使用酵母毒性和抑制器屏幕识别细菌效应蛋白的宿主通路
October 25th, 2019
细菌病原体将蛋白质分泌到宿主中，以关键生物过程为目标。识别细菌效应蛋白所针对的宿主通路是解决分子发病机制的关键。这里，描述了一种使用改性酵母抑制剂和毒性筛分的方法，以阐明有毒细菌效应蛋白所针对的宿主通路。
细胞内细菌将效应蛋白分泌到宿主中，这些宿主可以操纵生物通路，促进病原体的生存。揭示效应器的宿主靶点对于了解细胞内病原体（如沙眼衣原体）至关重要。酵母毒性和抑制剂筛选可以提供有关细菌效应蛋白的自然生物靶点的关键见解，当结合伙伴未知时，可以特别有用。
我们演示酵母毒性和抑制剂检测在这里筛选衣原体沙眼效应蛋白， 但这项技术也已被用于定性军团菌嗜血杆菌和科西拉燃烧剂效应剂.首先接种五毫升的单辍汤与酵母的单组转化与含有质粒的效应蛋白。使用酵母单独与载体转化作为负对对，并在30摄氏度的温度下孵育孵化，同时摇动。
第二天，通过96孔板的 A6 井向 A2 中加入 180 微升无菌水。漩涡过夜培养，并添加180微升酵母到井 A1。然后连续用水稀释井中的酵母。使用多通道移液器将每次稀释的五微升分液检测到单滴出葡萄糖和单滴出半乳糖板上，并在 30 摄氏度下孵育板 48 小时。
孵育后，通过比较酵母的生长，将含有半乳糖的介质上生长的酵母的生长与仅表达载体的酵母的生长进行比较，直观地评估毒性。接种100毫升的单滴出汤与先前准备的酵母库存的1毫升，并在30摄氏度下孵育16至24小时，在150 RPM下摇晃。第二天，将隔夜培养的100毫升加入900毫升预先加热的单滴汤，并在30摄氏度下孵育烧瓶4至5小时，同时摇晃。
孵育后，在摄氏4度下，在6000次g下分粒，10分钟。丢弃上一杯，将颗粒重新在250毫升的无菌水中。重复离心并丢弃上经剂。
然后将颗粒重新在250毫升的一毫升醋酸锂中重新暂停。通过离心对培养物进行颗粒化，去除醋酸锂，并在 9.6 毫升 50%PEG 3350 中重新暂停颗粒。然后添加手稿中描述的转化试剂，并将体积调整为 15 毫升，无菌水轻轻反转以混合。
在30摄氏度下孵育混合物30分钟。然后加入750微升DMSO，在42摄氏度的水浴中孵育30分钟。在热冲击前添加 DMSO 对于实现高转化效率至关重要。
孵育后，在3000次g中离心5分钟，将酵母颗粒为颗粒。丢弃上经剂，用10毫升无菌水清洗颗粒，然后重复离心，使酵母颗粒。将颗粒重新在8毫升水中。
通过将样品稀释 1 至 10，将每次稀释的 100 微升电镀到双滴出的加糖上，确定转化效率。然后板200微升的样品在双辍半乳糖加糖板和孵育板在30摄氏度48至96小时或直到菌落出现。一旦菌落出现，修补他们双辍学半乳糖的阿加，并孵育他们另外24至48小时。
使用部分贴片接种五毫升的双滴出肉汤，并在26摄氏度下孵育孵化，在150 RPM下摇晃。第二天，从 A2 井开始，在 96 孔板的 5 口井中加入 180 微升无菌水。漩涡一夜之间文化混合。将180微升酵母加入井 A1，并使用水在 A2 至 A6 井中连续稀释。在单滴出葡萄糖和单滴出半乳糖板上发现每次稀释的五微升，确保单独包括毒性效应器作为控制。
在30摄氏度下孵育板48小时，然后将酵母的生长与毒性效应器单独与酵母的生长与潜在的抑制器进行比较。要确认与毒性效应器相比毒性降低的抑制剂，请根据手稿指示分离质粒并将其重新转化为有毒酵母。接种双辍糖汤与从转化板的殖民地。
孵育过夜，并发现双辍糖和半乳糖加糖，以确认抑制毒性。在执行酵母抑制器筛选之前，对感兴趣的效应蛋白进行了酵母毒性测试。在乳糖可吸收的促进剂的控制之下，在酵母中表达感兴趣的蛋白质，将乳糖的生长与葡萄糖的生长进行比较。
当CT229被测试毒性时，观察到较小的菌落和生长抑制。理想情况下，应观察到两到三个日志减少，以继续酵母抑制器屏幕。抑制器屏幕通过利用酵母基因组库pYAP 13改变毒株，并在乳糖上电镀转化剂进行。
在双滴出半乳糖剂中发现获得的抑制克隆，以确认抑制毒性。抑制器pSup1和pSup2抑制了效应蛋白的毒性，而pSup3则没有。这些程序需要仔细注意细节，除了关键的准备工作，包括有大量的介质和板准备之前执行实验。
一旦识别抑制剂，就可以进行实验，以验证与利益效应器的相互作用，包括下拉、免疫荧光结肠化、效应器敲除或击除屏幕中确定的宿主因子。这种衣原体效应器技术的发展使得效应蛋白的初次表征得到了加速，并有助于我们集中力量阐明调解宿主病原体相互作用的基本分子机制。
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概览
本文描述了一种使用酵母毒性和抑制剂筛选来识别被毒性细菌效应蛋白靶向的宿主通路的方法。理解这些相互作用对于解决沙眼衣原体等细胞内细菌的分子发病机制至关重要。
关键研究组成部分
科学领域
- 微生物学
- 病原体-宿主相互作用
- 细胞生物学
背景
- 细菌病原体分泌效应蛋白，可以操纵宿主生物通路。
- 识别这些通路对于理解由细胞内细菌引起的疾病至关重要。
- 酵母模型可用于筛选这些效应蛋白的作用。
- 这种方法已应用于各种病原体，包括沙眼衣原体。
研究目的
- 阐明被毒性细菌效应蛋白靶向的宿主通路。
- 提供对发病机制分子机制的见解。
- 展示酵母毒性和抑制剂筛选在该研究领域的实用性。
使用的方法
- 接种转化有效应蛋白质粒的酵母。
- 使用仅转化有载体的酵母作为负控制。
- 在摇晃的情况下以30摄氏度孵育培养物。
- 分析酵母生长和毒性以识别效应蛋白相互作用。
主要结果
- 成功识别了受沙眼衣原体效应蛋白影响的宿主通路。
- 展示了酵母筛选在研究细菌效应蛋白方面的有效性。
- 对各种细菌病原体的生物学靶点有见解。
- 该方法对其他细胞内细菌的潜在应用。
结论
- 酵母毒性和抑制剂筛选是研究细菌效应蛋白的有价值工具。
- 这种方法增强了对病原体-宿主相互作用的理解。
- 使用这种方法进行的进一步研究可能会导致新的细菌感染治疗策略。
常见问题
Executive Industry Relevance
Identifying host pathways manipulated by bacterial effector proteins is critical for de-risking target validation in anti-infective discovery. Yeast toxicity and suppressor screens provide a functional, phenotype-driven approach to pinpoint dysregulated host biology when traditional binding assays fail. This enables mechanistic insight into pathogen virulence factors, supporting early-stage target confidence and portfolio prioritization for intracellular pathogens.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by linking effector toxicity to specific host pathways through suppressor identification.
- Operational Value: Enables functional target validation when effector proteins lack detectable binding partners or interact with multifunctional host proteins.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by revealing pathway-level perturbations rather than isolated protein interactions.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates validated yeast strains expressing effector proteins for reproducible toxicity screening.
- Quantitative Output: Measures growth defect magnitude (e.g., two- to three-log reduction) as a threshold for proceeding to suppressor screens.
- Scalability: Uses 96-well formats and serial dilution spotting for high-throughput suppressor clone evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Applies to intracellular pathogens like Chlamydia trachomatis, Legionella pneumophila, and Coxiella burnetii, supporting translational biomarker alignment.
- Preclinical Continuity: Identifies host factors that, when suppressed, rescue effector toxicity, enabling follow-up validation via pull-downs, colocalization, or knockout studies.
- Risk-Adjusted Advancement: Focuses efforts on effectors with confirmed pathway modulation, reducing late-stage biological attrition.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to inform lead identification by connecting effector expression to host pathway disruption, enabling data-driven target selection.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by linking effector expression to growth defects in yeast, indicating pathway interference.
- Screening: Delivers assay-ready toxic strains and suppressor libraries for identifying host factors that rescue phenotype.
- Analytics: Provides quantitative growth readouts on selective media to compare effector toxicity and suppressor efficacy.
- Translational Research: Connects yeast-identified suppressors to mammalian homologs for preclinical validation in disease-relevant systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for screening effector libraries across multiple intracellular pathogens.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through functional pathway interrogation.
- Operational Value: Standardized toxicity and suppressor screening workflows with defined growth thresholds.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by filtering effectors lacking measurable host pathway impact.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of effector targets based on validated pathway modulation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in yeast molecular cloning, galactose-inducible expression, and plasmid library transformation.
- Dependent on instrumentation for sterile culture handling, centrifugation, and incubation at 30°C with shaking.
- Necessitates cross-team standardization of media preparation, plate spotting, and toxicity scoring criteria.
- Adaptation considerations include promoter compatibility, effector toxicity thresholds, and suppressor validation in mammalian systems.
- Practical limitations include the need for large volumes of media and plates, and potential false negatives if effector expression is toxic to yeast library strains.
