Name: 用于研究基质细胞代谢串扰的人类3D细胞外基质-脂肪培养模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: 了解人类三维细胞外基质-脂肪培养模型，用于研究基质细胞代谢串扰。该技术可在无经典诱导剂条件下促进脂肪生成，为糖尿病相关脂肪组织稳态研究提供新工具。

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我们感谢 Danielle Berger、Marilyn Woodruff、Simone Correa 和 Retha Geiss 在研究协调方面提供的协助。扫描电子显微镜（SEM）由密歇根大学显微技术平台完成。 &amp;#38; 图像分析实验室生物医学研究核心设施。本项目获得以下资助：NIH 基金 R01DK097449（RWO）、R01DK115190（RWO, CNL）、R01DK090262（CNL）、退伍军人事务部杰出奖 I01CX001811（RWO）、密歇根糖尿病研究中心试点与可行性基金（NIH 基金 P30-DK020572）（RWO）、退伍军人事务部 VISN 10 SPARK 试点基金（RWO）。扫描电子显微镜实验由密歇根大学显微技术中心完成。 &amp;#38; 图像分析实验室 生物医学研究核心设施。本文的图4最初发表于Baker等人的研究中， J Clin Endo Metab 2017年；3月1日；102卷（3）：1032-1043。doi: 10.1210/jc.2016-2915，经牛津大学出版社许可转载[https://academic.oup.com/jcem/article/102/3/1032/2836329]。如需重复使用本材料，请访问 http://global.oup.com/academic/rights。

脂肪组织取自经机构审查委员会批准接受择期减重手术的人类受试者。
1. 前脂肪细胞的分离与培养试剂准备
<ol>
	<li>在1×磷酸盐缓冲液（PBS）中配制2%牛血清白蛋白（BSA）。过滤除菌后，于4 °C避光保存。 4 °C.</li>
	<li>制备II型胶原酶：将2 mg/mL的II型胶原酶溶于含2% BSA的1×PBS中。使用前立即配制。</li>
	<li>制备红细胞（RBC）裂解液：1.5 M NH₄Cl4Cl, 100 mM NaHCO₃3，去离子水（DI/H2O）。储存于 4 °C. 用去离子水将10倍浓缩的RBC裂解液稀释成1倍工作液2O 立即使用前</li>
	<li>配制生长培养基：在杜氏改良伊格尔培养基：营养混合物 F-12（DMEM/F12）中加入15%胎牛血清（FBS）和1%抗生素-抗真菌素溶液（ABAM）。过滤除菌后，于4℃保存 4 °C.</li>
	<li>制备前脂肪细胞冻存液：含10%二甲基亚砜、15%胎牛血清的DMEM/F12培养基。过滤除菌，保存于 4 °C.</li>
	<li>制备分化培养基：10 mg/L 转铁蛋白， 33 µM 生物素, 0.5 µM 人胰岛素溶液 17 µM D-泛酸半钙盐，100 nM 地塞米松，2 nM 3,3',5-三碘-L-甲状腺原氨酸钠盐（T3） 1 µM ciglitazone, 540 µM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX），DMEM/F12 培养基中含 1% ABAM。过滤除菌，保存于 4 °C.</li>
</ol>
2. 细胞外基质试剂的制备
<ol>
	<li>配制冷冻缓冲液：10 mM Tris碱，5 mM EDTA，1% ABAM，1%苯甲基磺酰氟（PMSF），溶于去离子H2O中。搅拌使EDTA充分溶解。用HCl或NaOH调节pH至8.0。4 °C保存，可保存最多3个月。</li>
	<li>配制酶解溶液#1：0.25%胰蛋白酶-EDTA中含1% ABAM。4 °C保存，可保存最多3个月。</li>
	<li>配制洗涤缓冲液：137 mM NaCl，2.68 mM KCl，7 mM Na2HPO4，1.5 mM KH2PO4，1% ABAM，1% PMSF，溶于灭菌去离子H2O中。搅拌至盐类完全溶解。用HCl或NaOH调节pH至8.0。4 °C保存，可保存最多3个月。</li>
	<li>配制酶解溶液#2：55 mM Na2HPO4，17 mM KH2PO4，4.9 mM MgSO4∙7H2O，1% ABAM，1% PMSF，溶于去离子H2O中。4 °C保存，可保存最多3个月。搅拌至盐类完全溶解。使用前立即加入来自猪胰腺的脂肪酶（type VI-S），终浓度为80 U/mL；来自牛胰腺的脱氧核糖核酸酶I（type II-S），终浓度为160 U/mL；以及来自牛胰腺的核糖核酸酶A（type III-A），终浓度为100 µg/mL。</li>
	<li>配制极性溶剂提取液：异丙醇中含1% ABAM和1% PMSF。 
	警告：异丙醇易燃；应存放于25 °C的易燃品柜中，并按易燃废弃物处理。</li>
	<li>配制70%乙醇溶液：去离子H2O中含70%乙醇、1% ABAM和1% PMSF。使用前再加入ABAM和PMSF。 
	警告：乙醇易燃；应存放于25 °C的易燃品柜中，并按易燃废弃物处理。</li>
	<li>配制保存液：1x PBS中含1% ABAM和1% PMSF。4 °C保存，可保存最多3个月。</li>
</ol>
3. 代谢表型试剂的制备
<ol>
	<li>葡萄糖摄取
	<ol>
		<li>制备血清饥饿培养基：DMEM/F12，1% ABAM。过滤除菌，于4°C保存 4 °C</li>
		<li>使用前立即用1×PBS配制200 nM人胰岛素溶液。</li>
		<li>制备200 nM人胰岛素、0.1 mM 2-脱氧-D-葡萄糖， 1 µCi/well 2-脱氧-D-葡萄糖，2-[1,2-3H(N)]-，置于1×PBS中，使用前立即配制。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>脂解作用
	<ol>
		<li>用 PBS 稀释异丙肾上腺素：配制 3 mM 储存液，再稀释至工作浓度 3 µM 用于检测。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>油红O染色
	<ol>
		<li>配制4%甲醛溶液于去离子水/2O. 室温保存。</li>
		<li>制备油红O工作液。将油红O溶液（ORO）用去离子水/超纯水稀释。2O 按 3:2 的比例（ORO:DI/H）2O)。使用前立即配制，经滤纸过滤。材料表).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 脂肪组织获取
注意：内脏脂肪组织（VAT）由外科医生在手术开始时从大网膜采集，并置于冰上运回实验室立即处理。处理所有人源组织和腐蚀性试剂时应采取通用预防措施，包括在层流罩内进行所有操作、穿戴完整的实验室安全防护装备，以及禁止针头回套。
<ol>
	<li>将5-10 g完整的VAT组织加入含有15-25 mL冻存缓冲液的50 mL锥形管中，确保完全浸没组织样本。样本于-80 °C保存，最长可保存1个月，直至进行脱细胞处理。</li>
	<li>另取一份新鲜的VAT样本用于前脂肪细胞的分离，具体操作见第5节。</li>
</ol>
5. 前脂肪细胞的分离
<ol>
	<li>将2 g完整的VAT组织放入含有20 mL II型胶原酶溶液的50 mL锥形管中。然后用无菌剪刀插入锥形管内，在管内充分剪切组织，直至完全剪成细浆状。将组织在胶原酶溶液中于37 °C、130 rpm的摇床上孵育60分钟。</li>
	<li>将消化后的液体通过折叠在新的50 mL锥形管管口的100 µm尼龙筛网过滤至新的锥形管中。此时的消化液应为黄橙色、中等黏稠度的液体，含有少量未消化的纤维组织残余细丝。筛网应截留较大的未消化组织块，这些组织块应丢弃。</li>
	<li>在270 × g条件下离心10分钟。吸除上清液，并用移液器将细胞沉淀重悬于2 mL 1×红细胞裂解液中。
	<ol>
		<li>在25 °C孵育1分钟，然后加入10 mL含15% FBS的DMEM/F12培养基。在270 × g条件下离心10分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>吸除上清液，并用移液器将细胞沉淀重悬于10 mL含15% FBS的DMEM/F12培养基中。用移液器将细胞悬液转移至100 mm培养皿中，在37 °C、5% CO2条件下培养，直至细胞融合度达到80–100%，通常需要2–6天。每2–3天更换一次培养基。</li>
	<li>消化并洗涤细胞。
	<ol>
		<li>用移液器吸除培养基，向贴壁细胞中加入4 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液。在37 °C孵育10分钟，期间轻轻摇动培养皿以促进细胞脱落。</li>
		<li>加入20 mL含15% FBS的DMEM/F12培养基，并用移液器将脱落的细胞重悬于该培养基中。然后转移至新的50 mL锥形管中，在270 × g条件下离心10分钟。</li>
		<li>吸除上清液并弃去。用1× PBS洗涤细胞沉淀一次，然后用移液器将其重悬于20 mL新鲜的含15% FBS的DMEM/F12培养基中。将细胞悬液转移至T-150培养瓶中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在37 °C、5% CO2条件下培养细胞。当细胞融合度达到80–100%时，每2–3天进行一次传代扩增，每瓶使用7 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA消化，由一瓶扩增至八瓶。 
	注：通常需要传代3–4次，此过程可实现适当的扩增并维持成脂潜能以及患者和脂肪库特异性的细胞代谢表型。前脂肪细胞传代超过4–5次会导致成脂潜能丧失。</li>
	<li>按照上述方法，每瓶使用7 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA消化8个培养瓶中的细胞，在37 °C孵育10分钟。</li>
	<li>每瓶加入8 mL含15% FBS的DMEM/F12培养基，并用移液器将脱落的细胞重悬。将全部细胞悬液平均分装至三个50 mL锥形管中，在270 × g条件下离心10分钟。</li>
	<li>将所得细胞沉淀重悬于15 mL锥形管中的5 mL含15% FBS的DMEM/F12培养基中，使用细胞计数仪和台盼蓝进行细胞计数。</li>
	<li>在270 × g条件下离心细胞悬液10分钟。然后将细胞沉淀重悬于前脂肪细胞冻存液中，调整终浓度为1 × 106/mL，并按每管1 mL分装至1.5 mL冻存管中。</li>
	<li>将细胞冻存管在-80 °C保存1天，然后转移至液氮中长期保存3–6个月。</li>
	<li>使用时，将一支冻存管在37 °C水浴中解冻3–5分钟。将细胞重悬于20 mL含15% FBS的DMEM/F12培养基中，在270 × g条件下离心10分钟。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于20 mL含15% FBS的DMEM/F12培养基中，用移液器接种至一个T-150培养瓶中，在37 °C、5% CO2条件下培养2–3天，直至细胞融合度达到80%。</li>
	<li>按照步骤5.6所述方法，每瓶使用7 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA消化细胞。将细胞重悬于含15% FBS的DMEM/F12培养基中，浓度为每毫升300万个细胞（即每20 µL含6 × 104个细胞），并按以下方案使用（第7节，步骤7.4）。</li>
</ol>
6. 脂肪组织细胞外基质的制备
<ol>
	<li>第1天：冻融与酶消化 #1
	<ol>
		<li>将之前冷冻保存于冻存缓冲液中的VAT样本（步骤4.2），从-80 °C转移至37 °C预热水浴中进行冻融，在水浴中轻轻周期性手动振荡并孵育20分钟。待完全解冻后，再次转移回-80 °C并孵育20分钟。重复冻融过程3次，最后一次以37 °C水浴解冻结束。</li>
		<li>使用无菌镊子将VAT样本转移至新的50 mL锥形管中，每管加入15–25 mL 酶解溶液 #1，确保VAT样本完全浸没，随后在摇床中（130 rpm，37 °C）孵育过夜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第2天：酶消化 #2
	<ol>
		<li>在摇床（130 rpm，37 °C）上用15–25 mL 冲洗缓冲液对样本洗涤3次，每次20分钟。每次洗涤后倾去冲洗缓冲液。</li>
		<li>将样本转移至新的50 mL锥形管中，每管加入15–25 mL 酶解溶液 #2，在摇床（130 rpm，37 °C）中孵育过夜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第3天：脱脂
	<ol>
		<li>在摇床（130 rpm，37 °C）上用15–25 mL 冲洗缓冲液对样本洗涤3次，每次20分钟。每次洗涤后倾去冲洗缓冲液。</li>
		<li>将样本转移至新的50 mL锥形管中，每管加入15–25 mL 极性溶剂提取液，在摇床（130 rpm，25 °C）中孵育过夜。此步骤后，大部分脂质应已被去除，样本颜色应呈白色或半透明。 
		注意：极性溶剂提取液易燃，应于25 °C下储存和使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第4天：洗涤与储存
	<ol>
		<li>将样本转移至新的50 mL锥形管中，每管加入15–25 mL 冲洗缓冲液。在摇床（130 rpm，37 °C）上洗涤3次，每次20分钟。</li>
		<li>在摇床（130 rpm，37 °C）上用15–25 mL 70%乙醇洗涤样本3次，每次20分钟，每次洗涤后倾去70%乙醇溶液。</li>
		<li>用储存液在摇床（130 rpm，37 °C）上洗涤样本一次，每次20分钟。</li>
		<li>使用无菌镊子将样本转移至新的50 mL锥形管中，每管加入15–25 mL 储存液，确保加入足量储存液以完全浸没样本。于4 °C保存，最长可保存1个月。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 细胞外基质-脂肪细胞制备
<ol>
	<li>将储存的细胞外基质（ECM）碎片用无菌镊子转移至24孔板的各个孔中。根据计划进行的下游实验（如葡萄糖摄取或脂解作用，见下文）所需，将相应数量的ECM碎片加入相应数量的孔中，包括重复孔（双复孔或三复孔）。用缓冲液洗涤 500 µL 70%乙醇在旋转摇床（130 rpm）上振荡洗涤3次 37 °C，每次洗涤20分钟。</li>
	<li>通过在轨道摇床（130 rpm）上用无菌 1x PBS 洗涤 3 次来重水化 ECM， 37 °C，每次洗涤20分钟。</li>
	<li>使用无菌剪刀将细胞外基质（ECM）切割并称重为100 mg的片段。用无菌镊子将一个100 mg的片段放入24孔板的每孔中。于37°C、5% CO₂培养箱中孵育。 25 °C 孵育15分钟，使过量PBS从组织碎片中渗出。用移液器小心吸除多余PBS。</li>
	<li>将每100 mg ECM碎片接种 20 µL 前脂肪细胞悬液（300万个细胞每毫升，6 x 104 每细胞 20 µL，加入步骤5.10中含15% FBS的DMEM/F12培养基）。将移液枪头插入基质胶（ECM）中，直接将细胞悬液轻柔地吹打至基质中心，注意避免细胞悬液溢出并流至孔板底部。
	<ol>
		<li>如果细胞悬液从移液管尖端所在位置的细胞外基质中溢出，应将尖端移开该位置，并插入细胞外基质的另一位置。将接种后的细胞外基质于37°C孵育40分钟 37 °C. 
		注意：用于qrtPCR的RNA提取时，每500 mg ECM碎片接种3 x 105 细胞中 100 µL （每毫升300万个细胞，即3 x 10⁶ cells/mL）5 细胞每 100 µL，置于含15%胎牛血清的DMEM/F12培养基中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向24孔板的每个孔中加入 500 µL 加入培养基以覆盖接种的细胞外基质（ECM）碎片。进行培养 37 °C 和5% CO2 72 小时。</li>
	<li>72 小时后，小心吸除 15% FBS-DMEM/F12 培养基，轻轻倾斜培养板使液体汇集于组织碎片下方，将移液器吸头置于细胞外基质（ECM）碎片旁侧，避免扰动碎片。吸除后，加入 500 µL 不同分化培养基，每2-3天更换一次培养基，采用类似技术，总培养时间为14天。
	<ol>
		<li>使用光学显微镜检查分化情况：细胞将积聚脂质，颜色变为棕黄色，形态更加呈球形。 
		注意：接种细胞的基质可用于代谢检测（如葡萄糖摄取实验、脂解实验、油红O染色）、组织学或免疫组织化学（IHC）以及常规组织成像。如需进行固定组织的油红O染色与成像，应将含细胞外基质-脂肪细胞的样品置于液氮中冷冻保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. 代谢表型分析
<ol>
	<li>扫描电子显微镜
	<ol>
		<li>在25 °C下，用2.5%戊二醛的Sorensen磷酸盐缓冲液固定样品12小时。随后在4 °C下，用1%四氧化锇的Sorensen磷酸盐缓冲液后固定1小时。</li>
		<li>用乙醇逐级脱水样品。用六甲基二硅氮烷洗涤，空气干燥。然后用胶体石墨将样品固定在扫描电子显微镜样品台上。干燥后，溅射镀金。</li>
		<li>使用扫描电子显微镜采集图像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>油红O染色
	<ol>
		<li>活体组织：油红O溶液
		<ol>
			<li>用移液器小心吸去孔板中的培养基。每孔用500 µL的1x PBS洗涤一次。</li>
			<li>在25 °C下，用200 µL的4%甲醛（溶于无菌去离子H2O）固定样品15分钟。用移液器吸去甲醛，再用1x PBS洗涤两次（每次500 µL）。</li>
			<li>在25 °C下，向样品中加入200 µL的60%异丙醇，作用5分钟。用移液器吸去60%异丙醇。</li>
			<li>在25 °C下，用油红O工作液染色5分钟。用移液器吸去油红O染液，再用1x PBS洗涤三次（每次500 µL）。然后用光学显微镜观察成像。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>固定组织：油红O染色试剂盒
		<ol>
			<li>将ECM-脂肪细胞样品在最佳切割温度（OCT）包埋剂中速冻，并在恒冷切片机上切片（5 µm）。</li>
			<li>将切片置于85%丙二醇的去离子/H2O溶液中2分钟。将切片置于60 °C的油红O染液中6分钟。将切片置于85%丙二醇的去离子/H2O溶液中1分钟。用去离子/H2O漂洗两次。</li>
			<li>将切片置于油红O染色试剂盒中的改良Mayer苏木精染液中1分钟。用自来水漂洗两次。再用去离子/H2O漂洗两次。</li>
			<li>使用水溶性封片介质封片，并在显微镜下成像。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>从ECM中提取RNA用于qrtPCR 
		注：为最大化RNA产量，建议在6孔板中每孔使用500 mg ECM片段接种3 x 105个前脂肪细胞，加入100 µL培养基，并按上述方法在每孔3 mL分化培养基中进行分化。
		<ol>
			<li>分化完成后，使用无菌镊子将每个独立的ECM-脂肪细胞样品转移至冰上的50 mL锥形管中。</li>
			<li>用500 µL RLT缓冲液洗涤空孔。将RLT缓冲液加入装有对应ECM-脂肪细胞样品的50 mL锥形管中。</li>
			<li>使用无菌剪刀，在保持锥形管置于冰上的同时，将每个ECM-脂肪细胞样品在50 mL锥形管内充分剪碎，将剪刀插入管中进行组织剪切。</li>
			<li>将锥形管在-80 °C至37 °C之间反复冻融3次。</li>
			<li>在4 °C下以500 x g离心10分钟。</li>
			<li>用移液器小心吸去上清液，并使用纤维组织RNA提取试剂盒（材料表）进行RNA提取。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>葡萄糖摄取实验
	<ol>
		<li>在24孔板中，将6 x 104个前脂肪细胞接种于100 mg ECM片段中，加入0.5 mL分化培养基，按上述方法（第5节）进行分化。</li>
		<li>分化14天后，吸去培养基，用1x PBS洗涤ECM-脂肪细胞一次。每孔加入0.5 mL无血清饥饿培养基，在37 °C、5% CO2条件下培养12小时。</li>
		<li>吸去培养基，用1x PBS洗涤细胞两次。每孔加入0.5 mL含2% BSA的PBS，在37 °C、5% CO2条件下培养2小时。</li>
		<li>用1x PBS洗涤细胞一次，每孔加入0.5 mL含或不含200 nM胰岛素的1x PBS，在37 °C下孵育40分钟。</li>
		<li>吸去1x PBS，每孔加入0.5 mL含0.1 mM 2-脱氧-D-葡萄糖、2 µCi/mL脱氧-D-葡萄糖、2-[1,2-3H(N)]，以及含或不含200 nM胰岛素的1x PBS，在37 °C、5% CO2条件下孵育40分钟。处理和处置所有放射性试剂及废弃物时，须遵守当地机构监管法规的标准安全操作规程。</li>
		<li>用移液器吸去培养基，用1x PBS洗涤细胞三次。每孔加入420 µL去离子/H2O中的1% SDS溶液，剧烈吹打裂解细胞。在25 °C下孵育10分钟。</li>
		<li>从每孔中取5 µL用于Bradford蛋白测定。将剩余细胞裂解液中的400 µL转移至含有2 mL闪烁液的闪烁瓶中。使用闪烁计数器测定3H-2DG活性。将数据以每分钟计数（cpm）归一化至蛋白浓度（mg/mL）进行分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>脂解实验
	<ol>
		<li>在24孔板中，将6 x 104个前脂肪细胞接种于100 mg ECM片段中，加入0.5 mL人源分化培养基，按上述方法（第5节）进行分化。</li>
		<li>分化14天后，吸去培养基，用温热的1x PBS洗涤细胞两次。每孔加入0.5 mL无胰岛素的无血清饥饿培养基，含或不含3 µM异丙肾上腺素，在37 °C、5% CO2条件下培养72小时。</li>
		<li>收集培养上清液，可于-80 °C保存至检测前。将ECM收集至微量离心管中，用于DNA定量，以便数据归一化。</li>
		<li>将每份上清液2 µL加入96孔微孔板中。预留空白孔（蒸馏H2O）及甘油标准品孔（来自甘油三酯测定试剂盒）。</li>
		<li>向每孔加入270 µL甘油三酯测定试剂盒中的游离甘油试剂，吹打混匀。在37 °C下孵育5分钟。</li>
		<li>使用微孔板分光光度计在540 nm处测定吸光度。</li>
		<li>计算甘油浓度，并以ECM中的DNA含量进行归一化：</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img src="/files/ftp_upload/60486/60486eq1.jpg" alt="甘油浓度计算公式；分光光度法中的吸光度公式示意图。" data-altupdatedat="1788282455000">

<ol><li>Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+matrix+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">The extracellular matrix at a glance.</a> Journal of Cell Science. 123, 4195-4200 (2010).</li>
<li>Berrier, A. L., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-matrix+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cell-matrix adhesion.</a> Journal of Cell Physiology. 213 (3), 565-573 (2007).</li>
<li>Trayhurn, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+and+adipose+tissue+function+and+dysfunction+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Hypoxia and adipose tissue function and dysfunction in obesity.</a> Physiology Reviews. 93 (1), 1-21 (2014).</li>
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</ol>

作者声明不存在利益冲突。

细胞外基质-脂肪细胞共培养模型为解析细胞外基质（ECM）与细胞在决定最终组织表型中的各自作用提供了有价值的工具。ECM分离方案具有较好的可重复性，但在去细胞化过程中可能观察到一定的变异性。第3天的脱脂步骤是该方案中的关键环节。在过夜提取结束时，脱脂是否成功可通过极性溶剂溶液变为黄色来判断，同时基质应从完整脂肪组织特有的黄橙色转变为半透明或白色（图1）。如果未出现上述颜色变化，则表明脱脂可能尚未完成。不同供体样本间脱脂效率存在常见差异，但迄今为止，我们未观察到脱脂效率与供体的糖尿病状态、年龄、体重指数（BMI）或其他临床变量之间存在相关性。过大的样本（大于20 g）将无法实现有效脱脂；处理小于&#60;20 g的样本可避免此问题。如果第3天后样本仍未完全脱脂，可用无菌剪刀将样本一分为二，然后转移至新鲜的15–20 mL极性溶剂提取液中，并置于旋转摇床上处理3–5小时。部分样本在重复极性溶剂提取步骤后仍可能无法完全去细胞化。若样本大部分区域已完成去细胞化，则可在实验使用前将残留脂质部分切除。
如果在整个操作过程中未能严格保持无...

细胞外基质（ECM）不仅为组织提供机械支架，还与 residing 于其中的细胞进行复杂的相互作用，调控维持组织稳态所必需的多种过程，包括细胞增殖、分化、信号传导和代谢1。尽管健康的细胞外基质在维持正常组织功能中起着关键作用，但功能异常的细胞外基质已被证实与多种疾病相关2。
脂肪组织在代谢性疾病的发病机制中起着重要作用。肥胖与脂肪细胞过度肥大、细胞缺氧、脂肪细胞代谢功能障碍以及脂肪组织内质网应激、氧化应激和炎症密切相关。尽管这些复杂的生物学过程尚未被充分阐明，但它们共同导致脂肪组织营养缓冲能力受损，进而引起营养物质从脂肪组织溢出，造成多种组织的毒性损伤以及全身性代谢紊乱3,4,5。目前对脂肪组织功能障碍所涉及的事件顺序和具体机制仍了解有限，但已有研究提示脂肪组织细胞外基质（ECM）的改变在其中发挥了作用。在人类和小鼠的肥胖状态下，脂肪组织中的ECM成分均发生改变，表现为ECM蛋白沉积增加，同时在生化性质和结构上出现定性差异，这些ECM的改变与人类代谢性疾病（包括2型糖尿病和高脂血症）相关6,7,8,9,10,11。
尽管有这些观察结果，脂肪组织细胞外基质（ECM）在介导脂肪组织功能障碍中的作用仍不明确。部分原因在于缺乏可行的实验模型，无法解析ECM与脂肪细胞在调控脂肪组织最终功能中的各自特定作用。ECM-脂肪细胞共培养至少在两个方面更接近模拟天然脂肪组织的体内环境。首先，ECM培养提供了与天然脂肪组织相似的分子环境，包含天然的胶原蛋白、弹性蛋白以及其他在标准二维培养中缺失的基质蛋白。其次，已有研究表明，在二维塑料表面培养会因塑料基底弹性降低而通过力学效应改变脂肪细胞的代谢12，而ECM培养则可消除这一影响。
通过脱细胞脂肪组织及其他组织分离细胞外基质（ECM）来构建生物支架的方法，已在再生医学、重建医学和组织工程领域得到研究13,14,15,16,17,18。我们此前已发表方法，将这些技术改进后用于建立人源ECM-脂肪细胞的体外三维共培养模型，所用ECM和脂肪前体细胞（前脂肪细胞）均来源于人内脏脂肪组织11。本文中，我们将详细描述这些方法。人脂肪组织的脱细胞过程为期四天，包括机械处理和酶解处理，以去除细胞和脂质，最终保留一种维持来源组织特性的生物支架。脱细胞后的ECM可支持人前脂肪细胞向脂肪细胞的分化；当重新接种脂肪细胞后，该支架能够维持完整脂肪组织的微结构、生化特性及疾病特异性特征，并表现出天然脂肪组织特有的代谢功能。该基质可单独研究，也可重新接种细胞，从而允许研究脂肪组织中细胞成分与细胞外成分之间的相互作用与信号交流。

<table><tbody><tr><td>0.25% 胰蛋白酶-EDTA</td><td>Gibco，赛默飞世尔科技公司，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆</td><td>货号#25200056</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 冻存管</td><td>Fisher Scientific，ThermoFisher Scientific Inc.，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆</td><td>货号#02-682-557</td><td></td></tr><tr><td>10% 中性缓冲福尔马林</td><td>VWR International LLC.，美国宾夕法尼亚州拉德诺</td><td>货号 89370-094</td><td></td></tr><tr><td>100 &amp;micro;m 尼龙网滤器</td><td>康宁股份有限公司，美国纽约州康宁市</td><td>Cat#352360</td><td></td></tr><tr><td>2-脱氧-D-葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.，美国密苏里州圣路易斯</td><td>货号 D8375</td><td></td></tr><tr><td>2 nM 3,3&amp;rsquo;三碘甲状腺原氨酸钠盐（T3）</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. 美国密苏里州圣路易斯市</td><td>货号 T6397</td><td></td></tr><tr><td>24孔组织培养板</td><td>VWR International LLC.，美国宾夕法尼亚州拉德诺</td><td>货号#10861-700</td><td></td></tr><tr><td>3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. 美国密苏里州圣路易斯</td><td>货号#I5879</td><td></td></tr><tr><td>96孔组织培养板</td><td>VWR International LLC.，美国宾夕法尼亚州拉德诺</td><td>货号#10861-666</td><td></td></tr><tr><td>抗生素-抗真菌素溶液（ABAM）</td><td>Gibco，赛默飞世尔科技公司，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆</td><td>货号#15240062</td><td></td></tr><tr><td>生物素</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. 美国密苏里州圣路易斯</td><td>货号 B4639</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.，美国密苏里州圣路易斯</td><td>货号#A8806</td><td></td></tr><tr><td>Buffer RLT</td><td>Qiagen，德国希尔登</td><td>货号#79216</td><td></td></tr><tr><td>Ciglitizone</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. 美国密苏里州圣路易斯</td><td>货号 C3974</td><td></td></tr><tr><td>2-[1,2-3H (N)]-脱氧-D-葡萄糖</td><td>PerkinElmer Inc.，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆</td><td>Cat#NET328A250UC</td><td></td></tr><tr><td>牛胰脱氧核糖核酸酶 I，II-S 型</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. 美国密苏里州圣路易斯</td><td>货号 D4513</td><td></td></tr><tr><td>地塞米松</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. 美国密苏里州圣路易斯</td><td>货号 D4902</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>Fisher Scientific，ThermoFisher Scientific Inc.，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆</td><td>货号#BP231</td><td>易燃，腐蚀性</td></tr><tr><td>EDTA二钠</td><td>Fisher Scientific，ThermoFisher Scientific Inc.，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆</td><td>Cat#BP118</td><td></td></tr><tr><td>D-泛酸半钙盐</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. 美国密苏里州圣路易斯</td><td>货号#21210</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科&amp;rsquo;s 改良伊格尔培养基：营养混合物 F-12（DMEM/F12）</td><td>Gibco，赛默飞世尔科技公司，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆</td><td>货号#11320033</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Decon Labs, Inc.，宾夕法尼亚州普鲁士王市，美国</td><td>货号#DSP-MD.43</td><td>易燃</td></tr><tr><td>EVE细胞计数板，NanoEnTek</td><td>VWR International LLC.，美国宾夕法尼亚州拉德诺</td><td>Cat#10027-446</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Gibco，赛默飞世尔科技公司，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆</td><td>货号#10437028</td><td></td></tr><tr><td>戊二醛</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.，美国密苏里州圣路易斯</td><td>货号 G5882</td><td>腐蚀性</td></tr><tr><td>六甲基二硅氮烷</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. 美国密苏里州圣路易斯</td><td>货号#440191</td><td>易燃，腐蚀性</td></tr><tr><td>人胰岛素溶液</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. 美国密苏里州圣路易斯</td><td>货号#I9278</td><td></td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>Fisher Scientific，ThermoFisher Scientific Inc.，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆</td><td>货号#A415</td><td>易燃</td></tr><tr><td>异丙肾上腺素</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.，美国密苏里州圣路易斯</td><td>货号 I5627</td><td>易燃</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. 美国密苏里州圣路易斯</td><td>货号#S25484</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. 美国密苏里州圣路易斯</td><td>货号 P5655</td><td></td></tr><tr><td>来自猪胰腺的脂肪酶，VI-S型</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. 美国密苏里州圣路易斯</td><td>货号 L0382</td><td></td></tr><tr><td>MgSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;*7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. 美国密苏里州圣路易斯</td><td>货号#230391</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. 美国密苏里州圣路易斯</td><td>货号 S5136</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. 美国密苏里州圣路易斯</td><td>货号 S3014</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO₃&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific，ThermoFisher Scientific Inc.，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆</td><td>货号#S233</td><td></td></tr><tr><td>NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Cl</td><td>Fisher Scientific，ThermoFisher Scientific Inc.，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆</td><td>货号#A661</td><td></td></tr><tr><td>最佳切割温度（OCT）包埋剂</td><td>Agar Scientific有限公司，英国埃塞克斯郡斯坦斯特德</td><td>货号 AGR1180</td><td></td></tr><tr><td>油红O溶液（ORO）</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.，美国密苏里州圣路易斯</td><td>货号 O1391</td><td></td></tr><tr><td>Oil Red-O 染色试剂盒</td><td>美国Master Tech科学公司，洛迪，加利福尼亚州，美国</td><td>货号#KTORO-G</td><td></td></tr><tr><td>四氧化锇</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. 美国密苏里州圣路易斯</td><td>货号#201030</td><td>腐蚀性</td></tr><tr><td>苯甲基磺酰氟（PMSF）</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. 美国密苏里州圣路易斯</td><td>货号#93482</td><td>腐蚀性</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Fisher Scientific，ThermoFisher Scientific Inc.，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆</td><td>货号#SH3025601</td><td></td></tr><tr><td>来自牛胰腺的核糖核酸酶A，III-A型</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. 美国密苏里州圣路易斯</td><td>货号 R5125</td><td></td></tr><tr><td>RNAEasy 纤维组织小型试剂盒</td><td>Qiagen，德国希尔登</td><td>货号#74704</td><td></td></tr><tr><td>闪烁液</td><td>Fisher Scientific，ThermoFisher Scientific Inc.，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆</td><td>货号#SX18</td><td></td></tr><tr><td>闪烁计数器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>剪刀、镊子、无菌</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorensen 磷酸盐缓冲液</td><td>Thomas Scientific, Inc.，美国新泽西州斯威兹伯勒</td><td>CAS #: 10049-21-5</td><td></td></tr><tr><td>T-150 培养瓶</td><td>VWR International LLC.，美国宾夕法尼亚州拉德诺</td><td>Cat#10062-864</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan 基因表达主混合液</td><td>赛默飞世尔科技公司，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆</td><td>货号#4369016</td><td></td></tr><tr><td>温度控制轨道摇床</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>组织匀浆机，BeadBug 微管匀浆机</td><td>Benchmark Scientific</td><td>货号#D1030</td><td></td></tr><tr><td>转铁蛋白</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. 美国密苏里州圣路易斯</td><td>货号 T3309</td><td></td></tr><tr><td>甘油三酯测定试剂盒</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.，美国密苏里州圣路易斯</td><td>货号#TR0100</td><td></td></tr><tr><td>0.4% 台盼蓝染色液</td><td>VWR International LLC.，美国宾夕法尼亚州拉德诺</td><td>货号 10027-446</td><td></td></tr><tr><td>II型胶原酶</td><td>Gibco，赛默飞世尔科技公司，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆</td><td>货号#17101015</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Reeve Angel 滤纸，201 级，150 毫米</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.，美国密苏里州圣路易斯</td><td>货号#WHA5201150</td><td></td></tr></tbody></table>

一种用于研究基质-细胞代谢串扰的人源三维细胞外基质-脂肪细胞共培养模型

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

细胞外基质（ECM）在调控组织稳态中发挥核心作用，通过与细胞相互对话，调节细胞功能的多个方面。在肥胖状态下，ECM在脂肪组织功能中具有尤为重要的作用，脂肪组织中ECM的沉积和成分改变与小鼠和人类的代谢性疾病相关。目前可用于解析ECM和细胞在决定整体组织表型中各自作用的可操作体外模型十分有限。本文介绍一种新型的人源ECM-脂肪细胞三维体外培养模型，可用于研究ECM和脂肪细胞在调控脂肪组织代谢表型中的特定作用。通过去细胞化人脂肪组织以分离ECM，随后将前脂肪细胞重新接种至ECM中，并在基质内分化为成熟脂肪细胞。该方法构建的ECM-脂肪细胞复合物具有代谢活性，并保留了其来源组织及供体个体的特征。我们已利用该系统证实了人脂肪组织中存在疾病特异性的ECM-脂肪细胞相互作用。该培养模型为解析ECM与脂肪细胞在整体脂肪组织代谢表型形成中的作用提供了工具，同时可用于研究ECM在调控脂肪组织稳态中的功能。

制备脂肪组织细胞外基质（ECM）、接种前脂肪细胞并在体外分化为成熟脂肪细胞，会导致组织发生明确的顺序性形态学变化，从而可在整个实验流程中通过肉眼评估各阶段进展（图1）。用于接种ECM的前脂肪细胞通过胶原酶消化从独立的内脏脂肪组织（VAT）样本中分离获得（图2）。在处理过程的各个阶段，对ECM-脂肪细胞构建物进行扫描电子显微镜观察，可显示ECM的去细胞化以及重新接种和分化后含脂滴脂肪细胞的重建（图3）。对去细胞化的ECM进行I型胶原特异性免疫组织化学染色，显示其胶原微结构得以保留；而对活体及固定/切片的三维ECM-脂肪细胞构建物进行油红O染色，则可显示含脂滴的脂肪细胞（图4A）。在ECM中分化的脂肪细胞进行qrtPCR分析，显示相对于在ECM中培养但未分化的前脂肪细胞，脂肪生成相关基因显著上调（<stro...

我们描述了一种三维人细胞外基质-脂肪细胞体外培养系统，该系统可用于解析基质和脂肪细胞在脂肪组织代谢表型形成中的作用。

细胞外基质（ECM）在调控组织稳态中发挥核心作用，通过与细胞进行双向通讯，调控细胞行为的多个方面……

本方案表明，细胞外基质（ECM）可在缺乏经典脂肪生成介质的情况下促进脂肪生成分化，并首次证明ECM对细胞代谢具有疾病特异性的调控作用。本技术为解析ECM与脂肪细胞在脂肪组织代谢中的作用提供了工具，可用于研究ECM在调节脂肪组织稳态中的功能。与标准的二维细胞培养相比，我们的三维模型能够更有效地检测和分析在2型糖尿病背景下脂肪细胞与脂肪组织ECM之间的相互作用。建议从小样本开始，以评估其细胞化程度。需要注意的是，不同患者来源的细胞生长情况以及组织脱细胞效果存在个体差异。在每一步骤前后观察组织状态非常重要，以确保组织正在有效脱细胞，并理解样本之间的潜在差异。从手术中获取内脏脂肪组织（VAT）后，将5-10克组织加入含有15-25毫升冻存缓冲液的50毫升锥形管中，以准备储存。确保样本完全浸没，并在-80摄氏度下保存，直至进行脱细胞处理。为分离前脂肪细胞，取2克新鲜的完整VAT样本置于20毫升II型胶原酶溶液中，然后将无菌剪刀插入管内，充分剪切组织。将组织切碎至细浆状后，置于胶原酶溶液中，在37摄氏度下于旋转摇床上孵育60分钟。孵育结束后，将消化产物经100微米尼龙滤网过滤至新的50毫升锥形管中。消化后的液体应呈黄橙色，具有中等黏度，并含有少量未消化组织的残余纤维。将样品在270 × g条件下离心10分钟，弃去上清液，用移液器将细胞沉淀重悬于2毫升1×红细胞裂解液中。在25摄氏度孵育1分钟，然后加入10毫升含15%胎牛血清的DMEM/F12培养基，再在270 × g条件下离心10分钟。为制备细胞外基质（ECM），将先前冷冻的VAT样品置于预热的水浴中，在37摄氏度下冻融20分钟，期间定期轻轻手动振荡。待组织完全解冻后，将其转移至-80摄氏度环境中冷冻20分钟，并重复冻融过程三次，最后一次以解冻结束。使用无菌镊子将VAT样本转移至一个新的50毫升锥形管中，管内含有15–25毫升酶解溶液1，确保样本完全浸没。随后在37摄氏度条件下振荡孵育过夜，转速为130转/分钟。第二天，用15–25毫升洗涤缓冲液将样品清洗三次，每次清洗后倾去溶液。将样品转移至新的50毫升离心管中，加入15–25毫升酶解溶液2，过夜孵育。再次用洗涤缓冲液清洗样品，然后将其转移至含有15–25毫升极性溶剂提取液的新离心管中。将样品在振荡条件下孵育过夜。在与极性溶剂溶液孵育后，重要的是检查样品中脂质的去除情况。如果大部分脂质未被去除，则可能需要重复此步骤。可使用较短的孵育时间。孵育结束后，将样品转移至含有15–25毫升洗涤缓冲液的新鲜离心管中，在摇床上洗涤样品三次。随后用70%乙醇溶液洗涤样品三次，每次洗涤后倾去乙醇。用保存液将样本清洗一次，然后使用无菌镊子将其转移至含有15-25毫升保存液的新鲜离心管中，确保样本完全浸没。样本可在4°C下保存长达一个月。异丙醇和乙醇具有可燃性，必须在室温下使用，并在可燃废弃物容器中妥善处理。任何人体废弃物必须与常规生物危害废弃物分开处理。使用无菌镊子将储存的细胞外基质（ECM）碎片转移至24孔板的各个孔中，根据计划进行的下游检测加入所需数量的碎片。在摇床平台上用500微升70%乙醇洗涤三次，然后用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤三次以重新水化。使用无菌剪刀将细胞外基质（ECM）切成100毫克的碎片。将每个碎片放入24孔板的一个孔中，并在25°C下孵育15分钟，以使碎片中的过量PBS渗出。然后用移液器小心吸除各孔中残留的PBS。用移液器将20微升前脂肪细胞悬液直接加入细胞外基质（ECM）中，对每个组织片段进行接种。将移液器吸头插入ECM中，并轻轻将细胞悬液排至基质中央，确保细胞悬液不溢出，避免流至孔板底部。若细胞悬液从ECM中溢出，应立即将移液器吸头从该位置移开，并插入ECM的其他位置重新操作。细胞接种后，将ECM在37摄氏度下孵育40分钟。每孔加入500微升培养基，以覆盖接种的ECM碎片。将细胞在37摄氏度和5%二氧化碳条件下培养72小时。72 小时后，小心吸除培养基，注意不要扰动细胞外基质（ECM）碎片。加入 500 µL 分化培养基，培养细胞 14 天，每两到三天更换一次培养基。使用光学显微镜观察分化情况。细胞在分化过程中会积累脂质，颜色变为棕黄色，并逐渐呈现更明显的球形。通过扫描电子显微镜监测脂肪组织ECM的制备、前脂肪细胞的接种以及体外分化为成熟脂肪细胞的过程，结果显示ECM已实现去细胞化，并在重新接种和分化后成功重建了含脂质的脂肪细胞。对去细胞化ECM进行的I型胶原特异性免疫组织化学染色显示胶原微结构得以保留，而对活体及固定后的三维ECM-脂肪细胞复合体进行油红O染色则显示存在含脂质的脂肪细胞。通过定量实时PCR检测在细胞外基质（ECM）中分化的脂肪细胞中的脂肪生成相关基因，结果显示，与在ECM中培养的未分化前脂肪细胞相比，这些基因在分化后的细胞中表达上调。图中显示了转录水平的完整差异。将来自糖尿病患者和非糖尿病患者的四种ECM与脂肪细胞组合进行了代谢表型分析。在来自糖尿病组织的构建物中发现了脂解功能的葡萄糖摄取受损。重要的是，研究发现非糖尿病细胞外基质（ECM）可恢复糖尿病脂肪细胞中胰岛素刺激的葡萄糖摄取和脂解能力。分离的前脂肪细胞、脱细胞组织以及重新接种的ECM发生污染的情况并不少见。在整个实验过程中必须严格保持无菌状态。

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科研

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生物工程

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