使用温度控制基于微管的3D活性流体的流速
2019年11月26日
该协议的目的是使用温度来控制三维有源流体的流动速度。这种方法的优点不仅允许原地调节流速，还可实现动态控制，例如定期调优流速。
活性物质已用于各种应用，如分子阴影。为了将应用程序更新到一个新的水平，我们需要发展在本地控制活动物质的能力。我们提供一种易于使用的方法，不需要修改活性流体。
也不需要修改显微镜的光学路径，以实现对有源流体的局部控制。我们的方法可以应用于各种系统，其中主要反应遵循错误定律，如微管滑翔测定或酶为基础的系统。设置涉及一个水循环系统。
如果发生泄漏，水可能会损坏显微镜。因此，在采用我们的协议之前，确保系统无泄漏非常重要。我们的协议要求将玻璃样品安装在温度级。
虽然手稿描述了安装过程，但它缺乏机械的微妙之处，例如将样品固定到舞台上。演示程序， 将是蒂根 · 贝特， 爱德华 · 贾维斯和梅根 · 瓦尼。蒂根和爱德华是研究生，梅根是实验室的本科生。
为了在Eppendorf管中准备活性液体，将16点7微升（每毫升8毫克）与6点7微升（一点8微摩尔激宁电机组）混合，在高盐M2B中混合1点7微升500毫摩尔DTT。通过添加 11 点 4 微升重量 7% 的聚乙烯二醇来捆绑微管。然后通过添加 2 点 8 微升 50 毫摩尔 ATP 来激活激辛电机。
通过添加2点8微升的尿皮万酸激酶/乳酸脱氢酶和13点3微升200毫摩尔磷酚丙酮，保持ATP浓度。通过添加10微升20毫摩尔Trolox，一点一微升每毫升三点五毫克，一点一微升每毫升葡萄糖氧化酶20毫克，一点一微升每毫升葡萄糖300毫克葡萄糖，一点一微升每毫升葡萄糖300毫克。通过按体积示踪粒子添加一点六微升零点零两个百分之五的体积来跟踪流体的运动。
加入高盐M2B，实现总体积100微升。接下来，用 DI 水冲洗聚丙烯酰胺涂层玻璃滑梯和盖滑。用加压空气擦干眼镜。
将眼镜放在干净、平坦的表面上。在蜡膜中切割一个三毫米宽的通道。总宽度与 20 毫米的玻璃盖滑相同宽度。
将蜡插入滑梯和盖板滑之间，形成流体流动单元通道。将玻璃蜡复合物放在 80 摄氏度的热板上，将玻璃粘在蜡膜上，以熔化蜡。在熔化过程中，用移液器尖端轻轻按压盖滑，以均匀地将蜡膜粘附在玻璃表面。
粘附后，将玻璃复合物冷却至室温。将准备好的有源流体与移液器尖端迅速加载到流通道中，该滑移器尖端与通道开口一角，与玻璃滑动表面接触。用紫外线胶水密封通道。
建立温度控制设置后，将活性液体样品放在蓝宝石表面，滑动侧接触表面。用纸胶带固定玻璃滑梯。使用铜胶带，将热传感器连接到盖滑表面。
要将设置安装在显微镜阶段，盖滑滑向目标，请用显微镜阶段针夹固定设置。打开温度控制器和鱼缸泵。按照制造商指南设置目标温度。
启用温度控制。并记录热传感器温度数据。在配备 GFP 滤波立方体的荧光显微镜上以恒定的时间间隔对样品进行成像，以监测活性混合物中标有 Alexa 488 的示踪颗粒。
调整时间间隔，使帧之间的跟踪器位移在 9 像素范围内。对于以 10 微米/秒的速度移动的成像示踪器，使用四倍的目标，建议时间间隔为 1 到 5 秒。将图像另存为 TIF 文件，根据帧编号命名文件，并将其存储在单独的文件夹中。
对于这种基纳辛驱动的基于微管的活性流体，温度控制在10、20、30和40摄氏度。温度的波动在零点一至零摄氏度以内四个小时，显示了这种温度控制装置的稳定性和可靠性。跟踪器每两秒进行一次成像，顺序图像允许跟踪器轨迹。
在20至36摄氏度的平均气温，似乎几乎时间独立在零至两个小时。在10摄氏度和40摄氏度时，由于微管脱聚化低于16摄氏度和基尼辛团团故障分别超过36摄氏度，平均速度迅速下降。当系统温度每30分钟交替20至30摄氏度时，活性流体的均速不仅相应地加速和减速，而且在10秒内对温度变化作出反应。
当冷却低于 16 度或加热到 36 度以上时，有源流体开始出现故障。因此，在操作温度控制器时，请确保温度在 16 到 36 度之间。局部调节有源流体的能力允许引导流体功率，例如从 A 点到 B 点运送货物，或开发不需要物理阀的微流体装置。
用于涂覆玻璃器皿的丙烯酰胺是一种神经毒素，可以通过皮肤吸收。佩戴适当的防护设备，如手套、实验室外套和安全护目镜，以最大限度地降低风险。
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概述
本协议展示了一种使用温度控制三维活性流体流速的方法。这种方法允许对流速进行原位调节和动态调整。
关键研究组成部分
科学领域
- 活性物质
- 流体动力学
- 显微技术
背景
- 活性物质在各种领域有应用，包括分子阴影。
- 活性流体的局部控制对推进这些应用至关重要。
- 该方法不需要对活性流体进行修改。
- 它还避免了对显微镜光路的改变。
研究目的
- 开发一种简单的方法来局部控制活性流体。
- 提高活性物质在科学应用中的可用性。
- 提供适用于各种系统的通用方法。
所用方法
- 实施水循环系统。
- 通过温度操作控制流速。
- 将该方法应用于遵循错误定律的系统。
- 在微管滑动测定和酶基系统中的应用。
主要结果
- 成功实现了原位流速调节。
- 通过温度调整实现了流速的动态控制。
- 该方法适用于广泛的活性物质系统。
- 不需要对活性流体或显微镜设置进行修改。
结论
- 该协议提供了一种控制活性流体的简单方法。
- 它增强了活性物质在研究中的潜在应用。
- 这种方法可能会推动各个科学领域的进步。
常见问题
Executive Industry Relevance
Temperature-dependent control of microtubule-based active fluids enables tunable flow rates without physical valves, supporting dynamic microfluidic device design. This approach enhances predictive confidence in active matter systems by leveraging Arrhenius kinetics for reproducible speed modulation. The method reduces experimental variability and supports scalable assay development for target validation and phenotypic screening workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of motor protein function under controlled thermal conditions to validate kinesin-microtubule interactions as therapeutic targets.
- Operational Value: Provides a tunable, reagent-free system for assessing target engagement and pathway modulation in real time.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by correlating temperature-dependent flow changes with motor protein activity, informing lead identification decisions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, temperature-dependent flow speed readouts (4–8 µm/s) suitable for high-content screening of compound libraries.
- Operational Value: Enables assay standardization through precise thermal control, improving reproducibility across replicates and laboratories.
- Scalability: Supports microfluidic integration for parallel compound testing without valve-based flow regulation, reducing device complexity.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains physiological relevance by operating within 16–36°C range, aligning with mammalian thermal stability for target proteins.
- Preclinical Modeling: Facilitates disease-relevant system evaluation by simulating thermal stress conditions on cytoskeletal dynamics.
- Risk-Adjusted Advancement: Allows dynamic perturbation studies to assess compound effects on motor protein function under varying thermal profiles.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing a tunable biophysical readout that complements biochemical and imaging-based assays for target validation and lead optimization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of motor protein inhibitors or activators through real-time flow speed modulation.
- Screening: Delivers quantitative, temperature-dependent outputs that enable dose-response analysis and hit confirmation in active matter-based assays.
- Analytics: Provides continuous, trackable tracer displacement data enabling statistical comparison of conditions and compound effects.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling thermal sensitivity of cytoskeletal systems relevant to neurodegenerative and cancer targets.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for active matter characterization across multiple projects, reducing redevelopment costs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence through direct, real-time measurement of motor protein-driven dynamics.
- Operational Value: Enhances reproducibility via precise thermal control, minimizing batch-to-batch variability in active fluid preparations.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by enabling rapid, reversible perturbation of target systems without sample remake.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by quantifying target engagement under physiologically relevant thermal fluctuations.
Implementation Considerations
- Requires expertise in active matter preparation, microscopy, and thermal control systems.
- Needs a stable temperature stage with water circulation and leak-proof sealing to prevent microscope damage.
- Demands standardization of sample loading and sealing protocols across users for consistent results.
- Requires adaptation considerations for different tracer particles or surface coatings when scaling to other active matter systems.
- Limited by the 16–36°C operational window due to microtubule depolymerization and motor protein denaturation outside this range.
