Name: 使用酵母毒性和抑制器屏幕识别细菌效应蛋白的宿主通路 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: 学习利用酵母毒性和抑制子筛选技术鉴定细菌效应蛋白靶向的宿主通路，以沙眼衣原体为模型揭示病原体与宿主相互作用的分子机制，为开发新型抗菌治疗策略提供重要依据。

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感谢 Shelby Andersen、Abby McCullough 和 Laurel Woods 在这些技术操作中的协助。本研究由爱荷华大学微生物学与免疫学系为 Mary M. Weber 提供的启动资金资助。

1. 培养基与试剂的准备
注意：平板应在检测当天之前制备，可保存1个月。培养基和试剂可随时配制，可保存1个月。
<ol>
	<li>在1,000 mL烧杯中，将100 g D-(+)-葡萄糖溶于800 mL蒸馏水中，配制1 L葡萄糖溶液（10% w/v）。用蒸馏水定容至1 L。经0.2 μm滤膜过滤。 &#181;m 无菌滤器过滤至无菌的 1 L 培养基储存瓶中。</li>
	<li>在1 L烧杯中，将100 g D-(+)-半乳糖溶于800 mL蒸馏水中，配制1 L的10% (w/v) 半乳糖溶液。用蒸馏水定容至1 L，经0.2 μm滤膜过滤。 &#181;m 无菌滤器过滤至一个无菌的 1,000 mL 培养基储存瓶中。</li>
	<li>通过将 10 g 酵母提取物、20 g 胰蛋白胨、20 g 葡萄糖和 20 g 琼脂溶解于 1,000 mL 蒸馏水中，制备 1 L 酵母提取物胰蛋白胨葡萄糖（YPD）琼脂。121 °C 高压灭菌 20 min，然后在 56 °C 水浴中冷却 &#730;将水浴冷却至室温，每块培养皿倒入约 20 mL 培养基，共制备 100 mm 培养皿。</li>
	<li>准备 1 L YPD 通过溶解于肉汤 10 g 酵母提取物，20 g 蛋白胨，20 g 葡萄糖溶于 1,000 mL 蒸馏水中。121°C 高压灭菌 20 分钟。</li>
	<li>制备合成缺陷型（SD）尿嘧啶（Ura）培养基-）葡萄糖琼脂。每1 L，将6.7 g无氨基酸酵母氮源基础、1.9 g无尿嘧啶脱落补充剂和15 g琼脂溶解于800 mL蒸馏水中，121℃灭菌20 min，56℃冷却 &#730;C 水浴，直至温度降至约 50−60 &#730;C. 使用50 mL血清移液管或无菌量筒，加入步骤1.1中配制的葡萄糖溶液200 mL。轻轻旋转混匀，或置于搅拌台上混合。每块培养皿倒入约20 mL培养基，分装至100 mm培养皿中。</li>
	<li>制备合成缺陷型（SD）尿嘧啶（Ura）培养基-）半乳糖琼脂。配制1 L时，将6.7 g不含氨基酸的酵母氮源基础培养基、1.9 g不含尿嘧啶的 dropout 补充剂和15 g琼脂溶解于800 mL蒸馏水中，121°C高压灭菌20分钟，56°C冷却 &#730;C 水浴，直至温度升至约 50−60 &#730;C. 使用50 mL血清移液管或无菌量筒，加入2.1.2步制备的半乳糖溶液200 mL，轻轻旋转混匀或置于搅拌台上混合。每块培养皿倒入约20 mL培养基，分装至100 mm培养皿中。</li>
	<li>制备合成缺陷型培养基（SD）尿嘧啶（Ura）-) 葡萄糖培养液。配制 1 L 时，将 6.7 g 无氨基酸酵母氮源基础和 1.9 g 无尿嘧啶的 dropout 补充剂溶解于 800 mL 蒸馏水中。121°C 高压灭菌 20 分钟，于 56°C 冷却 &#730;C水浴，直至温度达到约50−60 &#730;C. 使用50 mL血清移液管或无菌量筒，加入2.1步骤中配制的200 ml葡萄糖溶液。</li>
	<li>制备合成缺陷型培养基（SD）尿嘧啶（Ura）-) 亮氨酸（Leu-）葡萄糖琼脂。每1升，将6.7 g无氨基酸酵母氮源基础、1.9 g无尿嘧啶、亮氨酸和色氨酸的 dropout 补充剂、15 g琼脂和0.076 g色氨酸溶于800 mL蒸馏水中。121℃高压灭菌20分钟，56℃冷却 &#730;C 水浴，直至温度降至约 50−60 &#730;C. 使用50 mL刻度移液管或无菌量筒，加入2.1步骤中配制的200 mL葡萄糖溶液。每皿倒入约20 mL培养基，分装至100 mm培养皿中。</li>
	<li>制备合成缺陷型（SD）尿嘧啶（Ura）培养基-亮氨酸（Leu）-) 半乳糖琼脂。每1 L，将6.7 g不含氨基酸的酵母氮源基础培养基、1.9 g不含尿嘧啶、亮氨酸和色氨酸的 dropout 补充剂、15 g琼脂和0.076 g色氨酸溶于800 mL蒸馏水中。121°C高压灭菌20 min，然后在56°C下冷却 &#730;C 水浴，直至温度降至约 50−60 &#730;C. 使用50 mL血清移液管或无菌量筒，加入步骤1.2中配制的200 mL半乳糖溶液。通过轻轻旋转混匀或置于搅拌器上充分混匀。每板加入约20 mL培养基，倒入100 mm培养皿中。</li>
	<li>制备合成缺陷型（SD）尿嘧啶（Ura）培养基-）亮氨酸（Leu-）葡萄糖培养基。每1升：将6.7 g无氨基酸酵母氮源基础、1.9 g无尿嘧啶、亮氨酸、色氨酸的营养缺陷型补充剂以及0.076 g色氨酸溶于800 mL蒸馏水中。121℃高压灭菌20分钟，置于56−60℃冷却 &#730;C 水浴，直至温度约为 50 &#730;C. 使用50 mL血清移液管或无菌量筒，加入2.1步骤中配制的200 mL葡萄糖溶液。</li>
	<li>准备 聚乙二醇（PEG） 溶液。加入50% w/v的聚乙二醇3350至蒸馏水中。经高压灭菌后使用。</li>
	<li>将10.2 g乙酸锂二水合物溶于200 mL蒸馏水中，配制1 M乙酸锂（LiAc）溶液。经高压灭菌后保存。</li>
	<li>准备鲱鱼精子DNA。用蒸馏水将10 mg/mL的鲱鱼精子DNA稀释至2 mg/mL。在100℃加热 &#730;5分钟内冷却至C，然后立即置于冰上5分钟。</li>
</ol>
2. 将目的基因克隆至酵母毒性质粒 pYesNTA-Kan 中
注意：目前已有多种酵母毒性载体在商业和学术领域可获得。只要表达目标效应蛋白的质粒使用尿嘧啶以外的营养缺陷型筛选标记以及氨苄青霉素（BlaR）以外的抗生素抗性标记，酵母抑制子筛选即可与其中许多载体联合使用。本研究采用了一种改良的 pYesNTA 载体4,5，该载体包含卡那霉素抗性盒，便于对潜在抑制子进行筛选。克隆方案必须确保效应蛋白与半乳糖启动子（Gal promoter）和 His-标签（His-Tag）保持正确的阅读框。实验中以沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis）包涵体膜蛋白 CT229 作为这些检测的概念验证模型。
<ol>
	<li>根据制造商说明，使用CT229 +1 Kpn F（CCGGTACCAATGAGCTGTTCTAATGTTAATTCAGGT）和CT229 XhoI R（CCCTCGAGTTTTTTACGACGGGATGCC）引物，通过PCR扩增C. trachomatis 基因组DNA中的CT229。PCR反应条件如下：（1）98 °C 预变性30 s；（2）98 °C 变性10 s，55 °C 退火30 s，72 °C 延伸2 min；（3）重复步骤（2）共25个循环；（4）72 °C 终延伸10 min；（5）4 °C 保存。</li>
	<li>取5 µL PCR产物在1%琼脂糖凝胶上进行电泳分析（图1）。</li>
	<li>使用PCR纯化试剂盒，按照制造商说明对剩余的45 µL DNA进行纯化。</li>
	<li>在37 °C水浴中，使用KpnI-HF和XhoI-HF酶切50 µL纯化后的PCR插入片段和pYesNTA-Kan质粒（图2），反应1小时。 
	注：对于pYesNTA-Kan质粒，使用5 µg质粒DNA，加入5 µL KpnI-HF、5 µL XhoI-HF和6 µL缓冲液，总体积为60 µL；对于插入片段，将全部50 µL纯化后的PCR产物进行酶切，加入2 µL KpnI-HF、2 µL XhoI-HF和6 µL缓冲液。</li>
	<li>将整个质粒酶切产物在1%琼脂糖凝胶上电泳。使用凝胶回收试剂盒，按照制造商说明对酶切后的质粒进行纯化。</li>
	<li>使用PCR纯化试剂盒，按照制造商说明对酶切后的PCR插入片段进行纯化。</li>
	<li>将插入片段克隆至pYesNTA-Kan载体中，反应体系包括：2 µL pYesNTA-Kan（步骤2.5产物）、2 µL DNA连接酶缓冲液、1 µL T4 DNA连接酶和15 µL插入片段（步骤2.6产物）。室温孵育1小时。</li>
	<li>将整个连接反应体系加入50 µL E. coli 感受态细胞中，进行转化反应。</li>
	<li>将全部转化反应产物涂布于含有100 µg/mL羧苄青霉素的LB平板上。</li>
	<li>挑取三个单菌落，分别接种于10 mL含100 µg/mL羧苄青霉素的LB培养基中，37 ˚C、150 rpm振荡培养过夜。</li>
	<li>使用质粒小提试剂盒，按照制造商说明提取质粒DNA。</li>
	<li>使用基因特异性引物（步骤2.1）对提取的质粒进行测序验证。</li>
</ol>
3. 在酵母中检测目的蛋白的毒性
<ol>
	<li>划线接种 酿酒酵母 YPD 上的 W303 琼脂 （步骤 1.3）以获得单菌落。在 30 ℃ 培养 &#176;C 培养 24 小时。</li>
	<li>从琼脂平板（步骤 3.1）中挑取单菌落，接种于 10 mL YPD 液体培养基（步骤 1.4）中。30 ℃ 培养 &#176;在150 rpm振荡条件下过夜培养。</li>
	<li>将0.5 mL过夜培养物加入10 mL YPD肉汤（步骤1.4）中，于30 °C培养 &#176;30°C 摇床培养，转速 150 rpm，持续 4 小时。
	<ol>
		<li>将10 mL培养液在3,000 x g离心收集菌体 g 4 分钟内 10 次 &#176;C.</li>
		<li>将沉淀重悬于 1 mL 无菌水中，转移至微量离心管中，在 3,000 x g 室温下持续 1 分钟。</li>
		<li>将沉淀重悬于 1 mL 1 mM 醋酸锂（LiAc）中，于 3,000 x g 室温下持续 1 分钟。</li>
		<li>重复使用LiAc洗涤2次。</li>
		<li>去除上清液，将沉淀重悬于 2.4 mL 的 50% 聚乙二醇 3350。添加 360 &#181;1 M LiAc 溶液，500 L &#181;2 毫克/毫升鲱鱼精子 DNA 的 L，以及 400 &#181;升无菌水 
		注：此量适用于20次转化。</li>
		<li>加入180 &#181;来自步骤 3.3.5 的转化混合物 L 至含有 5 的微量离心管中 &#181;来自步骤 2.12 的 pYesNTA-Kan CT229 质粒 DNA 的 L（100−500 ng）</li>
		<li>在30℃水浴中孵育 &#176;30 分钟，37°C</li>
		<li>在42℃水浴中孵育 &#176;30分钟</li>
		<li>3,000 x g 离心成团 g 室温下持续 1 分钟。</li>
		<li>用移液器移除转化混合物。将沉淀重悬于 100 &#181;L 的无菌水。将转化产物涂布于 SD Ura 培养基上- 含葡萄糖的琼脂（步骤 1.5）</li>
		<li>在 30 ℃ 下孵育平板 &#730;37 °C 培养 48 小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>接种5 mL SD Ura培养基- 含葡萄糖的培养基（步骤 1.7）中接种平板上的单个菌落，30 ℃过夜培养 &#176;在150 rpm振荡条件下培养。同时设置仅含空载体的酵母转化子作为阴性对照。
	<ol>
		<li>加入180 &#181;将无菌水加入96孔板的5个孔中（A2−A6）。</li>
		<li>涡旋振荡过夜培养物以混匀。</li>
		<li>加入180 &#181;向第一个孔（A1）加入1 L酵母。进行10倍系列稀释（共六个样品，包括未稀释样品）。</li>
		<li>使用多通道移液器，点样 5 &#181;每种稀释度的 L 加到 SD Ura 上- 葡萄糖（步骤 1.5）和 Ura- 半乳糖（步骤 1.6）琼脂平板。30 ℃ 培养 &#176;37°C 培养 48 小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过比较表达目标效应蛋白的酵母在含半乳糖培养基上的生长情况与仅表达空载体的酵母的生长情况，评估毒性效应。</li>
	<li>通过Western blotting验证His标签融合蛋白的表达。</li>
</ol>
4. 用酵母基因组文库转化有毒酵母
<ol>
	<li>取1 mL步骤3.4的菌种接种于100 mL SD Ura- 葡萄糖培养液（步骤1.7）中，于30 °C、150 rpm振荡条件下培养16−24小时。将900 mL SD Ura- 葡萄糖培养液置于30 °C过夜预热。</li>
	<li>将100 mL过夜培养物全部加入预热的1 L三角瓶中，在30 °C、150 rpm振荡条件下继续培养4−5小时。
	<ol>
		<li>在4 °C条件下，以6,000 × g离心10分钟，收集菌体。</li>
		<li>弃去上清液，用250 mL无菌水重悬菌体沉淀，在4 °C条件下以6,000 × g离心5分钟。</li>
		<li>弃去上清液，用250 mL 1 mM LiAc重悬菌体沉淀，在4 °C条件下以6,000 × g离心5分钟。</li>
		<li>去除LiAc溶液，将菌体沉淀重悬于9.6 mL 50% PEG 3350中，加入1.44 mL 1 M LiAc、2 mL 2 mg/mL鲱鱼精子DNA和50 µg pYep13基因组文库（ATCC 37323），用无菌水定容至15 mL，轻轻颠倒混匀。</li>
		<li>在30 °C水浴中孵育30分钟。</li>
		<li>加入750 µL二甲基亚砜（DMSO）以提高转化效率，随后在42 °C水浴中孵育30分钟，每10分钟轻轻颠倒混匀一次。</li>
		<li>在室温下以3,000 × g离心5分钟，收集酵母菌体。</li>
		<li>弃去上清液，用10 mL无菌水重悬菌体沉淀，在室温下以3,000 × g离心5分钟。</li>
		<li>将菌体沉淀重悬于8 mL无菌水中。</li>
		<li>为测定转化效率，进行1:10梯度稀释，并将每种稀释液各100 µL涂布于SD Ura- Leu- 葡萄糖琼脂平板（步骤1.8）上。</li>
		<li>将200 µL样品涂布于SD Ura- Leu- 半乳糖琼脂平板（步骤1.9）上，共使用50个平板。</li>
		<li>在30 °C培养48−96小时，或直至菌落出现。 
		注：菌落通常在葡萄糖琼脂平板上于48−72小时出现，在半乳糖琼脂平板上于72−96小时出现。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将可能的拯救克隆（潜在抑制子）转接至SD Ura- Leu- 半乳糖琼脂平板（步骤1.9）上进行扩增并制备菌种，于30 °C培养24−48小时。</li>
	<li>取部分转接培养物接种于5 mL SD Ura- Leu- 葡萄糖培养液（步骤1.10）中，在26 °C、150 rpm振荡条件下过夜培养。
	<ol>
		<li>向96孔板的5个孔（A2−A6）中各加入180 µL无菌水。</li>
		<li>涡旋振荡过夜培养物以混匀。</li>
		<li>向第一孔（A1）中加入180 µL酵母菌液，进行1:10连续梯度稀释（共六份样品，包括未稀释样品）。</li>
		<li>使用多通道移液器，将每种稀释液各5 µL点样于SD Ura- 葡萄糖和SD Ura- 半乳糖琼脂平板上。以仅表达毒性效应蛋白的酵母作为对照。</li>
		<li>在30 °C培养48小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>比较仅表达毒性效应蛋白的酵母与含有潜在抑制子的酵母的生长情况。仅保留与单独表达效应蛋白的酵母相比毒性显著降低的潜在抑制子进行后续实验。</li>
</ol>
5. 鉴定并验证抑制子
<ol>
	<li>取步骤 4.4 中的酵母 100 µL 接种于 5 mL SD Ura- Leu- 葡萄糖培养液（步骤 1.10）中，于 30 °C、150 rpm 振荡条件下过夜培养。
	<ol>
		<li>在室温下以 3,000 x g 离心 2 分钟收集酵母细胞，用移液器小心弃去上清液。</li>
		<li>按照试剂盒说明书，使用酵母质粒小量提取试剂盒分离质粒。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将分离得到的质粒转化至 E. coli 感受态细胞中，将全部转化产物涂布于含 100 µg/mL 羧苄青霉素的 LB 琼脂平板上，于 37 °C 培养 24 小时。</li>
	<li>从平板上挑取三个单菌落，接种于 10 mL 含 100 µg/mL 羧苄青霉素的 LB 液体培养基中，于 37 °C、150 rpm 振荡条件下过夜培养。
	<ol>
		<li>在室温下以 3,000 x g 离心 10 分钟收集菌体，按照试剂盒说明书使用质粒小提试剂盒提取质粒。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照本方案第 3 部分的步骤，将步骤 5.3.1 中提取的质粒重新转化至具有毒性的酵母菌株中。
	<ol>
		<li>从转化平板上挑取单菌落接种于 5 mL SD Ura- Leu- 葡萄糖培养液中，于 30 °C、150 rpm 振荡条件下过夜培养。</li>
		<li>点样至 Ura- Leu- 葡萄糖和半乳糖琼脂平板，以确认毒性被抑制。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用 pYep13 F（ACTACGCGATCATGGCGA）和 pYep13 R（TGATGCCGGCCACGATGC）引物进行测序，以鉴定酵母 ORF。</li>
</ol>

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作者声明不存在任何竞争性经济利益。

本实验方案详细阐述了利用改良的酵母毒性及抑制子筛选方法，鉴定被细菌效应蛋白靶向的宿主生物通路的逐步操作流程。所使用的酵母菌株S. cerevisiae W303对尿嘧啶和亮氨酸均为营养缺陷型。利用该菌株的尿嘧啶营养缺陷特性，筛选携带目标蛋白的pYesNTA-Kan载体；利用其亮氨酸营养缺陷特性，筛选携带酵母基因组文库的pYep13载体。酵母基因组文库质粒包含3−13个开放阅读框（ORF），因此需将每个ORF单独克隆至p415-ADH载体6或类似载体中，并重新转化至具有毒性的酵母菌株中，以确定哪一个才是真正的抑制子。通常可鉴定出多个代表宿主生物通路的抑制子。这些抑制子有时可能是目标细菌蛋白的直接结合伴侣，但并非总是如此。&#160;
构建携带目标细菌蛋白的酵母克隆是首要关键步骤，应尽快采取充分措施以保持这些克隆的完整性，因为即使未有意添加半乳糖进行诱导，携带毒性蛋白的酵母也会受到强烈的负向选择压力，可能导致质粒丢失。即使在缺乏营养的选择性培养基上维持培养，偶尔仍会发生质粒丢失现象。已有研究报道一种方法，通过将载体线性化...

最早报道的类似本实验方案的研究描述了嗜肺军团菌（Legionella pneumophila）IV型效应蛋白SidD，该蛋白是一种能够修饰Rab1的去AMP化酶1。此后，类似技术被用于表征多种嗜肺军团菌（L. pneumophila）效应蛋白1,2,3。该检测方法随后被改进，用于分析贝氏柯克斯体（Coxiella burnetii）IV型效应蛋白4，最近该技术的应用范围进一步拓展至沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis）包涵体膜蛋白的表征研究5。
该实验方案可分为两个主要部分：1）酵母毒性筛选，即在酵母中表达目标细菌效应蛋白，并筛选表现出毒性表型（以生长缺陷为特征）的克隆；2）酵母抑制子筛选，即在有毒性表型的菌株中表达酵母基因组文库，以抑制该毒性表型。因此，毒性筛选旨在识别当目标细菌效应蛋白过表达时表现为生长缺陷的毒性表型。成功转化并表达该细菌效应蛋白的毒性克隆将被筛选并保留，用于下一步实验。第二步主要是在有毒性表型的酵母克隆中过表达一个部分酶切的酵母基因组文库。建议用于本方案的酵母基因组文库质粒包含5−20 kb的插入片段，通常对应于平均基因大小约为1.5 kb的3−13个酵母开放阅读框（ORF），覆盖整个酵母基因组约10倍。该部分实验被称为抑制子筛选，其目标是抑制细菌效应蛋白的毒性。从酵母中分离出潜在的抑制性质粒，进行测序，并鉴定出具有抑制功能的ORF。抑制子筛选的理论基础在于，效应蛋白会结合、相互作用或过度占用其所靶向的宿主通路中的组分，而过量提供这些宿主蛋白可恢复通路功能，从而挽救毒性效应及生长缺陷。因此，所鉴定出的能够抑制毒性的ORF通常代表了同一宿主通路中的多个组分。随后需进行正交实验，以验证细菌效应蛋白确实与所推断的通路发生相互作用。当鉴定出如网格蛋白或肌动蛋白等结合伴侣时，此类验证尤为必要，因为这些蛋白参与多种宿主细胞过程。进一步的实验可揭示该效应蛋白在感染过程中的生理功能。此外，毒性筛选与抑制子筛选也是解析那些无法通过免疫共沉淀检测到与宿主蛋白发生足够亲和力结合、或通过“酶促打击即逃”方式与宿主发生瞬时相互作用（此类相互作用可能无法被酵母双杂交筛选检测到）的细菌效应蛋白生理功能的有力工具。
尽管抑制子筛选是一种揭示细菌效应蛋白与宿主通路之间潜在生理相互作用的有力方法，但前提是该细菌效应蛋白必须在酵母中引起生长缺陷，否则将其用于抑制子筛选将无实际意义。此外，毒性表型必须导致至少2−3个log10的生长下降，否则将难以鉴定出抑制子。如果实验室具备细胞培养条件，可在HeLa等常见细胞系中检测效应蛋白的毒性，这通常有助于判断是否值得进一步开展酵母毒性筛选。在HeLa细胞中异源表达效应蛋白所引发的毒性，有时与用于这些筛选的酵母菌株中的毒性表现出高度相关性4。HeLa细胞中应激的可观察特征包括应力纤维消失、细胞从培养板脱落以及提示凋亡的细胞核浓缩。在HeLa细胞中出现任何可视化的应激迹象，均表明该目标蛋白是诱导酵母生长缺陷的良好候选者，因为酵母增殖速度更快，对关键通路的扰动也更为敏感。
需要注意的是，抑制子筛选并不总是能鉴定出效应蛋白的宿主结合伴侣作为抑制子，但仍可揭示被靶向的宿主通路中的关键组分，从而提供细菌效应蛋白劫持的生物学过程的整体图景。表面上看，这似乎违反直觉，因为过量提供效应蛋白的结合伴侣应能挽救生长缺陷。在鉴定C. trachomatis效应蛋白CT229（CpoS）所靶向通路的研究中，该蛋白在感染过程中可结合至少10种不同的Rab GTP酶5，但其任何Rab结合伴侣均未能抑制CT229的毒性。然而，研究鉴定出多个参与网格蛋白包被小泡（CCV）运输的抑制子，进而推动后续工作证实CT229特异性地破坏Rab依赖性的CCV运输。类似地，在研究C. burnetii效应蛋白Cbu0041（CirA）时，鉴定出若干可挽救酵母生长缺陷的Rho GTP酶，并进一步发现CirA作为RhoA的GTP酶激活蛋白（GAP）发挥作用4。
酵母抑制子筛选在揭示细菌效应蛋白所靶向的宿主通路方面的价值不可估量，其他致力于表征胞内细菌效应蛋白的研究人员亦可从这些技术中获益良多。当免疫共沉淀和/或酵母双杂交筛选未能找到结合伴侣时，这些检测方法尤为有用，可帮助阐明细菌效应蛋白所靶向的生物学通路。本文提供了用于鉴定胞内细菌效应蛋白所靶向宿主生物通路的毒性及抑制子筛选的详细实验方案，以及在使用这些检测方法时常见的一些障碍及其相应的解决方案。

<table><tbody><tr><td>琼脂</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2641500</td><td></td></tr><tr><td>半乳糖</td><td>MilliporeSigma</td><td>G0750-1KG</td><td></td></tr><tr><td>GeneJet 凝胶回收试剂盒</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>K0691</td><td></td></tr><tr><td>GeneJet PCR 纯化试剂盒</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>K0701</td><td></td></tr><tr><td>GeneJet 质粒小提试剂盒</td><td>Thermo</td><td>K0503</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>MilliporeSigma</td><td>G8270-1KG</td><td></td></tr><tr><td>鲱鱼精子 DNA</td><td>Promega</td><td>D1811</td><td></td></tr><tr><td>KpnI-HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3142S</td><td></td></tr><tr><td>乙酸锂二水合物</td><td>MilliporeSigma</td><td>L6883-250G</td><td></td></tr><tr><td>蛋白胨</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phusion 高保真 DNA 聚合酶</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530</td><td></td></tr><tr><td>聚乙二醇 3350</td><td>MilliporeSigma</td><td>1546547-1G</td><td></td></tr><tr><td>pYep13</td><td>ATCC</td><td>37323</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 连接酶</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>色氨酸</td><td>MilliporeSigma</td><td>470031-1G</td><td></td></tr><tr><td>XhoI-HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R0146S</td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1422-500</td><td></td></tr><tr><td>酵母小提试剂盒</td><td>Zymo</td><td>D2001</td><td></td></tr><tr><td>无氨基酸酵母氮源基础培养基</td><td>MilliporeSigma</td><td>Y0626-250G</td><td></td></tr><tr><td>酵母合成缺陷型培养基补充剂</td><td>MilliporeSigma</td><td>Y1501-20G</td><td>不含尿嘧啶</td></tr><tr><td>酵母合成缺陷型培养基补充剂</td><td>MilliporeSigma</td><td>Y1771-20G</td><td>不含尿嘧啶、亮氨酸、色氨酸</td></tr></tbody></table>

利用酵母毒性及抑制子筛选鉴定细菌效应蛋白靶向的宿主通路

Identification of Host Pathways Targeted by Bacterial Effector Proteins using Yeast Toxicity and Suppressor Screens

胞内细菌会向宿主细胞质中分泌一类称为效应蛋白的毒力因子，这些效应蛋白可作用于宿主蛋白和（或）其相关的生物学通路，从而有利于细菌的生存。随着细菌基因组测序技术的进步以及能够通过计算机预测分泌候选基因和（或）真核样结构域编码基因的算法的出现，鉴定潜在细菌效应蛋白的工作已变得更加可行。然而，鉴定这些重要的毒力因子仅是研究的第一步。更进一步的目标是确定效应蛋白的分子功能，并阐明其与宿主之间的相互作用机制。近年来，酵母双杂交筛选以及结合质谱分析的大规模免疫共沉淀技术，已帮助研究人员鉴定出许多蛋白质-蛋白质相互作用。尽管发现宿主结合伴侣蛋白是揭示细菌效应蛋白分子功能的关键第一步，但有时这些宿主蛋白本身具有多种生物学功能（例如肌动蛋白、网格蛋白、微管蛋白），或者细菌蛋白可能并不直接与宿主蛋白发生物理结合，这使得研究人员难以获得关于被操控宿主通路的精确信息。为此，一种经过改良的酵母毒性筛选方法结合抑制子筛选已被开发出来，用于鉴定受细菌效应蛋白影响的宿主通路。该毒性筛选依赖于效应蛋白干扰宿主生物学通路而在酵母中引发的毒性效应，这种效应通常表现为生长缺陷。通过表达酵母基因组文库，可鉴定出能够抑制细菌效应蛋白毒性的宿主因子，从而识别出效应蛋白所靶向的通路中的相关蛋白。本实验方案详细描述了毒性筛选和抑制子筛选的具体操作步骤。这些技术可在任何具备分子克隆及酵母和Escherichia coli培养能力的实验室中实施。

在进行实际的酵母抑制子筛选之前，必须先检测目标效应蛋白在酵母中的毒性。这可通过在半乳糖诱导型启动子控制下于酵母中表达目标蛋白来实现。应首先比较葡萄糖培养条件（非诱导条件）下的生长情况，以确保毒性确实源于目标蛋白的表达，而非由一般性缺陷引起。如图3所示，毒性表现为菌落较小和/或生长减缓。酵母生长量下降2−3个数量级，是进行酵母抑制子筛选的理想条件。
如图4所示，利用本方案部分所述方法，毒性与抑制子筛选可在八个步骤内完成。将目的基因克隆至合适的载体中1，并将所得构建体转化入酵母以评估其毒性。本研究以CT229为目的基因，pYesNTA-Kan为载体。此外，通过Western blotting确认了His标签融合蛋白的表达。理想情况下，应在含半乳糖培养基上生长的酵母中观察到2−3个对数级的生长抑制。若目的蛋白对酵母具有毒性（图3和<strong class="xf...

细菌病原体将蛋白质分泌到宿主中，以靶向关键的生物学过程。确定细菌效应蛋白所靶向的宿主通路，是阐明分子致病机制的关键。本文介绍了一种利用改良的酵母抑制和毒性筛选方法，以揭示有毒细菌效应蛋白所靶向的宿主通路。

细胞内细菌将一类称为效应蛋白的毒力因子分泌到宿主细胞质中，这些效应蛋白可作用于宿主蛋白和/或其相关...

胞内细菌会向宿主细胞分泌效应蛋白，这些蛋白可操控宿主的生物学通路，以促进病原体的存活。揭示效应蛋白的宿主靶点对于理解沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis）等胞内病原体至关重要。酵母毒性及抑制子筛选可为细菌效应蛋白的天然生物学靶点提供关键线索，尤其在尚未明确其结合伴侣的情况下，这类方法尤为有用。本文以酵母毒性及抑制子筛选实验为例，展示其在筛选沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis）效应蛋白中的应用，但该技术也已被用于军团菌（Legionella pneumophila）和贝氏柯克斯体（Coxiella burnetii）效应蛋白的功能表征。首先，取单个转化了含效应蛋白质粒的酵母菌落，接种于5 mL单缺培养基中。以仅含空载体的转化酵母作为阴性对照，于30°C条件下振荡培养过夜。第二天，向96孔板的A2至A6孔中各加入180微升无菌水。涡旋振荡过夜培养物，并向A1孔中加入180微升酵母。随后用无菌水在各孔中对酵母进行连续稀释。使用多通道移液器将每种稀释液各5微升点样至单缺葡萄糖和单缺半乳糖琼脂平板上，于30摄氏度培养48小时。孵育结束后，通过比较在含半乳糖培养基上表达效应蛋白的酵母与仅表达空载体的酵母的生长情况，目视评估毒性。取100毫升单缺培养液，接种1毫升先前制备的酵母菌种，于30°C、150 RPM振荡条件下孵育16至24小时。次日，将100毫升过夜培养物全部加入900毫升预热的单缺培养液中，于30°C振荡培养4至5小时。孵育结束后，在 4 摄氏度下以 6,000 × g 离心 10 分钟，收集菌体沉淀。弃去上清液，并将沉淀重悬于 250 毫升无菌水中。重复离心操作，弃去上清液。然后将沉淀重悬于250毫升1毫摩尔乙酸锂溶液中。通过离心收集菌体沉淀，弃去乙酸锂溶液，再将沉淀重悬于9.6毫升50% PEG 3350溶液中。随后加入文中所述的转化试剂，并用无菌水轻轻颠倒混匀，调节总体积至15毫升。将混合物在30摄氏度下孵育30分钟。然后加入750 µL DMSO，并在42摄氏度水浴中继续孵育30分钟。在热激前加入DMSO对于获得高转化效率至关重要。孵育结束后，以3,000 × g离心5分钟收集酵母菌体。弃去上清液，用10毫升无菌水洗涤菌体沉淀，然后再次离心以收集酵母菌体。将菌体沉淀重悬于8毫升水中。通过将样品稀释十倍后，取每种稀释液100微升涂布于双缺落琼脂平板上，以测定转化效率。然后取200微升样品涂布于双缺落半乳糖琼脂平板上，于30摄氏度培养48至96小时，或直至菌落出现。菌落出现后，将其转接到双缺落半乳糖琼脂平板上，并继续培养24至48小时。取部分菌块接种于5毫升双缺培养液中，26摄氏度、150转/分钟振荡培养过夜。次日，向96孔板的五个孔（从A2孔开始）各加入180微升无菌水。将过夜培养物充分涡旋混匀，取180微升酵母菌液加入A1孔，利用A2至A6孔中的无菌水进行连续梯度稀释。将各稀释液分别取5微升点样于单缺葡萄糖和单缺半乳糖琼脂平板，注意同时设置仅含毒性效应物的对照组。将平板在30摄氏度下孵育48小时，然后将仅含毒性效应因子的酵母生长情况与含有潜在抑制因子的酵母生长情况进行比较。对于相较于单独毒性效应因子表现出毒性减弱的候选抑制因子，按照论文中的指示提取质粒，并重新转化至毒性酵母中。从转化平板上挑取单菌落，接种于双缺失葡萄糖液体培养基中。37℃过夜培养，并点种于双缺葡萄糖和半乳糖琼脂平板上，以确认毒性被抑制。在进行酵母抑制子筛选之前，需先检测目的效应蛋白在酵母中的毒性。将目的蛋白在半乳糖诱导型启动子的控制下于酵母中表达，比较其在半乳糖培养基与葡萄糖培养基中的生长情况。在检测CT229的毒性时，观察到菌落变小且生长受到抑制。理想情况下，应观察到2至3个数量级的下降，方可进行酵母抑制子筛选。抑制子筛选通过将有毒性菌株转化入酵母基因组文库pYAP 13，并将转化子接种至半乳糖琼脂平板上进行。将获得的抑制子克隆点种于双缺失半乳糖琼脂培养基上，以确认其对毒性的抑制作用。其中，pSup1 和 pSup2 能够抑制效应蛋白的毒性，而 pSup3 则不能。这些实验步骤不仅需要细致的操作，还需进行关键的前期准备工作，包括在实验开始前准备好大量培养基和培养板。一旦鉴定出抑制因子，即可开展实验以验证其与目标效应蛋白的相互作用，包括下拉实验、免疫荧光共定位、效应蛋白敲除或对筛选中鉴定出的宿主因子进行敲减。该技术在衣原体效应蛋白研究中的应用，使得效应蛋白的初步表征得以快速完成，并有助于我们将研究重点集中于阐明介导宿主-病原体相互作用的潜在分子机制。

identification-host-pathways-targeted-bacterial-effector-proteins

Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

使用酵母毒性和抑制器屏幕识别细菌效应蛋白的宿主通路

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学习利用酵母毒性和抑制子筛选技术鉴定细菌效应蛋白靶向的宿主通路，以沙眼衣原体为模型揭示病原体与宿主相互作用的分子机制，为开发新型抗菌治疗策略提供重要依据。

利用酵母毒性及抑制子筛选鉴定细菌效应蛋白靶向的宿主通路

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