利用温度控制基于微管的三维活性流体的流动速度

活性物质已应用于诸如分子阴影等多种领域。为了将该应用提升到新的水平，我们需要开发出对活性物质进行局部控制的能力。我们提供了一种易于使用的方法，该方法无需对活性流体进行任何修改。

也不需要修改显微镜的光路来实现对活性流体的局部控制。我们的方法可广泛应用于主要反应遵循错误定律的各种系统，例如微管滑动实验或基于酶的系统。该装置包含一个水循环系统。

如果发生泄漏，水可能会损坏显微镜。因此，在采用本方案之前，必须确保系统无泄漏。本方案要求将玻璃样品安装在温控台上。

尽管手稿描述了装片步骤，但缺少将样本固定到载物台等机械细节。演示该步骤的人员为 Teagan Bate、Edward Jarvis 和 Megan Varney。Teagan 和 Edward 为研究生，Megan 则来自某实验室的本科生。

在Eppendorf管中制备活性流体时，将16.7 µL的8 mg/mL微管蛋白溶液与6.7 µL的1.8 µmol/L驱动蛋白马达簇溶液，以及1.1 µL的500 mmol/L DTT溶液在高盐M2B缓冲液中混合。通过加入11.4 µL的7%（重量/重量）聚乙二醇溶液使微管蛋白成束。随后加入2.8 µL的50 mmol/L ATP以激活驱动蛋白马达。

通过加入2.8 µL的丙酮酸激酶/乳酸脱氢酶储备液和13.3 µL的200 mM磷酸烯醇式丙酮酸溶液，维持ATP浓度。为减少光漂白效应，加入10 µL的20 mM Trolox溶液、1.1 µL的3.5 mg/mL过氧化氢酶溶液、1.1 µL的20 mg/mL葡萄糖氧化酶溶液以及1.1 µL的300 mg/mL葡萄糖溶液。通过加入1.6 µL体积分数为0.025%的示踪微粒溶液，追踪流体运动。

加入高盐M2B缓冲液，使总体积达到100微升。接着，用去离子水冲洗聚丙烯酰胺包被的玻片和盖玻片。用加压空气将玻片吹干。

将玻片放置在干净、平坦的表面上。在石蜡膜上切割出一条宽3毫米的通道。总宽度与20毫米宽的玻璃盖玻片相同。

将石蜡置于载玻片和盖玻片之间，以形成用于液体流动的微流通道。将载玻片和石蜡复合体放置在80°C的加热板上，使石蜡熔化，从而将玻璃粘附于石蜡膜上。在熔化过程中，用移液器吸头轻轻按压盖玻片，使石蜡膜均匀地粘附在玻璃表面。

黏附后，将玻璃复合体冷却至室温。立即用移液枪尖以倾斜角度接触载玻片表面、远离通道开口处，将制备好的活性液体加入流动通道中。用紫外胶密封通道。

构建温控装置后，将活性流体样品置于蓝宝石表面，使载玻片一侧与表面接触。用纸胶带固定玻璃载玻片。使用铜胶带将温度传感器固定在盖玻片表面。

将装置安装到显微镜载物台上，使盖玻片朝向物镜，用显微镜载物台针式夹具固定装置。打开温度控制器和鱼缸泵。按照制造商指南设定目标温度。

启动温度控制，并记录ThermoSensor的温度数据。使用配备GFP滤光片的荧光显微镜，以恒定时间间隔对样品进行成像，以监测活性混合物中Alexa 488标记的示踪颗粒。

调整时间间隔，使示踪剂在相邻帧之间的位移在九个像素以内。对于以每秒10微米速度运动的示踪剂，使用4倍物镜时，建议时间间隔为1至5秒。将图像保存为TIF文件，根据帧编号命名文件，并存储在单独的文件夹中。

对于这种由驱动蛋白驱动微管的活性流体，温度分别控制在10、20、30和40摄氏度。在四小时内，温度波动范围为0.1至0.3摄氏度，表明该温度控制系统具有良好的稳定性和可靠性。每两秒对示踪粒子进行一次成像，连续图像可用于追踪示踪粒子的运动轨迹。

在20至36摄氏度下测得的平均速度在0至2小时范围内几乎与时间无关。而在10摄氏度和40摄氏度时，平均速度迅速下降，分别由低于16摄氏度时微管解聚以及高于36摄氏度时驱动蛋白簇功能异常所致。当系统温度每30分钟在20摄氏度和30摄氏度之间交替变化时，活性流体的平均速度不仅相应地加速和减速，而且在10秒内即对温度变化作出响应。

当温度低于16度或高于36度时，活性液体会开始出现功能异常。因此，在调节温度控制器时，应确保温度保持在16至36度之间。通过局部调控活性液体的能力，可实现对流体动力的定向控制，例如将载荷从A点输送至B点，或构建无需物理阀门的微流控装置。

用于涂覆玻璃器皿的丙烯酰胺是一种可通过皮肤吸收的神经毒素。请佩戴适当的安全防护装备，如手套、实验服和护目镜，以尽量降低风险。