Name: 利用膜成熟腺细胞聚合培养（MAAC）的人类成熟腺细胞的分离与培养 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 28 s
Description: 学习利用膜成熟腺细胞聚合培养（MAAC）技术分离和培养人类成熟脂肪细胞的方法，用于研究糖尿病和肥胖相关的细胞相互作用及代谢功能。该技术支持长期培养并可用于探究葡萄糖摄取、脂质生成等关键生物学过程。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

感谢 Xiao-Rong Peng 和 Stefan Hallen 提供资源并优化脂肪细胞的分离，感谢 Martin Uhrbom 提供技术支持，感谢 Daniel Olausson 和 Malin Lönn 协调并提供人脂肪组织。

采集自瑞典哥德堡市萨尔格伦斯卡大学医院接受择期手术的女性患者的腹部脂肪组织匿名样本。所有研究对象在签署书面知情同意书前，均接受了书面和口头的信息告知。本研究已获得瑞典哥德堡地区伦理审查委员会的批准。
注意：方法的概述见图1。
1. 缓冲液、组织培养基和培养板的制备
<ol>
	<li>配制5倍浓度的Krebs Ringer（KR）储备液：将35.1 g NaCl、1.75 g KCl、0.82 g KH2PO4和1.48 g MgSO4·7H2O溶解于900 mL水中，加入1.84 g CaCl2·2H2O，加水定容至1 L。用0.22 µm滤膜无菌过滤，4 °C保存。</li>
	<li>取5倍浓度KR储备液，配制1 L含1倍浓度KR、25 mM HEPES、2 mM葡萄糖和2%牛血清白蛋白（BSA）的缓冲液（以下简称洗涤缓冲液）。调节pH至7.4。</li>
	<li>配制500 mL胶原酶消化缓冲液，包含1倍浓度HBSS + CaCl2 + MgCl2、2% BSA和450 mL水（以下简称消化缓冲液）。 
	注意：胶原酶应在第2.2步称量脂肪组织后，再加入消化缓冲液中。</li>
	<li>将Medium 199的pH调节至7.4。</li>
	<li>将上述两种缓冲液和Medium 199均用0.22 µm滤膜瓶过滤无菌化，并预热至37 °C。 
	注意：为节省时间，可在处理脂肪组织前预先配制好细胞培养基并加入培养板中。对于24孔板格式（图1A），每孔加入0.5−1 mL的Dulbecco改良Eagle培养基/Ham's F12营养混合物（DMEM/F12）、10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素-链霉素（penn/strep）和20 nM胰岛素。此时也可根据实验设计，在培养基中加入小分子化合物或其他稳定的药理学试剂。将培养板置于细胞培养孵箱中（37 °C，5% CO2）。</li>
</ol>
2. 人体皮下脂肪组织的解剖
注意：在整个分离过程中，应在生物安全柜内操作，并使用无菌技术，且 exclusively 使用经高压灭菌和无菌的设备。
<ol>
	<li>将人脂肪组织置于直径15 cm的培养皿中，并加入少量199培养基，以在解剖过程中保持组织湿润。</li>
	<li>取约高尔夫球大小的脂肪组织块进行操作，用镊子夹住较大的纤维化血管，用闭合的剪刀背面轻轻刮擦脂肪组织，从而分离脂肪细胞。弃去大块的纤维化组织。称量修整后的脂肪组织重量。</li>
</ol>
3. 胶原酶处理
<ol>
	<li>将胶原酶以 1 mg/mL 的浓度加入消化缓冲液中（见步骤 1.3）。使用 0.22 µm 无菌滤器对溶液进行无菌过滤。 
	注意：建议每克脂肪使用 3 mL 消化缓冲液（例如，对于 100 g 脂肪，需准备含 300 mg II 型胶原酶的 300 mL 消化缓冲液）。 
	注意：II 型胶原酶对眼睛和皮肤有害，可能引起呼吸道刺激。操作胶原酶时应佩戴手套和眼部防护装备，并在通风橱中进行操作。</li>
	<li>将约 10 g 脂肪组织转移至 15 cm 培养皿中，使用弯头剪刀小心剪碎脂肪，直至形成均匀细腻的混合物，且无大块脂肪组织残留。重复此过程，直至所有脂肪组织均被处理完毕。 
	注意：每轮剪碎过程约需 2 分钟，脂肪组织应被剪至足够小，以便可用宽口吸头移液。此步骤对获得高质量脂肪细胞至关重要。若组织块过大，则需延长消化时间，从而影响细胞活力。</li>
	<li>用勺子将剪碎的脂肪转移至 50 mL 锥形管中。每管加入 10 mL 剪碎的组织和 30 mL 消化缓冲液。若剪碎脂肪量少于 10 mL，应按比例调整相应体积。</li>
	<li>将组织在 37 °C 摇床培养箱中以 150 rpm 持续振荡消化 30−45 分钟。30 分钟后，每隔 5 分钟检查一次消化情况，避免过度消化。 
	注意：当脂肪组织消化液呈均一状态、无大块组织残留且呈现杏色时，表明消化完成。</li>
</ol>
4. 细胞悬液的过滤及成熟脂肪细胞的纯化
<ol>
	<li>将一个漏斗置于1 L无菌烧瓶上方，并在漏斗内放置一个无菌的250 µm网孔滤膜。将消化后的脂肪溶液倒入滤膜中，以去除未消化的组织。</li>
	<li>当所有脂肪细胞悬液均通过滤膜后，轻轻挤压滤膜以提高脂肪细胞的回收率。向滤膜中加入约50−100 mL洗涤缓冲液进行冲洗，然后再次挤压滤膜。</li>
	<li>将从烧瓶中分离得到的脂肪细胞悬液倒入分液漏斗中，并加入洗涤缓冲液直至漏斗几乎完全充满。轻轻倒置漏斗数次，使脂肪细胞悬液与缓冲液充分混匀。</li>
	<li>静置悬液2−3分钟，直至出现明显的两层分离（图1B），上层为含有成熟脂肪细胞和游离脂质的黄色层，下层为含有缓冲液及脂肪基质血管组分（SVF）的层。</li>
	<li>打开分液漏斗的活塞，缓慢将下层液体释放至无菌烧瓶中（SVF中的细胞可在200 × g 离心7分钟后沉淀并收集）。保留分液漏斗中含成熟脂肪细胞的上层液体。</li>
	<li>重复步骤4.3−4.5的洗涤过程三次，以充分洗涤成熟脂肪细胞并彻底去除所有胶原酶。</li>
</ol>
5. 成熟脂肪细胞的收集
<ol>
	<li>打开喷嘴，将纯化后的成熟脂肪细胞悬液收集到50 mL离心管中。</li>
	<li>以50 × g 离心3分钟，轻轻沉淀成熟脂肪细胞。</li>
	<li>使用18 G针头和注射器移除脂肪细胞悬液下方残留的洗涤缓冲液。</li>
	<li>用移液器去除漂浮在成熟脂肪细胞上层的游离脂质层（即在分离过程中部分脂肪细胞破裂释放出的少量油脂）。 
	注意：为降低步骤6.5中脂肪细胞从膜上滴落的风险，当将成熟脂肪细胞接种到膜上时，必须彻底去除脂质层及所有洗涤缓冲液。因此，建议将脂肪细胞分3管收集。最后收集的样品通常含有较多残留脂质，质量相对较低；但通过小心地移液操作，这些样品仍可使用。</li>
</ol>
6. 成熟脂肪细胞的接种
<ol>
	<li>打开含有通透性膜插件的包装（材料表），取出膜组件。将其倒置并放置在无菌表面上，使膜面朝上。</li>
	<li>用移液器将30 µL密集的成熟脂肪细胞滴加到每张膜上（图1C）。避免枪头接触膜表面。接种细胞时使用宽口移液器吸头，或用剪刀剪去吸头尖端一小段以增大口径。</li>
	<li>在整个接种过程中，轻柔地反复倒置装有密集脂肪细胞的50 mL离心管，以确保不同大小的脂肪细胞均匀分布。</li>
	<li>将预装培养基的多孔板从培养箱中取出，移入生物安全柜中，并打开盖子。拿起已接种脂肪细胞的膜插件，从底部捏住，以便在步骤6.5中进行倒置操作。</li>
	<li>连贯地将带有脂肪细胞的膜插件整体翻转，使接种的脂肪细胞朝下（图1D），然后将插有膜的板缓慢放入含有培养基的孔中（图1E）。</li>
	<li>盖上板盖，小心地将板转移至组织培养箱中。避免快速移动板，因为脂肪细胞在初期容易脱落。 
	注意：细胞需要数天时间才能更牢固地附着于膜上。</li>
</ol>
7. 脂肪细胞的维持及用于分析的收获
<ol>
	<li>至少每7天更换一次培养基。通过每个膜插件上的切口孔进行培养基的移除和添加。移除培养基时，可使用注射器和针头、抽吸管或带有P200吸头的移液器。添加培养基时，使用移液器沿孔壁缓慢加入新鲜培养基，以避免扰动脂肪细胞。 
	注意：脂肪细胞已培养2周，期间在第7天更换一次培养基。然而，不同来源的脂肪组织或不同的实验需求可能需要更频繁地更换培养基。</li>
	<li>如需收获RNA，按步骤7.1所述移除培养基，然后直接向孔中加入500 µL裂解缓冲液（材料表），以裂解细胞。如需固定细胞用于成像，直接向孔中加入甲醛，使其终浓度为1%。 
	注意：处理后的细胞可在4 °C下保存。</li>
</ol>

<ol><li>Guilherme, A., Virbasius, J. V., Puri, V., Czech, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocyte+dysfunctions+linking+obesity+to+insulin+resistance+and+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Adipocyte dysfunctions linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (5), 367-377 (2008).</li>
<li>Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+we+talk+about+when+we+talk+about+fat%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">What we talk about when we talk about fat.</a> Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).</li>
<li>Lotta, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+genomic+analysis+implicates+limited+peripheral+adipose+storage+capacity+in+the+pathogenesis+of+human+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Integrative genomic analysis implicates limited peripheral adipose storage capacity in the pathogenesis of human insulin resistance.</a> Nature Genetics. 49 (1), 17-26 (2017).</li>
<li>Gustafson, B., Hedjazifar, S., Gogg, S., Hammarstedt, A., Smith, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+resistance+and+impaired+adipogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Insulin resistance and impaired adipogenesis.</a> Trends in Endocrinology and Metabolism. 26 (4), 193-200 (2015).</li>
<li>Gesta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+human+adipose+tissue+explants+leads+to+profound+alteration+of+adipocyte+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Hormone+and+Metabolic+Research%22%5BJournal%5D)">Culture of human adipose tissue explants leads to profound alteration of adipocyte gene expression.</a> Hormone and Metabolic Research. 35 (3), 158-163 (2003).</li>
<li>Fain, J. N., Cheema, P., Madan, A. K., Tichansky, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dexamethasone+and+the+inflammatory+response+in+explants+of+human+omental+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Dexamethasone and the inflammatory response in explants of human omental adipose tissue.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 315 (1-2), 292-298 (2010).</li>
<li>Lessard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+dedifferentiating+human+mature+adipocytes+from+the+visceral+and+subcutaneous+fat+compartments%3A+fibroblast-activation+protein+alpha+and+dipeptidyl+peptidase+4+as+major+components+of+matrix+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Characterization of dedifferentiating human mature adipocytes from the visceral and subcutaneous fat compartments: fibroblast-activation protein alpha and dipeptidyl peptidase 4 as major components of matrix remodeling.</a> PLoS One. 10 (3), e0122065(2015).</li>
<li>Asada, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ceiling+culture-derived+proliferative+adipocytes+retain+high+adipogenic+potential+suitable+for+use+as+a+vehicle+for+gene+transduction+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Ceiling culture-derived proliferative adipocytes retain high adipogenic potential suitable for use as a vehicle for gene transduction therapy.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 301 (1), C181-C185 (2011).</li>
<li>Shen, J. F., Sugawara, A., Yamashita, J., Ogura, H., Sato, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dedifferentiated+fat+cells%3A+an+alternative+source+of+adult+multipotent+cells+from+the+adipose+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Oral+Science%22%5BJournal%5D)">Dedifferentiated fat cells: an alternative source of adult multipotent cells from the adipose tissues.</a> International Journal of Oral Science. 3 (3), 117-124 (2011).</li>
<li>Harms, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mature+Human+White+Adipocytes+Cultured+under+Membranes+Maintain+Identity%2C+Function%2C+and+Can+Transdifferentiate+into+Brown-like+Adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Mature Human White Adipocytes Cultured under Membranes Maintain Identity, Function, and Can Transdifferentiate into Brown-like Adipocytes.</a> Cell Reports. 27 (1), 213-225 (2019).</li>
<li>Wang, Q. A., Scherer, P. E., Gupta, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+methodologies+for+the+study+of+adipose+biology%3A+insights+gained+and+opportunities+ahead%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Improved methodologies for the study of adipose biology: insights gained and opportunities ahead.</a> Journal of Lipid Research. 55 (4), 605-624 (2014).</li>
<li>Gregoire, F. M., Smas, C. M., Sul, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+adipocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Understanding adipocyte differentiation.</a> Physiological Reviews. 78 (3), 783-809 (1998).</li>
<li>Ruiz-Ojeda, F. J., Ruperez, A. I., Gomez-Llorente, C., Gil, A., Aguilera, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Models+and+Their+Application+for+Studying+Adipogenic+Differentiation+in+Relation+to+Obesity%3A+A+Review%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cell Models and Their Application for Studying Adipogenic Differentiation in Relation to Obesity: A Review.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (7), 1040(2016).</li>
<li>McBeath, R., Pirone, D. M., Nelson, C. M., Bhadriraju, K., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+shape%2C+cytoskeletal+tension%2C+and+RhoA+regulate+stem+cell+lineage+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Cell shape, cytoskeletal tension, and RhoA regulate stem cell lineage commitment.</a> Developmental Cell. 6 (4), 483-495 (2004).</li>
<li>Lackey, D. E., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+metabolism+by+the+innate+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Regulation of metabolism by the innate immune system.</a> Nature Reviews Endocrinology. 12 (1), 15-28 (2016).</li>
<li>Saltiel, A. R., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+mechanisms+linking+obesity+and+metabolic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Inflammatory mechanisms linking obesity and metabolic disease.</a> The Journal of clinical investigation. 127 (1), 1-4 (2017).</li>
<li>Lee, Y. S., Wollam, J., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Integrated+View+of+Immunometabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An Integrated View of Immunometabolism.</a> Cell. 172 (1-2), 22-40 (2018).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

膜培养成熟脂肪细胞聚集体（MAAC）是一种用于长期培养 freshly isolated 成熟脂肪细胞的新方法。在建立 MAAC 的过程中，实验方案中有几个关键步骤会显著影响成熟脂肪细胞的得率、质量和存活率。在第 3.2 步中应充分重视脂肪组织的剪碎操作，因为该步骤直接影响脂肪细胞暴露于胶原酶的时间。如果脂肪组织块过大，则需要延长消化时间，从而对细胞存活率产生不利影响；相反，如果使用剪刀将组织处理得过于细碎，也可能影响细胞存活率。为了成功进行成熟脂肪细胞的 MAAC 培养，应特别关注以下步骤：为了使脂肪细胞成功接种到膜上，第 5.3 和 5.4 步中必须彻底去除成熟脂肪细胞中的游离脂质和残留洗涤缓冲液。残留的脂质或洗涤缓冲液会降低脂肪细胞的表面张力，增加膜翻转时脂肪细胞从膜上滴落的风险。当脂肪细胞接种并处于培养基中时，细胞主要依靠浮力与膜保持接触，因此在更换培养基时建议采用缓慢而轻柔的操作手法，以避免细胞丢失。更换培养基时，应如第 7.1 步所述从孔底部移除旧培养基，并通过缓慢沿孔壁加样的方式加入新培养基。最后，一个节省时间的建议是在开始脂肪细胞分离前预先准备好含培养基和处理试剂的培养板。特别是对于复杂的实验设计，提前准备培养板可节省大量时间，并确保脂肪细胞在分离后能立即被置于含有相应处理条件的培养基中。
与使用前脂肪细胞分化相比，采用MAAC的一个优势在于所用的MAAC培养基成分非常简单，无需添加非生理性的激素混合物。在此，我们使用富含葡萄糖的培养基（DMEM/F12）、10% FBS、1% 青霉素/链霉素和20 nM胰岛素培养MAAC。重要的是，我们发现胰岛素对于罗格列酮/吡格列酮诱导的UCP110表达是绝对必需的。然而，维持细胞的脂肪生成表型并不需要胰岛素。因此，是否添加胰岛素应根据具体的实验问题来决定。
上述方案已针对人脂肪细胞的分离与培养进行了优化。然而，小鼠及其他生物的脂肪细胞也可作为MAAC进行培养。若需将小鼠脂肪细胞作为MAAC培养，则需额外注意若干事项与预防措施。我们发现，小鼠的成熟脂肪细胞比人类的更为脆弱。因此，应将消化时间缩短至最低限度，以提高细胞活力。我们还发现，来自年轻小鼠（8周龄及以下）的脂肪细胞可获得最稳定且可重复性最佳的结果。最后，小鼠MAAC最多可培养一周时间，但由于其脂肪细胞表型的稳定性似乎低于人类（人类MAAC至少可培养两周），我们建议根据实验需求，将小鼠MAAC的培养时间控制在满足实验目的所需的最短时间。
由于MAAC模型基于使用可渗透膜，该技术的一个优势是能够将成熟脂肪细胞与其他细胞类型进行共培养。我们此前已通过使用MAAC证明了成熟脂肪细胞与巨噬细胞之间可通过该系统进行相互通讯10。这为进一步探索肥胖、胰岛素抵抗与免疫反应之间的关联提供了可能15,16,17。未来的实验可引入其他细胞类型，如肝细胞、前脂肪细胞、内皮细胞或胰腺细胞，以进一步提升MAAC模型的复杂性和转化应用价值，并研究多种细胞类型之间的相互作用。
尽管MAAC在维持脂肪细胞功能和特性方面已显示出优于其他体外脂肪细胞模型的优势，但它也存在一些需要考虑的局限性。与使用前体细胞分化而来的脂肪细胞相比，MAAC模型更为繁琐且耗时较长。带有膜的培养板也比常规细胞培养板更昂贵。重要的是，成熟脂肪细胞每次接种时都需要新鲜分离，无法像前体细胞那样进行扩增或冻存建立细胞库。因此，该方法需要能够获取新鲜的白色脂肪组织样本，同时也因供体之间的个体差异而增加了实验的复杂性。
本文介绍了一种分离人成熟脂肪细胞并建立脂肪细胞球体培养体系（MAAC）的详细实验方案。我们证明了以MAAC形式培养的脂肪细胞在两周内仍保持活性，其脂肪细胞特异性基因表达特征得以维持，并且能够对多种药理学激动剂产生响应。利用MAAC体系可研究脂肪细胞与其他细胞类型之间的相互作用，并评估成熟脂肪细胞在不同刺激条件下发生的长期表型变化。

全球肥胖症及其相关共病的增加迫切需要开发新的治疗方法。白色脂肪组织（WAT）是全身代谢和能量稳态的重要调节者，在胰岛素抵抗和2型糖尿病（T2D）的发生中起核心作用1,2。在长期摄入过多热量的情况下，脂肪细胞会增大以容纳过剩的能量。然而，脂肪细胞的脂质储存能力可能被超过，导致循环中游离脂肪酸水平升高，并增加外周非脂肪组织中的脂质沉积，从而引发脂毒性3,4。
缺乏具有高转化相关性的脂肪细胞体外模型，是开发肥胖症和2型糖尿病（T2D）新疗法面临的关键挑战。离体组织外植模型（ex vivo explant model）通过培养小块脂肪组织实现，但该模型会因缺氧和炎症引发脂肪生成相关基因表达的快速改变5,6。顶壁培养（ceiling cultures, CCs）中，成熟脂肪细胞漂浮并附着于充满培养基的培养瓶顶部，但会迅速去分化为类似成纤维细胞、不含脂质的细胞7,8,9,10。目前最常用的模型是将已定向分化的前体细胞在体外诱导分化为脂肪细胞，然而这些分化后的细胞在形态上与体内成熟的脂肪细胞存在明显差异，表现为体积显著较小且缺乏单房性脂滴。该模型的其他局限性还包括需要使用非生理性的化学诱导剂组合来驱动分化，以及分化效率存在变异性，后者可受多种因素影响11,12,13,14。
我们近期开发了膜式成熟脂肪细胞聚集体培养（MAAC）技术，该方法可用于长期培养 freshly isolated 的成熟脂肪细胞，其中脂肪细胞在可渗透膜下进行培养10。对RNA测序数据的无偏分析显示，与脂肪组织外植体和体外分化的脂肪细胞相比，MAAC中的脂肪细胞最接近于 freshly isolated 的成熟脂肪细胞。MAAC可用于培养来源于皮下和内脏脂肪组织的成熟脂肪细胞，也可用于培养来自肥胖和瘦削个体的脂肪细胞。该方法能够研究脂肪细胞的长期表型变化，并支持脂肪细胞与其他细胞类型的共培养。本文中，我们提供了从人脂肪组织中分离成熟脂肪细胞以及建立MAAC系统的详细实验方案。

&#160; &#160;

<table><tbody><tr><td>经高压灭菌的剪刀</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>经高压灭菌的勺子</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>经高压灭菌的镊子</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6003</td><td></td></tr><tr><td>Buffer RLT</td><td>QIAGEN</td><td>79216</td><td>裂解缓冲液</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;*2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 锥形管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Gibco</td><td>31331-028</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>滤瓶，0.2 &amp;micro;m 孔径，75 mm</td><td>Thermo Scientific</td><td>156-4020</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>滤瓶，0.2 &amp;micro;m 孔径，75 mm</td><td>Thermo Scientific</td><td>158-0020</td><td>1000 mL</td></tr><tr><td>HBSS+CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;+MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Gibco</td><td>14065-49</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 缓冲液（1 M）</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>高容量 cDNA 反转录试剂盒</td><td>Applied Biosystems</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素（Actrapid Penfill）</td><td>Novo Nordisk A/S</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>104936</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Merck</td><td>104873</td><td></td></tr><tr><td>Medium 199</td><td>Gibco</td><td>10012-011</td><td></td></tr><tr><td>筛网滤器（250 &amp;micro;m）</td><td>Sintab AB</td><td>6111-025043</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;*7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1880</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>针头，18 G，1.20 mm × 40 mm</td><td>Sterican</td><td>613-2948</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（Pen/Strep）</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>培养皿，150 mm × 21 mm</td><td>Thermo Scientific</td><td>168381</td><td></td></tr><tr><td>Power SYBR Green PCR 主混合液</td><td>Applied Biosystems</td><td>4367659</td><td></td></tr><tr><td>Quantstudio 7 Flex 实时荧光定量 PCR 仪</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini 试剂盒</td><td>QIAGEN</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>分液漏斗</td><td>VWR</td><td>527-0008</td><td>用于大规模制备</td></tr><tr><td>分液漏斗</td><td>VWR</td><td>527-0005</td><td>用于小规模制备</td></tr><tr><td>摇床培养箱（37 &amp;deg;C）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>注射器，5 mL</td><td>Omnifix</td><td>612-2892</td><td>100 支</td></tr><tr><td>细胞培养箱（37 &amp;deg;C，5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transwell 小室，24 孔（6.5 mm）</td><td>Costar</td><td>3397</td><td>可渗透膜插件</td></tr><tr><td>TRIzol 试剂</td><td>Invitrogen</td><td>10296010</td><td>裂解缓冲液</td></tr><tr><td>II 型胶原酶</td><td>Worthington</td><td>LS004177</td><td></td></tr></tbody></table>

利用膜成熟脂肪细胞聚集体培养法（maac）分离与培养人成熟脂肪细胞

Isolation and Culture of Human Mature Adipocytes Using Membrane Mature Adipocyte Aggregate Cultures (MAAC)

白色脂肪组织（WAT）功能失调在胰岛素抵抗和2型糖尿病（T2D）的发生发展中起核心作用。为了开发针对T2D的新疗法，需要建立更具生理相关性的体外脂肪细胞模型。本研究介绍了一种分离和培养成熟人脂肪细胞的新技术，称为MAAC（膜状成熟脂肪细胞聚集体培养）。与其他体外脂肪细胞模型相比，MAAC的脂肪生成相关基因表达谱最接近新分离的成熟脂肪细胞。利用MAAC技术，可从瘦型和肥胖患者、不同脂肪组织库中培养脂肪细胞，还可实现与不同类型细胞的共培养，并且重要的是，脂肪细胞可在培养体系中维持长达2周。此外，可在MAAC上开展多种功能性实验，包括葡萄糖摄取、脂质生成和脂解作用。MAAC对多种药理学激动剂具有显著响应，还可用于研究脂肪细胞的表型变化，包括白色脂肪细胞向类棕色脂肪细胞的转分化过程。

将成熟脂肪细胞以MAAC形式进行培养，可维持其功能和表型，并可用于研究脂肪细胞对各种药物处理的反应。从皮下脂肪组织分离的MAAC在培养1周后仍保持成熟脂肪细胞特有的单房性脂滴结构（图2A）。在为期1周的培养过程中，分别使用PPARγ激动剂罗格列酮（Rosi）和吡格列酮（Pio），或糖皮质激素受体（GR）激动剂地塞米松（Dex）处理MAAC，以评估不同核激素受体（NHR）激动剂是否可在MAAC中诱导其下游靶基因的预期变化。Rosi和Pio分别使PPARγ响应基因FABP4和LPL的表达水平上调4倍和2−3倍，而地塞米松则无显著影响（图2B）。类似地，地塞米松使GR靶基因APOD和FKBP5的表达分别显著上调13倍和55倍，而PPARγ激动剂则无明显作用。我们先前已证实， freshly isolated human mature white adipocytes 在MAAC培养体系中经Rosi处理后可转分化为类棕色脂肪样表型10。经Rosi或Pio处理7天后，棕色脂肪特异性基因UCP1的表达被强烈诱导，上调达44–65倍，同时棕色脂肪标志物PDK4的表达也增加12–18倍（图2C）。
<img alt="图1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60485/60485fig1a.jpg" /> 
图1：MAAC装置的示意图。（A）培养基的制备。（B）成熟脂肪细胞的分离与填充。（C）将成熟脂肪细胞接种到膜上。（D）在保持脂肪细胞附着的情况下翻转膜。（E）将膜放入培养基中并更换培养基。该图经 Harms 等人10 修改。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60485/60485fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60485/60485fig2a.jpg" /> 
图2：MAAC在培养一周后仍保持单房室形态，并对多种药理学激动剂产生响应。（A）培养一周后MAAC的代表性4倍和10倍明场图像。平均直径为100 µm、具有大单房室脂滴的脂肪细胞清晰可辨。（B）MAAC在经溶剂对照（Vehc）、罗格列酮（Rosi）、吡格列酮（Pio）或地塞米松（Dex）处理7天后，PPARγ靶基因和糖皮质激素受体（GR）靶基因的mRNA水平。Rosi、Pio和Dex的终浓度均为10 µM。（C）MAAC在经溶剂对照（Vehc）、罗格列酮（Rosi）、吡格列酮（Pio）或地塞米松（Dex）处理7天后，富集于棕色脂肪组织的基因mRNA水平。Rosi、Pio和Dex的终浓度均为10 µM。所有基因表达数据均以TATA结合蛋白（TBP）作为内参进行标准化。统计学分析采用单因素方差分析（one-way ANOVA）结合Tukey多重比较检验。（均值 ± 标准差，n = 3，*p &#60; 0.05；**p &#60; 0.01；***p &#60; 0.001）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60485/60485fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

&#160; &#160;

膜成熟脂肪细胞聚集体培养（MAAC）是一种培养成熟人脂肪细胞的新方法。本文详细介绍了如何从人脂肪组织中分离脂肪细胞，以及如何建立MAAC培养体系。

利用膜成熟脂肪细胞聚集体培养法（MAAC）分离与培养人成熟脂肪细胞

白色脂肪组织（WAT）功能失调在胰岛素抵抗和2型糖尿病（T2D）的发生发展中起着核心作用。为了开发新的治疗方法……

脂肪生物学领域的一个挑战是如何在体外培养中维持成熟脂肪细胞的活性。我们开发了一种新方法，可实现对经历显著变化的脂肪细胞进行长期研究。我们的脂肪细胞培养技术有助于研究细胞间的相互作用，并有望为糖尿病和肥胖症的新疗法开发提供帮助。必须仔细遵循实验方案，因为其中一些关键步骤会显著影响基因质量和成熟脂肪细胞的活性。例如，在接种前，务必确保已完全去除游离脂质和洗涤缓冲液，否则在倒置小室时脂肪细胞可能会脱落。收到人皮下脂肪组织样本后，应将组织置于无菌生物安全柜内的15厘米培养皿中。向培养皿中加入少量 Medium 199。用镊子夹住组织中的粗大纤维化血管，用闭合的剪刀尖端背面轻轻刮擦血管周围的脂肪组织，以释放脂肪细胞。待所有细胞收集完毕后，弃去大块的纤维化组织，称量修剪后的脂肪组织重量。为了进一步释放脂肪组织中的细胞，将10克脂肪组织转移至一个新的15厘米培养皿中，使用弯头剪刀小心地将脂肪切碎，直至形成均匀细腻的混合物，无明显脂肪块残留。当所有脂肪组织处理完毕后，用勺子将10毫升切碎的组织分别转移至各个50毫升离心管中，并向每管加入30毫升消化缓冲液。随后将离心管置于37摄氏度、150转/分钟的摇床培养箱中，孵育30至35分钟。当脂肪组织消化液呈均一的杏色且无大块组织残留时，表明消化完成。消化结束后，将消化后的脂肪溶液倾倒入置于无菌1升锥形瓶上的250微米孔径滤网漏斗中。当全部脂肪细胞悬液滤过后，轻轻挤压滤网以提高脂肪细胞回收率，并用50至100毫升洗涤缓冲液冲洗滤网，随后再次轻轻挤压滤网。将分离的脂肪细胞悬液转移至分液漏斗中，并加入洗涤缓冲液直至漏斗几乎完全充满。轻轻倒置漏斗数次，使脂肪细胞悬液与缓冲液充分混匀，然后静置两到三分钟，直至液体分层清晰可见。待液体分层后，打开漏斗的活塞，缓慢将下层溶液排出至无菌烧瓶中。当完全去除胶原酶后，将纯化的成熟脂肪细胞溶液收集至50毫升锥形管中，并通过离心轻轻沉淀细胞。随后，使用配有18号针头的10毫升注射器移除成熟脂肪细胞悬液下方残留的洗涤缓冲液，并用移液器去除漂浮在成熟脂肪细胞上方的游离脂质层。接种成熟脂肪细胞时，将可渗透膜插件组件倒置放在无菌表面上，轻轻反复倒置装有沉淀细胞的离心管数次，以确保细胞分布均匀。使用宽孔移液器吸头，将30微升浓缩的成熟脂肪细胞加入每个膜上。以平稳的动作将插入板倒置，使接种的脂肪细胞位于插入物的底部。将插入板放入24孔板中，每孔加入500至1,000微升37摄氏度的完全培养基。然后，盖上培养板，并小心地将培养板放入组织培养箱中。每培养七天，通过每个插入物上的切口孔更换培养基。培养一周后，从皮下脂肪组织中分离出的成熟脂肪细胞聚集体仍保持成熟脂肪细胞特有的单房性脂滴形态。使用PPAR-GAMMA激动剂吡格列酮和罗格列酮处理可显著增加PPAR-GAMMA响应基因的表达，而使用糖皮质激素受体激动剂地塞米松处理则对这些基因无影响。类似地，糖皮质激素受体激动剂可强烈诱导糖皮质激素受体靶基因的表达，而PPAR-GAMMA激动剂对这些基因无显著作用。此外，经PPAR-GAMMA激动剂连续处理七天可显著诱导棕色脂肪特异性基因UCP1的基因表达。我们的新型脂肪细胞体外模型可用于成熟脂肪细胞的功能研究，包括葡萄糖摄取、脂质生成和脂解作用。通过这种新的脂肪细胞培养技术，我们已能够证明人成熟的白色脂肪细胞可转分化为类棕色脂肪细胞。

isolation-culture-human-mature-adipocytes-using-membrane-mature

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

利用膜成熟腺细胞聚合培养（MAAC）的人类成熟腺细胞的分离与培养

本视频展示了一种从小鼠主动脉弓周围脂肪组织中分离和培养荧光标记的神经嵴来源脂肪干细胞（ADSCs）的技术。分离后，通过荧光激活细胞分选技术检测并分选NCADSCs，随后将其接种于培养板中进行培养，以促进细胞增殖。...

从小鼠主动脉周围脂肪组织中分离脂肪来源的干细胞

成熟的脂肪细胞可能通过去分化成为干细胞的丰富来源，从而产生一群均一的成纤维细胞样细胞。使用胶原酶消化法从人体脂肪中分离成熟的脂肪细胞。本实验方案的目标是从人成熟脂肪细胞中获得具有多向分化潜能的去分化脂肪细胞。...

通过成熟脂肪细胞在顶壁培养中的去分化生成人类脂肪源性干细胞

本文报道了一种利用磁性激活细胞分选（MCS）从血管周围脂肪组织（PVAT）中分离脂肪细胞前体细胞（APC）群体的方法。与荧光激活细胞分选（FACS）相比，该方法可显著提高每克脂肪组织中APC的分离效率。...

通过磁性激活细胞分选法分离的血管周围脂肪组织中脂肪细胞前体的扩增与脂肪生成诱导

目前，白色脂肪组织（WAT）的主要原代培养模型存在关键缺陷，阻碍了药物开发和代谢研究的进展。本文介绍了一种通过将WAT夹在间充质细胞层之间来构建脂肪组织微生理系统的方法。该结构为WAT的原代培养提供了一个稳定且可调节的平台。...

一种用于人体脂肪的微生理平台：夹心式白色脂肪组织

我们描述了一种三维人细胞外基质-脂肪细胞体外培养系统，该系统可用于解析基质和脂肪细胞在脂肪组织代谢表型形成中的作用。...

一种用于研究基质-细胞代谢串扰的人源三维细胞外基质-脂肪细胞共培养模型

我们介绍一种简单的方法，利用荧光激活细胞分选技术从小鼠附睾脂肪垫中分离出高活力的脂肪前体细胞。...

从小鼠附睾脂肪组织中分离脂肪前体细胞

本方案描述了从小鼠皮下脂肪中分离前脂肪细胞、将其分化为成熟脂肪细胞以及诱导胰岛素抵抗的方法。通过蛋白质印迹法检测胰岛素信号通路中相关蛋白的磷酸化/活化水平，以评估胰岛素作用。该方法可直接测定原代脂肪细胞中的胰岛素抵抗/敏感性。...

原代培养中分化的鼠脂肪细胞：胰岛素抵抗模型

本文介绍了一种从人皮下脂肪组织中分离、培养和表型鉴定微血管内皮细胞（hSATMVECs）的实验方案。此外，还描述了一种hSATMVECs与脂肪细胞相互作用的实验模型。...

研究人类皮下脂肪组织中脂肪内皮细胞与脂肪细胞的相互作用

成熟脂肪细胞的尺寸和脆弱性限制了可用于其研究和分离的技术与工具。本文介绍了一种分离成熟小鼠脂肪细胞的方案，该方案可轻松适用于不同的脂肪组织库和小鼠饮食模型。...

从瘦型与肥胖型小鼠中分离和培养原代小鼠脂肪细胞

本文描述了一种胚胎大鼠脑组织聚集体培养体系的实验方案。聚集体中的多能前体细胞可发育并分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。...

大鼠脑组织聚集体培养物的制备用于神经元与胶质细胞发育研究

学习利用膜成熟腺细胞聚合培养（MAAC）技术分离和培养人类成熟脂肪细胞的方法，用于研究糖尿病和肥胖相关的细胞相互作用及代谢功能。该技术支持长期培养并可用于探究葡萄糖摄取、脂质生成等关键生物学过程。

利用膜成熟脂肪细胞聚集体培养法（MAAC）分离与培养人成熟脂肪细胞

探索更多视频