>123101</td><td></td></tr><tr><td>蔡司 LSM 510 Meta 共聚焦显微镜</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;4. 定量 PCR&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.5 mm 玻璃珠</td><td>OMNI International</td><td>19-645</td><td></td></tr><tr><td>珠磨匀浆器</td><td>OMNI International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>基因特异性正向/反向引物</td><td>基因组资源核心实验室</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000 分光光度计</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Power SYBR Green Mastermix</td><td>Life Technologies</td><td>4367659</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy 小量试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>80404</td><td></td></tr><tr><td>StepOnePlus 实时荧光定量 PCR 系统</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

用于喉气管狭窄小鼠的生物相容性载药气管支架设计

Design of a Biocompatible Drug-Eluting Tracheal Stent in Mice with Laryngotracheal Stenosis

喉气管狭窄（LTS）是一种声门下区和气管的病理性狭窄，可导致胸外气道阻塞及明显的呼吸困难。LTS 通常由气管内异物引起的黏膜损伤所致，进而造成组织损害和异常的局部炎症反应，最终导致病理性瘢痕组织沉积。由于缺乏有效的药物治疗方法，LTS 的治疗主要依赖手术干预。本方法旨在构建一种可微型化并植入LTS小鼠体内的生物相容性支架。我们证实，由70%左旋聚乳酸（PLLA）和30%聚己内酯（PCL）组成的PLLA-PCL材料具有理想的生物力学强度，具备良好的生物相容性，适用于体内植入支架，并能够实现药物缓释。该方法提供了一种药物递送系统，可用于测试多种免疫调节剂在局部抑制炎症和减轻气道纤维化方面的效果。支架的制备耗时28−30小时，且易于重复生产，适合大规模动物实验。在本研究中，我们将雷帕霉素药物包载于支架中，以评估其在减少纤维化和胶原沉积方面的有效性。结果表明，PLLA-PCL支架可稳定释放雷帕霉素，在生理条件下具有良好的机械稳定性，且生物相容性优异，几乎不引发气管内的炎症反应。此外，负载雷帕霉素的PLLA-PCL支架在体内显著减少了气管瘢痕的形成。

本研究中使用的载有雷帕霉素的可生物降解PLLA-PCL支架在生理条件下能够以稳定且可预测的方式释放雷帕霉素（图1）。图2显示了围绕22 G套管针成型的PLLA-PCL支架，用于小鼠LTS模型。为了确定雷帕霉素在气管内释放对减轻纤维化是否有效，可通过基因表达分析、流式细胞术、免疫荧光和ELISA检测纤维化相关基因表达的变化以及急性炎症标志物。已证实采用上述方法可成功将微型支架植入小鼠气管。该方法的示意图见图3。图4显示了微型生物相容性支架原位置于气管内的状态，支架上的黑色标记通过半透明的小鼠气管清晰可见。在初步实验中，使用0.8 mm的唾液腺内窥镜确认支架在气管内的位置具有帮助作用。21天后，为确认经口植入的支架有效且未发生移位，重新打开颈部切口以确定支架的位置。如图4B所示，支架的黑色染料标记表明其在气管内保...

喉气管狭窄由病理性瘢痕沉积引起，导致气管气道严重狭窄，目前缺乏有效的药物治疗方法。利用PLLA-PCL（70%左旋聚乳酸和30%聚己内酯）支架作为局部药物递送系统，可研究旨在减少气管内瘢痕增生的潜在疗法。

喉气管狭窄（LTS）是一种以声门下区和气管病理性狭窄为特征的疾病，可导致胸外气道梗阻及显著的呼吸困难……

该方案使我们能够在喉气管狭窄的小动物模型中研究药物洗脱支架，从而以经济高效的方式利用基因修饰动物。通过经口放置药物洗脱气道支架，避免了对动物进行气管开放性切口，代表了一种更具临床相关性的喉气管狭窄模型。该技术有助于开展针对局部药物递送策略治疗喉气管狭窄的临床前研究。该技术为药物洗脱气道支架在小型动物模型中的转化研究提供了一个可行且有效的平台，该平台可进一步应用于大型动物模型的研究以及临床实践。特别是经口插管、气管损伤诱导以及气道支架置入等步骤。由于许多精细操作细节无法完全通过文字描述清楚，因此对该技术难度较高的手术过程进行可视化演示至关重要。制备含1%雷帕霉素的聚合物溶液时，将6毫克雷帕霉素加入含有600毫克70-30 PLLA-PCL的玻璃小瓶中。在通风橱内，向添加了雷帕霉素的实验组小瓶和对照组小瓶中各加入6毫升二氯甲烷，并向每个小瓶中加入120微升甘油。然后盖紧小瓶，于室温下静置6至12小时，使PLLA-PCL溶液充分均质化。为了制备小鼠气道支架，使用无菌材料和无菌技术，将一毫升含雷帕霉素的PLLA-PCL溶液缓慢旋转涂覆于22号氟化乙烯丙烯材质导管套管的静脉插管上。当全部溶液涂覆完成后，将成型的导管套管斜靠放置，使导管尖端朝下，导管手柄置于玻璃培养皿边缘，并放入真空罩中。室温下真空处理24小时后，轻柔旋转并沿轴向滑动将导管从干燥的支架结构中抽出，并沿圆周方向检查支架是否存在铸型过程中可能产生的任何缺陷。为了便于观察，可在支架表面沿其长度方向画一条细的黑色线条。使用精细的直头剪刀修剪铸造好的支架两端，使边缘与轴向一致，并用剪刀将每个支架切成3毫米长的轴向节段。然后将每个3毫米长的支架装入一根新的22号静脉导管上。为诱导喉气管狭窄，在确认小鼠对足部夹捏无反应后，将第一只小鼠仰卧位放置于手术平台上，并将固定在平台顶部的一小段缝线绕过其中门齿。用胶带将四肢固定于手术台上，在小鼠颈部做一条1.5厘米长的正中垂直切口。分离覆盖其上的胸腺，将形成的两个叶向外侧牵开，以暴露气管。 双侧分离胸骨舌骨肌和胸骨甲状肌的上端附着点，经口将22号套管针穿过喉部进入气管。使用小型镊子对小鼠喉部前侧施加压力，以帮助套管针正确放置。正确放置的套管针可通过气管内呈现的白色来观察确认。为诱导损伤，将涂有博来霉素的金属刷经插入的套管针穿过，并缓慢撤出套管针，使仅金属刷保留在气管内。使用精细镊子对气管施加反向压力，利用刷子机械性破坏气管腔，随后将套管针再次经金属刷上方插入气管。取出金属刷，重新涂抹博来霉素，然后按照上述方法重复插入和取出金属刷共四次。最后一次博来霉素给药后，将导管从气管中取出。为经口放置PLLA-PCL支架，需确保每个支架中已嵌入一条细的黑色垂直线，并使用预装支架的套管针经口对小鼠进行插管。应通过颈部切口观察支架在气管内的位置。支架放置到位后，使用精细镊子通过切口牢固但轻柔地

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

与拉林戈切尔·斯泰斯·斯泰斯特的小鼠中生物相容性药物-脱酸支架的设计

本视频展示并比较了两种用于研究小鼠闭塞性气道疾病（OAD）发生发展的实验模型，即异位和原位气管移植模型。...

小鼠异位与原位气管移植模型用于研究闭塞性气道疾病的形成

本文描述了一种小鼠颈动脉支架植入模型。与其他类似方法相比，该手术操作极为快速、简便且易于实施，能够方便地研究血管壁对不同药物洗脱支架的反应以及再狭窄的分子机制。...

用于研究再狭窄的颈动脉支架植入小鼠模型

我们的目标是设计、制造并测试用于捕获内皮细胞的铁磁性支架。对10个支架进行了断裂测试，另10个支架进行了残余磁性测试。最后，对10个支架进行了测试 体外...

用于内皮细胞捕获与滞留的铁磁性裸金属支架

移植物狭窄是组织工程气道替代物面临的关键障碍。为了研究导致狭窄的细胞机制，我们采用了一种经骨髓单个核细胞（BM-MNC）接种的组织工程气管替代小鼠模型。本文详细描述了我们的实验方案，包括支架制备、BM-MNC分离、移植物接种以及移植手术。...

在小鼠模型中接种与植入生物合成组织工程气管移植物

本方案旨在将三维生物打印贴片移植到模拟心力衰竭的小鼠梗死心外膜上。内容包括麻醉、开胸手术、左前降支冠状动脉永久性结扎以及将生物打印贴片应用于心脏梗死区域的详细操作步骤。...

在小鼠心肌梗死模型中移植三维生物打印补片

该方案描述了一种可进行成像的生物反应器，可用于选择性去除大鼠气管的内源性上皮，并在外源细胞接种后使其在管腔表面均匀分布，随后实现长期培养 体外...

成像引导式生物反应器用于生成生物工程化气道组织

本文旨在描述在小鼠中进行异位喉移植所需的显微外科手术步骤。与其他喉移植动物模型相比，该小鼠模型的优势在于成本效益高，并且可获得丰富的免疫学检测手段及相关数据。...

一种用于研究喉移植的异位小鼠模型

获得无菌状态对于气管组织移植至关重要。本文介绍了一种使用低剂量γ射线辐照的灭菌方案，该方法可被器官完全耐受。...

低剂量伽马辐射对脱细胞气管移植物的灭菌处理

此处，我们提出一种经气管递送脂多糖（LPS）的实验方案 通过 无创经口咽气管插管。该方法可最大限度地减少手术操作对动物造成的创伤，并能准确地将LPS输送至气管，进而进入肺部。...

小鼠非侵入性气管内脂多糖滴注

小鼠肺内气管移植（IPTT）模型对于研究肺移植后闭塞性气道疾病（OAD）具有重要价值。该模型可深入揭示同种异体移植后气道闭塞过程中肺特异性的免疫学和血管生成行为，且具有高度可重复性。本文中，我们描述了IPTT的操作步骤及其预期结果。...

小鼠肺内气管移植：肺移植后闭塞性气道疾病研究模型

了解经口气管支架置入技术在小鼠喉气管狭窄模型中的应用，使用PLLA-PCL药物洗脱支架进行局部给药研究。该方法为临床转化研究提供了可行的实验平台。

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