Name: 聚类诱导解吸/电电质谱法对复杂分子及其在表面的反应分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: 了解DINeC聚类诱导解吸/电离质谱法用于生物分子表面分析。该技术利用SO₂中性簇实现软解吸，可实时检测肽和蛋白质的化学变化，样品制备要求低，适用于多种复杂表面分子研究。

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作者感谢Helmholtz国际FAIR中心（HICforFAIR）和Helmholtz强子与离子研究研究生院（P.S.）提供的经费支持。作者感谢牛津大学Rauschenbach教授及其团队在联合ES-IBD/DINeC实验方面富有成效的合作。

注意：该方案可在任意时刻暂停。
1. 底物的制备
<ol>
	<li>对于标准样品，从硅晶圆（厚度约为 0.5 至 1 mm）上切割出 1 × 1 cm2 的基底片。</li>
	<li>将硅基底分别在超声波浴中的乙醇和丙酮中各清洗 15 分钟。</li>
	<li>用干燥的氮气气流吹干基底。</li>
</ol>
2. 样品制备
<ol>
	<li>标准样品制备
	<ol>
		<li>对于标准样品，根据拟解决的科学问题配制含有分析物分子的溶液。分析物的浓度应至少为 1 × 10-10 mol/L。</li>
		<li>将 5 至 30 µL 样品溶液滴涂在基底上。根据溶剂的蒸气压，让样品在常温条件下或干燥器中自然干燥，直至溶剂完全蒸发，形成干燥薄膜。根据所施加物质的量，薄膜厚度可在数十微米（可通过肉眼观察）至单分子层或亚单分子层范围（肉眼不可见）之间变化。</li>
		<li>将样品固定在样品台上（例如使用胶带或由螺丝紧固的夹具，具体方式取决于样品类型及所需的真空条件）。</li>
		<li>如条件允许，可在样品台上同时安装一个参考样品，例如厚度为微米级的血管紧张素 II 薄膜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>替代样品制备方法
	<ol>
		<li>根据具体情况，可采用其他样品制备方法，例如在真空条件下使用电喷雾离子束沉积（ES-IBD）或在相应溶液中进行浸涂法（dip coating）。</li>
		<li>对于需在真空中制备并转移的样品，应在开始制备步骤前将其安装在 DINeC 样品台上。</li>
		<li>确保浸涂法制备的样品在最终步骤完成后已完全干燥。</li>
		<li>应考虑采用最简单的制备方案。例如，在研究荧光笔墨水时，只需在基底表面画一个点即可。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 将样品转移至DINeC质谱仪
<ol>
	<li>将样品从常压环境转移至抽真空的 DINeC 腔室
	<ol>
		<li>对载锁系统进行通气。</li>
		<li>打开载锁舱，安装样品支架。</li>
		<li>关闭载锁舱，并将载锁腔室抽真空至压力低于 2 x 10-5 mbar。</li>
		<li>打开通往 DINeC 腔室的阀门，使用传样杆将样品支架转移至主操纵器，并将样品支架连接到操纵器上。</li>
		<li>缩回传样杆，并关闭载锁舱与 DINeC 腔室之间的阀门。 
		&#160;</li>
		
	</ol>
	</li>
	<li>将样品从真空环境转移至抽真空的 DINeC 腔室
	<ol>
		<li>使用可连接至 DINeC 腔室 CF40 法兰的便携式真空容器，将处于真空条件下制备的样品通过该容器转移，确保不破坏真空状态。确保样品已安装在与 DINeC 系统中操纵器兼容的样品支架上。</li>
		<li>将便携式真空容器连接至 CF40 法兰，并对容器与 DINeC 腔室之间的空间进行抽真空。</li>
		<li>当压力降至低于 2 x 10-5 mbar 时，打开通往 DINeC 腔室和便携式真空容器的闸阀，使用摇摆杆或具有超过 50 cm 线性移动能力的其他传样系统，将样品转移至 DINeC 腔室内的操纵器上。</li>
		<li>缩回传样系统，并关闭两个闸阀。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 气体混合物的制备
<ol>
	<li>通过首先将气体混合系统的气瓶抽真空10分钟，制备约3% SO2的氦气混合气体。</li>
	<li>向气瓶中充入SO2，直至压力达到1 bar。</li>
	<li>再用氦气充入气瓶，直至总压力达到30 bar。 
	注意：使用SO2时，必须始终遵守相应的安全预防措施，例如将SO2气瓶存放在指定的气体柜中。</li>
</ol>
5. DINeC 质谱仪的准备
<ol>
	<li>打开气瓶与喷嘴之间的阀门。将气体混合系统外部的SO2/He混合气体压力调节至15 bar。</li>
	<li>将操纵器的位置设置为参考样品的位置。</li>
	<li>测量阳离子质谱时，将样品和栅网偏压分别设置为+40 V和+7 V。</li>
	<li>为驱动脉冲喷嘴和离子阱质谱仪，将外部函数发生器设置为2 Hz。使用延迟发生器，将离子阱发出的Clear trap信号与脉冲喷嘴触发信号之间的时间延迟Δtn设置为5 ms。</li>
	<li>在控制软件中，通过按下相应的按钮或在主对话窗口的Mode页面输入相应数值，调节以下参数：Scan Mode：增强分辨率，Range：m/z 50 – 3000，Accu-time：0.1 ms，Average：10个循环，Polarity：测量阳离子质谱时设为正极性 
	注意：测量阴离子质谱时，样品和栅网偏压需相对于接地为负，且控制软件中的Polarity需切换至Negative。</li>
</ol>
6. 质谱的测定
<ol>
	<li>当 DINeC 腔室内的压力达到低于 3 x 10-6 mbar 时，即可开始测量。在控制软件中，先按下待机，再按下运行以启动测量。然后按下播放按钮开始记录测量数据。</li>
	<li>对一种参考样品（如血管紧张素 II）测量约 300 秒的测试谱图。将色谱图设置为相应的m/z值，以监测信号随时间的变化。通过调节清除离子阱信号与触发脉冲喷嘴信号之间的时间延迟 Δtn，优化信号强度。</li>
	<li>移动操纵器至待测样品的位置。通过调节样品在样品托架平面内的位置，进一步优化信号强度。</li>
	<li>在感兴趣的时间范围内采集质谱数据。根据实验的具体要求，调整样品温度或腔室背景压力等实验参数。在改变实验参数的同时，持续采集质谱数据。</li>
</ol>
7. 数据评估
<ol>
	<li>测量结束后，在数据分析程序中加载相应的数据集。使用鼠标的右键在色谱图中选择感兴趣的时间段，平均光谱将在单独的窗口中显示。</li>
	<li>将光谱导出为数据文件，以便在选定的程序中进行进一步处理。</li>
</ol>

&#160; &#160;

<ol><li>Vickerman, J. C., Gilmore, I. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVickerman%2C+JC+%22Surface+Analysis%3A+The+Principal+Techniques%22">Surface Analysis: The Principal Techniques</a>. , 2nd ed, John Wiley & Sons. New York. (2009).</li>
<li>Reutzel, M., Münster, N., Lipponer, M. A., Länger, C., Höfer, U., Koert, U., Dürr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemoselective+Reactivity+of+Bifunctional+Cyclooctynes+on+Si%28001%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physical+Chemistry+C%22%5BJournal%5D)">Chemoselective Reactivity of Bifunctional Cyclooctynes on Si(001).</a> Journal of Physical Chemistry C. 120, 26284-26289 (2016).</li>
<li>Grill, L., Dyer, M., Lafferentz, L., Persson, M., Peters, M., Hecht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nano-architectures+by+covalent+assembly+of+molecular+building+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Nano-architectures by covalent assembly of molecular building blocks.</a> Nature Nanotechnol. 2, 687-691 (2007).</li>
<li>Stutzmann, M., Garrido, J. A., Eickhoff, M., Brandt, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+biofunctionalization+of+semiconductors%3A+A+survey%5BTitle%5D)+AND+%22Physica+Status+Solidi+A%22%5BJournal%5D)">Direct biofunctionalization of semiconductors: A survey.</a> Physica Status Solidi A. 203, 3424-3437 (2006).</li>
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<li>Ichiki, K., Ninomiya, S., Nakata, Y., Honda, Y., Seki, T., Aoki, T., Matsuo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Sputtering+Yields+of+Organic+Compounds+by+Large+Gas+Cluster+Ions%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Surface+Science%22%5BJournal%5D)">High Sputtering Yields of Organic Compounds by Large Gas Cluster Ions.</a> Applied Surface Science. 255, 1148-1150 (2008).</li>
<li>Mochiji, K., Hashinokuchi, M., Moritani, K., Toyoda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix-free+Detection+of+Intact+Ions+from+Proteins+in+Argon-Cluster+Secondary+Ion+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Matrix-free Detection of Intact Ions from Proteins in Argon-Cluster Secondary Ion Mass Spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 23, 648-652 (2009).</li>
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<li>Lee, B. J., Gebhardt, C. R., Schroder, H., Kompa, K. L., Durr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observation+of+Ionic+Desorption+Channels+in+Cluster-induced+Desorption+of+Alkali+Halides+-+Influence+of+Surface+Electronic+Properties+and+Surface+Configuration%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Physics+Letters%22%5BJournal%5D)">Observation of Ionic Desorption Channels in Cluster-induced Desorption of Alkali Halides - Influence of Surface Electronic Properties and Surface Configuration.</a> Chemical Physics Letters. 556, 77-81 (2013).</li>
<li>Baur, M., Gebhardt, C. R., Durr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Desorption%2FIonization+Induced+by+Neutral+Cluster+Impact+as+a+Soft+and+Efficient+Ionization+Source+for+Ion+Trap+Mass+Spectrometry+of+Biomolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Desorption/Ionization Induced by Neutral Cluster Impact as a Soft and Efficient Ionization Source for Ion Trap Mass Spectrometry of Biomolecules.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 28, 290-296 (2014).</li>
<li>Kley, C. S., Dette, C., Rinke, G., Patrick, C. E., Cechal, J., Jung, S. J., Baur, M., Durr, M., Rauschenbach, S., Giustino, F., Stepanow, S., Kern, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic-Scale+Observation+of+Multiconformational+Binding+and+Energy+Level+Alignment+of+Ruthenium-Based+Photosensitizers+on+TiO2+Anatase%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Atomic-Scale Observation of Multiconformational Binding and Energy Level Alignment of Ruthenium-Based Photosensitizers on TiO2 Anatase.</a> Nano Letters. 14, 563-569 (2014).</li>
<li>Portz, A., Aoyagi, S., Durr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+depth-profiling+of+mixed+peptide%2Flipid+samples+by+means+of+cluster+induced+desorption%2Fionization+mass+spectrometry+-+high+depth+resolution+and+low+matrix+effect%5BTitle%5D)+AND+%22Biointerphases%22%5BJournal%5D)">Soft depth-profiling of mixed peptide/lipid samples by means of cluster induced desorption/ionization mass spectrometry - high depth resolution and low matrix effect.</a> Biointerphases. 13, 03B405(2018).</li>
<li>Portz, A., Baur, M., Gebhardt, C. R., Frank, A. J., Neuderth, P., Eickhoff, M., Durr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+the+Cluster+Constituents%27+Reactivity+on+the+Desorption%2FIonization+Process+Induced+by+Neutral+SO2+Clusters%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Physics%22%5BJournal%5D)">Influence of the Cluster Constituents' Reactivity on the Desorption/Ionization Process Induced by Neutral SO2 Clusters.</a> Journal of Chemical Physics. 146, 134705(2017).</li>
<li>Schneider, P., Durr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cluster-induced+desorption+investigated+by+means+of+molecular+dynamics+simulations+-+Microsolvation+in+clusters+of+polar+and+non-polar+constituents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Physics%22%5BJournal%5D)">Cluster-induced desorption investigated by means of molecular dynamics simulations - Microsolvation in clusters of polar and non-polar constituents.</a> Journal of Chemical Physics. 150, 214301(2019).</li>
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<li>Buchberger, A. R., DeLaney, K., Johnson, J., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+Spectrometry+Imaging%3A+A+Review+of+Emerging+Advancements+and+Future+Insights%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mass Spectrometry Imaging: A Review of Emerging Advancements and Future Insights.</a> Analytical Chemistry. 90, 240-265 (2018).</li>
<li>Portz, A., Gebhardt, C. R., Durr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-Time+Investigation+of+the+H%2FD+Exchange+Kinetics+of+Porphyrins+and+Oligopeptides+by+Means+of+Neutral+Cluster-Induced+Desorption%2FIonization+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physical+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Real-Time Investigation of the H/D Exchange Kinetics of Porphyrins and Oligopeptides by Means of Neutral Cluster-Induced Desorption/Ionization Mass Spectrometry.</a> Journal of Physical Chemistry B. 121, 11031-11036 (2017).</li>
<li>Portz, A., Baur, M., Rinke, G., Abb, S., Rauschenbach, S., Kern, K., Dürr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+Analysis+of+Complex+Surface-Adsorbed+Molecules+and+Their+Reactions+by+Means+of+Cluster-Induced+Desorption%2FIonization+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Chemical Analysis of Complex Surface-Adsorbed Molecules and Their Reactions by Means of Cluster-Induced Desorption/Ionization Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 90, 3328(2018).</li>
<li>Portz, A., Baur, M., Gebhardt, C. R., Durr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+Spectrometry+of+Oligopeptides+in+the+Presence+of+Large+Amounts+of+Alkali+Halides+Using+Desorption%2FIonization+Induced+by+Neutral+Cluster+Impact%5BTitle%5D)+AND+%22Biointerphases%22%5BJournal%5D)">Mass Spectrometry of Oligopeptides in the Presence of Large Amounts of Alkali Halides Using Desorption/Ionization Induced by Neutral Cluster Impact.</a> Biointerphases. 11, 02A316(2016).</li>
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</ol>

作者声明无任何利益冲突可披露。

迄今为止，在许多研究中已证明DINeC-MS对多种物质具有高灵敏度。事实上，该技术可实现对分析物的测量，其物质的量可低至飞摩尔（femtomole）级别11。由于灵敏度极高，样品制备过程（特别是基底清洗）必须使用高纯度的化学试剂，以避免DINeC质谱图中出现污染信号。与许多分析技术一样，通过空白基底进行适当的本底测量，有助于区分来自分析物的峰与源自基底或样品制备过程的峰。
尽管我们已经证明，在混合样品中，共吸附物或共存成分的存在对特定分析物分子的电离概率影响不大17,24，但不同物质之间的电离概率仍可能存在差异13。因此，在洁净条件下操作显得尤为重要，因为污染物根据其电离概率的不同，可能比目标分析物产生更强的信号响应。在DINeC-MS中，预先形成的离子（例如许多染料分子的情况）或含有易于质子化或去质子化官能团的分子（即碱性或酸性分子）通常表现出较高的电离概率。如果分析物分子中不存在此类官能团，则其电离概率可能较低。此时，可使用电离试剂（如三氟乙酸）对样品进行处理（例如，将样品暴露于电离试剂的蒸气中）以促进电离。
在图4和图5中讨论的代表性结果表明，DINeC-MS方法适用于通过质谱法对化学反应进行实时研究。图6展示了该方法对亚单层水平的灵敏度。若将这两种特性结合，便可实时追踪表面化学反应及其产物23。这一点对于所谓的&#34;表面合成&#34;尤其具有重要意义，该过程可导致大分子结构在表面上的组装3,33,34,35,36。在当前的实验装置中，此类表面反应可在反应活性较低的表面（如金23及其他贵金属表面）上进行观测；而在高反应性表面（如硅表面）上开展实验则更为困难37，因为解吸室的基础压力处于10-7 mbar量级。目前的研究工作正致力于解决这一限制，一套兼容超高压（UHV）条件的DINeC装置正在搭建中。对于反应性较强的表面，在测量表面吸附物及表面反应之前，必须预先测试SO2与基底表面之间的相互作用。
由于团簇束呈电中性，无法进行聚焦。因此，样品上的束斑尺寸由装置的几何结构以及所用锥形引气口的孔径决定；样品上束斑直径的典型值为一至数毫米。因此，通过扫描样品进行成像仅能实现非常低的分辨率。另一方面，由于电离概率较高13，DINeC能够高效利用脱附出的分子。因此，将DINeC-MS与离子成像探测器38相结合显得极具吸引力。

表面敏感分析技术通常基于低能电子、原子或离子等粒子探针，这些探针与固体样品发生强烈相互作用。因此，这类技术具有很高的表面灵敏度，能够获得有关表面结构的详细信息1。然而，其化学信息往往有限。例如，X射线光电子能谱可以提供原子组成以及特定物种平均化学环境的定量信息（如吸附在表面上的有机分子中的碳原子2）。但对于结构复杂的表面吸附分子，如其精细结构或结合位点等更详细的信息，则难以通过常规表面分析技术获得。另一方面，随着人们对利用有机分子进行表面功能化的兴趣日益增加，对这类信息的需求也在不断增长。表面合成3以及通过生物分子固定实现表面功能化4,5是两个典型的例子。在所有这些研究领域中，人们都在深入探究基底-吸附物及吸附物-吸附物之间的相互作用，以期更深入地理解这些体系。对于此类研究，获得尽可能多的关于吸附分子的信息是十分理想的。
在一定程度上，二次离子质谱法（SIMS）能够提供此类信息。首先，SIMS 具有极高的表面灵敏度；其次，由于溅射出的吸附物及其碎片通过质谱法（MS）进行检测，因此可以获得远超原子组成的信息。根据吸附在表面上的化学物种的性质，可通过其在质谱中观测到的分子质量及碎片图谱对其进行鉴定6。初级离子诱导产生的碎片确实有助于被分析材料的鉴定。然而，若初级离子对样品引起的修饰（如碎片化、离子诱导反应、混合等）过于显著，则样品原始状态的大部分信息将丢失。因此，人们已投入大量努力以减少 SIMS 中的碎片化现象（例如，采用带电分子团簇作为初级离子7,8,9）。然而，碎片化现象在大分子和生物样品的 SIMS 谱图中仍占主导地位10，限制了 SIMS 在多个领域的应用。
作为一种替代方法，我们已证明由中性团簇诱导的解吸/电离（DINeC）是一种温和且无需基质的电离方法，已成功应用于复杂分子的质谱分析11,12,13,14,15,16,17。DINeC 基于一束由 103 至 104 个 SO2 分子组成的分子团簇（图 1）。当这些团簇撞击样品时，会以多种方式与表面及其内部的分子相互作用：首先，团簇的部分动能被重新分配并激发解吸过程；同样重要的是，在团簇与表面碰撞过程中，待解吸的分子会溶解于团簇之中11,18,19（图 1 和 图 2）。换言之，基于 SO2 的高偶极矩，这些团簇在极性分析物的电离过程中高效地充当了一种瞬态基质。因此，分析物分子可在低至 1 eV/分子及以下的团簇能量下实现解吸。此外，在 SO2 团簇撞击表面时及撞击后发生碎裂的过程中，系统迅速冷却，进一步保证了该解吸过程的温和性11,19。由于上述多种机制的共同作用，肽、蛋白质、脂质和染料等复杂分子在团簇诱导下的解吸过程不会导致解吸分子发生任何碎裂11,15；典型的质谱图中，主峰出现在完整分子的 m/z 值处（[M+H]+ 或 [M-H]-，图 3）。根据分子中官能团的数量和性质，可观察到多种形式的多电荷阳离子 [M + n·H]n+11,15,18。对于生物分子，电离通常分别通过碱性或酸性官能团的质子摄取或质子脱除而实现11。若样品中存在水分子，团簇中的 SO2 分子可与这些水分子反应生成亚硫酸18。后者可作为一种高效的质子源，进一步促进通过质子摄取途径的电离过程（正离子模式）13,18。
<img alt="质谱示意图、电离过程、团簇分析、SO2/He供应、离子阱装置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60487/60487fig1a.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：团簇诱导脱附/电离过程及实验装置示意图。 团簇诱导脱附/电离在高真空腔室中进行。通过脉冲喷嘴将SO2/He混合气体进行超声膨胀，产生SO2团簇束流（黄色点）。在团簇与表面碰撞过程中，表面分子被脱附并电离。生成的分子离子（红色/橙色点）经由带偏压的网格、双离子漏斗进样口和八极离子导向器被导入离子阱，用于质谱分析。典型的质谱图显示完整分子在m/z处的显著峰，此处分别为正离子模式下的M1（橙色）和M2（红色）。放大图：在团簇与表面碰撞过程中，脱附的分子溶解于入射团簇或其某一碎片中；随后SO2分子进一步碎裂并蒸发，最终形成在质谱仪中检测到的裸露且完整的分子离子。另见图2。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60487/60487fig1alarge.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="纳米粒子碰撞过程示意图：破碎、溶解（B）和解吸（C）阶段。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60487/60487fig2a.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：分子动力学模拟快照，展示通过溶剂化作用引发的团簇诱导解吸过程。 (A) 一个SO2团簇（300个分子）以垂直于表面的1250 m/s速度接近表面，该表面上吸附有一个二肽（天冬氨酸-精氨酸，ASP-ARG）。(B) 在团簇与表面碰撞过程中，团簇发生破碎。吸附的二肽与周围的SO2分子相互作用，导致其溶解于其中一个团簇碎片中。(C) 团簇碎片被排斥离开表面。标记的碎片（蓝色圆圈）携带了该二肽，并在此过程中实现解吸。本图经参考文献19修改。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60487/60487fig2alarge.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="通过光谱分析和建模得到的血管紧张素II的质谱图和分子结构。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60487/60487fig03.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：血管紧张素II的代表性质谱图和分子模型。 (A) 在血管紧张素II样品上通过团簇诱导解吸/电离获得的质谱图（上图：正离子模式，下图：负离子模式）。样品通过将相应溶液滴加到硅晶圆（表面覆盖天然氧化层）上制备。主要峰归属于完整的生物分子 [M+H]+ 和 [M-H]-；未观察到碎片离子峰。二聚体峰（[2M+H]+，箭头所示）进一步表明解吸过程具有软电离特性。由于SO2团簇的影响，正离子信号更强18。 (B) 血管紧张素II的空间填充模型及其氨基酸序列。白色球体代表氢原子；黑色：碳；蓝色：氮；红色：氧。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60487/60487fig3alarge.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
DINeC 可应用于任何可兼容高真空条件的固体样品。无需特殊的样品制备，特别是与基质辅助激光解吸/电离（MALDI）质谱及相关技术不同，在进行 DINeC-MS 测量前无需施加基质。20,21这使得能够在改变实验条件（如真空腔内反应物的背景压力）的情况下，实时测量样品的化学变化。22 或样品温度。DINeC-MS 的检测限已证明可达到飞摩尔（femtomole）级别。11在分析吸附于固体表面的生物分子（亚单层状态）时，可检测到低至单层覆盖率0.1%的表面吸附量。23在此覆盖度条件下，信号强度与表面覆盖率呈线性关系，因此DINeC-MS可用于表面组成的定量分析。23对于混合样品，可对样品组分进行定量评估17,24，因为未观察到化学环境对电离概率有显著影响（例如在混合脂质/肽样品中）17）。这与二次离子质谱（SIMS）形成鲜明对比，因为在SIMS中，特定物种的电离概率通常受到不同化学组分存在的强烈影响（即所谓的“基质效应”）。25,26).
除了表面分析外，还可通过深度剖析来探测亚表面区域的化学成分17。在当前的实验设置下，团簇诱导生物分子脱附的典型脱附速率约为 10-3 nm/s。对于混合脂质/肽样品，已观察到 1 至 2 nm 范围内的高深度分辨率17。
另一个应用领域是将 DINeC-MS 与薄层色谱（TLC）相结合。常规的 TLC 板可直接通过 DINeC-MS 进行分析。可从 TLC 板上获取位置依赖性的质谱，从而获得质谱特异性的色谱图27。与 TLC 联用 ESI 的方法不同，该方法无需对分离的分析物进行重新洗脱28,29。此外，DINeC-MS 与 TLC 的联用也无需使用基质，而 TLC 与 MALDI 联用则需要28,29。
解吸电喷雾电离（DESI）也是一种适用于质谱分析的软解吸/电离方法30,31。DINeC 与 DESI 之间最显著的差异在于：DINeC 具有定量特性23，能够兼容超高真空（UHV）条件，特别是可在不破坏真空的条件下对在 UHV 环境中制备和转移的样品进行分析23，此外还能够高效解吸非极性分子19。
原则上，DINeC 作为解吸/电离源可与任意类型的质谱仪联用。然而，与离子阱质谱联用具有两个主要优势：第一，典型的脉冲团簇束的脉冲宽度和重复频率与离子阱的不连续积累时间及其谱图采集速率非常匹配15,32；第二，DINeC 过程的软电离特性有助于完整分子的解吸。结合离子阱质谱的 MSn 分析能力，可对被测样品实现最为全面的分析15。

<table><tbody><tr><td>丙酮 rotisolv HPLC</td><td>Roth</td><td>7328.2</td><td>HPLC 梯度级</td></tr><tr><td>铜箔胶带</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>乙醇 rotisolv HPLC</td><td>Roth</td><td>p076.1</td><td>HPLC 梯度级</td></tr><tr><td>氦气</td><td>Praxair</td><td>4800086706</td><td>纯度 99.9999%</td></tr><tr><td>氮气</td><td>Praxair</td><td>40728408</td><td>纯度 99.5 - 100%</td></tr><tr><td>硅晶圆</td><td>Active Business Company GmbH</td><td>G60007</td><td></td></tr><tr><td>二氧化硫</td><td>Air Liquide</td><td>P1734S10R0A001</td><td>纯度 99.98%</td></tr><tr><td>水 rotisolv LC-MS</td><td>Roth</td><td>HN43.1</td><td>超纯 LC-MS 级</td></tr></tbody></table>

利用团簇诱导解吸/电离质谱法分析表面复杂分子及其反应

Analysis of Complex Molecules and Their Reactions on Surfaces by Means of Cluster-Induced Desorption/Ionization Mass Spectrometry

中性SO诱导解吸/电离2 簇解吸/电离（DINeC）作为一种极为温和且高效的解吸/电离技术，被用于复杂分子及其在表面反应的质谱分析（MS）。DINeC 基于一束 SO2 团簇以低团簇能量撞击样品表面。在团簇与表面碰撞过程中，部分表面分子通过入射团簇中的解溶作用被脱附并离子化；由于这种由解溶作用介导的脱附机制，仅需较低的团簇能量即可实现脱附，且该脱附过程极为温和。该方法既可分析表面吸附物，也可分析构成表面本身的分子。对于肽类和蛋白质等复杂分子，可获得清晰且无碎片的质谱信号。DINeC无需任何特殊样品制备，尤其无需添加基质。该方法可提供样品组成的定量信息，即使表面覆盖率低至单分子层的0.1%的分子亦可被检测。诸如氢/氘交换或热分解等表面反应可实现原位实时观测，并可推导出反应动力学。若采用脉冲喷嘴生成团簇束，DINeC可高效地与离子阱质谱联用。DINeC过程的无基质、软电离特性与质谱技术相结合n 离子阱的功能可对复杂有机样品及表面有机吸附物的化学组成进行极为详细且明确的分析。

以下展示了 DINeC-MS 在实时应用中的两个示例。图 4 显示了当样品加热至约 140 °C 时，从血管紧张素 II 获得的质谱图的变化。当达到最终温度时（图 4B、图 4E），谱图中出现一个额外的峰，表明失去了一个 H2O 基团（m/z = 1029）。在该温度下持续保温时，可观察到血管紧张素 II 分子的进一步分解（图 4C），包括失去一个末端氨基酸单元——天冬氨酸（m/z = 932 处的峰，图 4D）。对数据的定量分析可用于评估相应的反应动力学（图 4E）。特别是，图 4E 表明，m/z = 1029 的物种为中间体，其强度先升高后降低，说明该中间体会进一步分解为更小的碎片。因此，相应的速率常数处于同一数量级。
作为第二个例子，血管紧张素II中氢/氘交换的研究22 如图所示 图5. 将血管紧张素样品暴露于 D2DINeC 室中的 O（pD2O = 10-4 mbar），血管紧张素II的同位素峰型展宽并移向更高质荷比 m/z 表明氢原子被氘原子取代。该过程在前60秒内较快，但在实验后续阶段显著减慢：同位素图谱在 图5B 涵盖广泛 m/z 范围（约 15 m/z 单位）。当我们定义氘代程度时 d 分子中交换的H原子数量，其数值为 d 之间 d = 0 到 d = 13 可从光谱中提取。在 图5C，同位素峰型的宽度再次减小。这一现象可归因于与最低氘代程度相关的峰强度显著降低。在 图5D，展示了更长反应时间下的光谱。所覆盖的 m/z 范围几乎保持不变，但光谱的质心仍缓慢地向更高方向移动 m/z 值。对于较长的暴露时间，部分分子可达到最高程度的氘代， d最大值 = 17. 它对应于可交换H原子的最大数目，由羧酸或胺基等官能团所结合的H原子数目决定。
从谱图的时间演化中可以推断出，H/D 交换以不同的速率常数进行。为了对这一现象进行定量描述，平均氘代程度 d̅ 被绘制成 图5E 中随时间变化的函数。对实验结果（符号所示）的分析揭示了三种不同的阶段：在 t &lt; 50 s 时表现为 d̅ 的快速上升阶段；在 50 s &lt; t &lt; 200 s 时为中间阶段；以及在 t &gt; 200 s 时为缓慢但几乎持续上升的阶段。实验结果通过蒙特卡洛模拟进行了拟合；假设所研究分子中各官能团的 H/D 交换遵循伪一级反应动力学，其反应速率常数为 ki22。只有当采用至少三个不同的速率常数 ki 来描述血管紧张素 II 分子中的 H/D 交换时，模拟结果与实验数据在所有三个阶段均取得良好吻合。在 图5F,G 中展示了通过将实验同位素分布拟合为不同氘代程度同位素分布之和（图5A 至 图5D）所得到的动力学曲线。实验数据与模拟结果之间的良好一致性，以及低氘代程度和高氘代程度下显著不同的交换速率均清晰可见。通过与六甘氨酸等其他寡肽的比较，发现快速交换速率归因于暴露的官能团，而缓慢交换速率则与肽链骨架中的酰胺基团相关22。
前两个示例使用微米级厚度的血管紧张素II样品进行测量，而图6展示了通过电喷雾离子束沉积法（ES-IBD）制备的金基底上血管紧张素II亚单层覆盖样品所获得的结果23。信号强度与物质含量之间在三个数量级范围内呈现线性关系，检测到的最低物质量相当于金表面血管紧张素II分子单层的0.1%。如图5所示的H/D交换实验也在亚单层条件下对金表面的血管紧张素II进行了研究23。
<img alt="血管紧张素II的质谱分析及其m/z峰和温度依赖性信号图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60487/60487fig4a.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图4"> 
图4：血管紧张素II热降解过程的实时观测 (A-C) 血管紧张素II样品经团簇诱导解吸/电离后获得的质谱图 （A） 室温下的新鲜样本。 （B） 样品加热至约 140 °C. 除了位于 m/z = 1047，对应于完整分子 [M+H]+，峰值出现在 m/z 932、1012 和 1029 处出现条带（由箭头指示）。 (C) 随着时间的推移，在高温下保持样品时，后出现的峰增强，而主峰减弱。 (D) 血管紧张素II的结构式，标示出导致在特定位置出现峰的片段（棕色括号） m/z = 由于丢失一个氨基酸单元（天冬氨酸）而导致的932。 (E) 样品温度及图中所示主要峰强度随时间的变化 （A） 至 (C)。 实线为视觉引导线。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60487/60487fig4alarge.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="血管紧张素II的质谱数据分析；强度与时间关系图；动力学拟合结果" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60487/60487fig05.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图5"> 
图5：血管紧张素II中氢/氘交换的实时观测。 (A-D) 通过DINeC-MS方法获得的血管紧张素II的阳离子质谱。由于氢/氘交换，与图(A)中未氘代物种的同位素分布相比，图(B)至(D)中的同位素分布变宽并向更高的m/z值偏移。红色实线为实验数据，虚线青色线为考虑不同氘代程度的数据拟合结果。(E) 从实验中推导出的平均氘代程度d̅随时间的变化（空心点）。此外，还展示了通过蒙特卡罗模拟推导出的d̅随时间变化的结果。黑色虚线：考虑一个速率常数（k1）的模拟结果；红色曲线：考虑三个速率常数（k1、k2、k3）的模拟结果。(F,G) 血管紧张素II特定氘代程度的相对信号强度（符号+实线）随时间的变化，以及相应的蒙特卡罗模拟结果（虚线）。本图改编自参考文献22。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60487/60487fig5alarge.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="质谱；电喷雾-离子束沉积制备，直接电离纳米团簇质谱分析；离子检测，血管紧张素II数据图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60487/60487fig06.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图6"> 
图6：DINeC-MS在亚单层条件下对金基底上血管紧张素II的应用。 (A) 电喷雾-离子束沉积（ES-IBD）用于沉积，结合DINeC-MS对亚单层条件下孤立的血管紧张素II分子进行质谱分析的示意图。 (B) 信号强度随样品上沉积物质量变化的依赖关系，数据来自两组独立实验（实心与空心符号）。插图：从沉积了指定量物质的样品上获得的DINeC质谱图。本图经参考文献23修改。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60487/60487fig6alarge.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

使用低动能（&#60; 0.8 eV/组分）的中性SO2团簇，可使复杂表面分子（如肽或脂质）解吸，并通过离子阱质谱仪进行质谱分析。该方法无需特殊样品制备，且可实现对反应的实时观测。

由中性SO2团簇诱导的解吸/电离（Desorption/Ionization Induced by Neutral SO2 Clusters, DINeC）被用作一种极为温和且高效的质谱解吸/电离技术，用于……

我们称之为DINeC的中性SO2团簇诱导解吸电离，是一种温和且高效的解吸电离方法。该方法可用于生物分子（如肽和蛋白质）的质谱分析。由于DINeC能够使分子完整地从样品表面解吸，因此这些分子中的细微化学变化在质谱图中易于被检测。该过程在以下模拟中进行了演示。入射的团簇通过团簇与表面的碰撞而发生碎裂。表面同位素二肽溶解于其中一个团簇碎片中，并通过此过程脱附。在实验中，SO2 团簇的分子束通过脉冲喷嘴的超声膨胀产生。在团簇表面撞击过程中溶解并电离的分子被转移至离子阱中进行质谱分析。典型的质谱图仅在完整分子的 MO 设定值处显示峰。本实验操作将由本实验室的两位博士生 Karolin Bomhardt 和 Pascal Schneider 演示。对于标准样品，从厚度约为 0.5 至 1 毫米的硅晶圆上切割出 1 厘米 × 1 厘米的正方形基底。将硅基底分别在超声波浴中的乙醇和丙酮中各清洗 15 分钟。在干燥的氮气流中干燥基底。然后，将 5 至 30 微升样品溶液滴加到基底上。根据溶剂的蒸气压，将样品在常温下或干燥器中干燥，直至所有溶剂完全蒸发，形成干燥薄膜。考虑最简单的制备方案。例如，在研究荧光笔墨水时，只需在基底表面画一个点即可。使用胶带或通过螺丝固定的夹具将样品固定在样品 holder 上。此外，在样品台上安装一个参考样品，例如一段微米级厚度的血管紧张素II薄膜。然后，按下“Vent load lock”以对装载锁系统进行放气。等待五分钟，或直至达到大气压。打开进样锁，安装样品台。关闭进样锁，并将进样锁室抽真空至压力低于2 × 10⁻⁵ 毫巴。打开通往DINeC腔室的阀门，使用传样杆将样品台转移至主机械手。将样品台连接到操纵器上。缩回传输杆，并关闭装载锁与DINeC腔室之间的阀门。打开气瓶与喷嘴之间的阀门。将气体混合系统外围的二氧化硫和氦气混合物的压力调节至15 bar。将操纵器的位置设置为参考样品的位置。在测量阳离子质谱时，将样品和栅极的偏压分别设置为+40伏和+7伏。为了驱动脉冲喷嘴和离子阱质谱仪，将外部函数发生器设置为两赫兹。使用延迟发生器，将离子阱发出的清空陷阱信号与脉冲喷嘴触发信号之间的时间延迟设为五毫秒。在布鲁克控制软件中，于主对话窗口的“模式”页面，选择“扫描模式”为“增强分辨率”。输入质荷比（M/Z）范围为50至3000，累积时间设为0.1毫秒，平均次数设为10次；极性选择方面，阳离子质谱测量选正离子模式，阴离子质谱测量选负离子模式。当DINeC腔室内的压力降至低于3×10⁻⁶毫巴时，开始测量。将质荷比（M/Z）设置为相应质量，以追踪随时间变化的色谱信号。在控制软件中点击“操作”按钮。通过按下“记录”按钮开始记录测量数据。使用参考样品（如血管紧张素II）测量测试光谱，持续约300秒。通过调整清空离子阱信号与触发脉冲喷嘴信号之间的时间延迟，优化信号强度。在时间延迟优化后，移动操纵器至待测样品的位置。单击“记录”按钮，以采集感兴趣时间范围内的质谱数据。测量完成后，将相应的数据集加载到数据分析程序中，如本例中所示的参考测量。使用鼠标的右键在色谱图中选择感兴趣的时段。平均光谱将在单独的窗口中显示。单击“导出为ASCII文件”以将光谱导出为数据文件，以便在任意选定的程序中进行进一步处理。随着样品被加热至约140摄氏度，血管紧张素II样品的DINeC质谱随时间发生变化。当温度达到最终值后，质荷比（M/Z）为1047的质子化分子峰下降，并出现新的峰。该过程在以下三个图中进行了总结。在质荷比（M/Z）为932、1012和1029处出现的额外峰均清晰可见。反应动力学分析表明，质荷比为1029的组分是一个中间产物，其强度先升高后降低，随后进一步分解为更小的片段。DINeC 最重要的特点包括解吸过程的温和性、高效率以及高表面灵敏度。这些优势均伴随着对样品制备的低要求。因此，DINeC 可广泛应用于多种不同类型的样品，从有机树皮材料到亚单层区域的复杂表面吸附物均可适用。在所有情况下，均可实时获得完整的化学信息。

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离子淌度质谱法（IMS）是质谱技术在生物分子表征方面的一种有益补充，尤其因为它对同分异构现象具有敏感性。本方案描述了一种串联离子淌度（IMS/IMS）实验，可实现对特定分子的选择性分离，并生成其碎片的淌度谱图。...

使用环形离子淌度质谱仪进行串联离子淌度实验

精确质量测定是蛋白质研究过程中的重要步骤。基质辅助激光解吸/电离（MALDI）质谱（MS）可用于此类测定，其主要优势在于对盐类、去污剂和污染物具有良好的耐受性。本文展示了一种利用MALDI-MS分析分子量大于100...

基质辅助激光解吸/电离飞行时间（MALDI-TOF）质谱法分析完整蛋白质（分子量大于100 kDa）

了解DINeC聚类诱导解吸/电离质谱法用于生物分子表面分析。该技术利用SO₂中性簇实现软解吸，可实时检测肽和蛋白质的化学变化，样品制备要求低，适用于多种复杂表面分子研究。

利用团簇诱导解吸/电离质谱法分析表面复杂分子及其反应

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