Name: 小鼠体内合成蛋白的定量测量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: 学习在小鼠模型中定量测量脑脊液蛋白水平的方法，以区分血脑屏障损伤与鞘内合成导致的蛋白升高。该方案通过优化采集技术确保样本纯净，为神经疾病研究提供可靠的蛋白质来源分析基础。

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作者感谢达特茅斯比较医学与研究中心（CCMR）工作人员在本研究中对实验小鼠的精心照料。本研究由博恩斯坦研究基金资助。

所有动物实验均采用达特茅斯盖泽尔医学院机构动物护理和使用委员会（IACUC）审查并批准的方案。
1. 体液采集
注意：需要同时采集血清和脑脊液。每种液体的采集均需准备两份方案，分别用于存活期和剖检期。
<ol>
	<li>采用可存活操作程序采集血清和脑脊液 
	注意：对于可存活体液采集，应先采集血清再采集脑脊液，因为血清采集为侵入性较小的操作。脑脊液必须在血清采集后一周内获取。
	<ol>
		<li>通过眶后静脉丛采血获取血清 
		注意：本操作适用于小鼠的可存活采血14。所述方法适用于任何年龄、性别和品系的小鼠。根据IACUC规定，单次采血量不得超过体重的1%，因此建议仅对体重超过15 g的小鼠进行该操作。
		<ol>
			<li>将装有小鼠的笼子从架子上移至合适的工作区域。打开氧气流量计，调节流速至1 L/min，准备麻醉气体设备。</li>
			<li>将动物放入诱导室并紧密关闭盖子。开启异氟烷蒸发器至3.5%，持续观察动物直至其侧卧不动。</li>
			<li>将动物从诱导室中取出，通过脚掌反射（即用力捏压脚垫）评估麻醉深度。在进行操作前确保麻醉充分：对用力捏压无反应表明麻醉深度足够。</li>
			<li>用非优势手的拇指和食指捏住小鼠耳后松弛的皮肤以固定动物。用食指向后牵拉眼球上方皮肤，同时用拇指向后牵拉眼球下方皮肤，使眼球突出。</li>
			<li>将巴斯德移液管尖端插入眼球下方的眼眶内（图1，左图），将管尖朝向眼眶中部约45°方向推进（图1，右图）。在向前推进过程中用手指轻轻旋转移液管。施加轻柔压力后释放，直至血液进入移液管。 
			注意：从此部位单次可采集的最大血量约为体重的1%，例如从20 g小鼠可采集0.2 mL。</li>
			<li>轻柔取出毛细管以避免眼部损伤，并将采集的血液转移至1.5 mL离心管中。闭合眼睑并用纱布施加轻微压力以防止继续出血。待小鼠完全清醒并恢复活动能力（通常为3−5分钟）后，将其放回饲养笼中。</li>
			<li>室温（RT）静置血液30−60分钟使其凝固，然后在4 °C预冷的离心机中以2,000 x g离心10分钟。使用洁净的移液技术，将血清转移至新的、已标记的0.5 mL冻存管中。立即将血清冻存管置于-80 °C冰箱中冷冻保存。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>采用可存活操作程序采集脑脊液 
		注意：本操作为可存活手术，基于Liu和Duff于2008年发表的实验方案15。通过腹腔注射给予氯胺酮（20 mg/mL）、赛拉嗪（0.5 mg/mL）和乙酰丙嗪（0.5 mg/mL）混合麻醉剂对小鼠进行麻醉。
		<ol>
			<li>将装有小鼠的笼子从架子上移至指定的手术工作区。在无菌环境中准备手术空间。确保所有使用的器械和材料在手术前均已灭菌。</li>
			<li>称量小鼠体重并计算所需麻醉剂量（20 g小鼠需0.1 mL麻醉混合液）。腹腔注射麻醉剂16。数分钟后通过捏压脚垫测试小鼠反应以确认麻醉是否充分。如需追加麻醉，可再注射0.01−0.03 mL麻醉混合液。</li>
			<li>使用剪刀或剃毛器在颅骨中线尾端剃除一小块头部区域的毛发，以暴露足够大的脑脊液采集操作区域。将小鼠俯卧位固定于立体定位仪上，并使用耳杆固定头部（图2A）。 
			注意：小鼠体位应使头部与身体形成接近135°的角度（图2A）。动物定位完成后，使用手术巾维持手术区域的无菌环境。推荐使用透明粘性手术巾进行小鼠脑脊液采集，因其可提供更直接且集中的视野。</li>
			<li>用30%双醋酸氯己定擦拭手术区域。使用无菌手术刀在枕骨下方做矢状切口，暴露延髓池上方的肌肉组织。</li>
			<li>使用镊子进行钝性分离，分开皮下组织和肌肉以暴露延髓池（图2B）。使用微型牵开器将肌肉分开（图2B），暴露延髓池上方的硬脑膜层。</li>
			<li>用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）轻轻冲洗以去除可能的血液污染。用无菌棉签吸干硬脑膜表面，然后用30 G针头轻轻穿刺覆盖延髓池的膜。迅速而轻柔地插入一根小型玻璃毛细管以收集脑脊液（图2C）。 
			注意：颅内压使脑脊液自发流入毛细管（图2C）。根据小鼠的年龄和体型，每只小鼠可获得约5−12 µL脑脊液。</li>
			<li>小心地将毛细管从膜上取出。通过聚乙烯管（材料表）将毛细管连接至3 mL注射器，并将采集的脑脊液注入已标记的0.5 mL冻存管中（图2D）。保持冻存管置于冰上。</li>
			<li>使用一次性针头和聚对二氧环己酮缝线（PDS）进行皮下埋线缝合关闭切口17。清除手术区域的干涸血液或组织残留。</li>
			<li>皮下或腹腔注射0.05−0.1 mg/kg盐酸丁丙诺啡作为镇痛治疗16。同时皮下注射1 mL无菌生理盐水以防止脱水。</li>
			<li>将小鼠放回清洁且温暖的笼子中恢复。待小鼠恢复活动能力并能自主接触食物和饮水后，将笼子放回架子上。</li>
			<li>在4 °C预冷的离心机中以1,000 x g离心脑脊液10分钟。通过肉眼观察是否存在黄变以及管底是否有红细胞沉淀，判断血液污染程度。弃去被血液污染的样本。 
			注意：用于校正血液污染样本中脑脊液蛋白含量的公式基于包括脑脊液和血清蛋白含量、红细胞压积（HCT）以及脑脊液和血液中红细胞（RBC）计数在内的参数18。然而，由于小鼠脑脊液样本体积较小，该校正方法难以应用，因此仅能依赖肉眼检查进行判断。</li>
			<li>使用洁净的移液技术，将脑脊液转移至新的0.2 mL冻存管中，弃去含有细胞沉淀的部分。用PBS按1:3比例稀释脑脊液，以减少气溶胶导致的体积损失。立即将脑脊液冻存管置于-80 °C冰箱中冷冻保存。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>采用非可存活操作程序采集血清和脑脊液 
	注意：对于非可存活体液采集，应先采集脑脊液再采集血清，因为采集脑脊液时小鼠需保持脉搏。
	<ol>
		<li>尸检时采集脑脊液 
		注意：本操作为非可存活手术，每只小鼠可获得约10−20 µL脑脊液。建议使用无菌手术环境，但非可存活手术中并非必需。
		<ol>
			<li>将装有小鼠的笼子从架子上移至舒适的操作空间。按照1.1.2.2−1.1.2.7和1.1.2.11−1.1.2.12步骤采集脑脊液。随后进入第1.2.2节进行血清采集。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>通过心脏穿刺（开放法）采集血液 
		注意：预期采血量约为体重的3%，例如从20 g小鼠可采集0.6 mL。
		<ol>
			<li>完成脑脊液采集后，通过捏压脚垫确认小鼠仍处于充分麻醉状态。若观察到任何反应，应追加一次麻醉剂量。若无反应，则继续操作。</li>
			<li>将动物仰卧放置，用70%酒精擦拭腹部皮肤。使用手术剪打开胸腔并暴露心脏。将连接3 mL注射器的25 G针头插入左心室，轻柔地拉动注射器活塞以产生负压。采血完成后拔出针头。</li>
			<li>采用二次安乐死方法（如断头或颈椎脱位）以确保动物死亡。</li>
			<li>推动注射器活塞，将采集的血液注入1.5 mL冻存管中。室温静置30−60分钟使血液凝固，然后在4 °C预冷的离心机中以2,000 x g离心10分钟。</li>
			<li>使用洁净的移液技术，将血清转移至新的、已标记的0.5 mL冻存管中。立即将血清冻存管置于-80 °C冰箱中冷冻保存。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 蛋白质分析
<ol>
	<li>采用首选方法（例如 Luminex 技术）对配对的血清和脑脊液（CSF）样本中的目标蛋白和白蛋白进行定量。 
	注意：此处以 Luminex 磁性技术为例，但几乎所有可测量蛋白质含量的技术（包括酶联免疫吸附测定 [ELISA]）均可应用于本方案。理想情况下，脑脊液和血清样本应在同一平台上同时检测白蛋白和目标蛋白。必须优化检测方案中的关键步骤条件，例如抗原-微球偶联浓度、血清和脑脊液样本稀释度、每种分析物的最佳拟合标准曲线以及缓冲液组成，以降低非特异性反应。若使用商业试剂盒检测蛋白（例如用于获取 图3 所示数据的免疫球蛋白分型试剂盒（材料表）），则必须遵循制造商提供的说明。
	<ol>
		<li>在样本解冻后、分析前，对脑脊液和血清样本进行离心（2,000 × g，10 分钟），取上清液使用，以防止滤板和/或探针堵塞。根据试剂盒提供的检测流程进行适当的样本稀释。否则，需为每种分析物和体液确定合适的稀释倍数，并用 PBS 相应稀释样本。 
		注意：若无特定指导或说明，应在正式研究测试前通过确定合适的稀释范围来建立每种分析物和体液的稀释条件，以使浓度估算值落在标准曲线最可靠范围内。了解待分析生物样本的特性（例如分析物在体液中的生理和病理浓度），有助于尝试使用低、中、高分析物含量的样本进行不同稀释。若已知样本中浓度的预期范围，可通过计算样本需稀释的倍数，使其落入所选标准曲线范围内，从而选择合适的稀释倍数。 
		注意：计算稀释倍数时，请注意脑脊液已被稀释了 1:3。</li>
		<li>通过系列稀释参考标准蛋白，为每个目标蛋白（例如用于生成 图3 数据的白蛋白和 IgG）制备标准曲线。在制备标准曲线过程中，每次稀释前应充分混匀更高浓度的溶液。 
		注意：无论选择何种定量方法，每次进行检测时都必须包含标准曲线，以估算样本中蛋白的浓度。最佳参考标准应为纯化的、已知浓度的目标蛋白。具体稀释倍数、用于定义标准曲线的数据点数量及重复次数的选择，取决于标准曲线的非线性程度。</li>
		<li>选择合适的抗体偶联磁性微球组（材料表）。对于单个微球小瓶，每瓶超声处理 30 秒，涡旋振荡 1 分钟。将微球储备液用检测/洗涤缓冲液（PBS，含 1% 牛血清白蛋白 [BSA]）稀释，配制成每种微球终浓度为 50 个/µL 的“工作用微球混合液”。向平底 96 孔板（材料表）的每个孔中加入 50 µL 混合微球。 
		注意：荧光微球对光敏感，因此在整个操作过程中应避免长时间暴露于光照下。</li>
		<li>在孔板图工作表上规划背景孔、标准品孔和样本孔的位置。</li>
		<li>向每个背景孔中加入 50 µL 检测/洗涤缓冲液，向标准曲线孔中加入 50 µL 各标准品溶液，最后向相应孔中加入 50 μL 各稀释后的样本。用铝箔包裹孔板，在平板振荡器上室温避光振荡孵育 30 分钟（约 800 rpm）。</li>
		<li>将孔板置于手持磁铁（材料表）上，静置约 60 秒，使磁性微球完全沉降。轻轻倾倒去除孔内液体，并将孔板轻拍于吸水纸上以去除残留液体。</li>
		<li>将孔板从磁铁上取下，加入 200 µL 检测/洗涤缓冲液，振荡约 30 秒，然后重新置于磁铁上。重复洗涤 3 次。</li>
		<li>将生物素化检测抗体（即针对目标蛋白宿主物种产生的生物素标记抗体）用检测/洗涤缓冲液稀释至 4 μg/mL。向每孔加入 50 µL 稀释后的检测抗体。盖上孔板，在平板振荡器上室温避光振荡孵育 30 分钟（约 800 rpm）。将孔板置于磁铁上，重复步骤 2.1.6 和 2.1.7。</li>
		<li>将藻红蛋白（PE）标记的链霉亲和素（SAPE）用检测/洗涤缓冲液稀释至 4 μg/mL。向每孔加入 50 µL 稀释后的 SAPE。盖上孔板，在平板振荡器上室温避光振荡孵育 30 分钟（约 800 rpm）。将孔板置于磁铁上，重复步骤 2.1.6 和 2.1.7。</li>
		<li>将孔板从磁铁上取下，用 100 μL 检测/洗涤缓冲液重悬微球。使用双激光流式检测仪读取各孔，该仪器可检测 PE 荧光强度（FI）的大小。 
		注意：所产生的信号（例如 FI）与附着在微球表面的目标抗原量成正比。</li>
		<li>导出原始数据，并通过绘制检测信号 FI 与标准蛋白浓度的关系图生成标准曲线。利用标准曲线计算样本中分析物的浓度。 
		注意：白蛋白浓度优先以 g/dL 表示，而目标蛋白浓度优先以 mg/dL 表示。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 鞘内指数计算
<ol>
	<li>将蛋白质浓度值整理到电子表格中，并通过应用以下公式分析结果。</li>
	<li>计算 Qalbumin： 
	<img alt="白蛋白商公式示意图，Q_albumin = (CSF_albumin / Serum_albumin)，用于蛋白质分析。" src="/files/ftp_upload/60495/60495eq1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="方程 1"> 
	其中 CSFalbumin 和 Serumalbumin 分别为配对的血清和脑脊液样本中白蛋白的浓度。</li>
	<li>计算 Qprotein： 
	<img alt="脑脊液与血清分析中的蛋白质比值方程 Q_protein，公式表示。" src="/files/ftp_upload/60495/60495eq2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="方程 2"> 
	其中 CSFprotein 和 Serumprotein 分别为配对的血清和脑脊液样本中目标蛋白质的浓度。</li>
	<li>计算蛋白质指数： 
	<img alt="静态平衡方程图中的蛋白质指数公式 Q_protein/Q_albumin。" src="/files/ftp_upload/60495/60495eq3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="方程 3"></li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

定量评估脑脊液（CSF）蛋白质浓度升高的方法是表征中枢神经系统（CNS）生理与病理状态的有用工具。然而，除了可靠地定量脑脊液中的蛋白质水平外，脑脊液蛋白质的检测还需要以能够区分血液来源与中枢神经系统来源蛋白组分为基础的结果表达方式。迄今为止，常用的蛋白质定量检测方法即使借助高通量工具，仍无法区分这两种蛋白质组分。因此，已有研究提出对蛋白质测量值进行特定校正，以区分在中枢神经系统内合成的蛋白质与来源于血液的蛋白质。此类校正可补偿个体间血清浓度及血脑屏障完整性的差异。总体而言，这些校正基于脑脊液/血清蛋白商（Qprotein）的计算，从而降低因个体血清蛋白浓度差异所导致的变异性。通过将Qprotein与脑脊液/血清白蛋白商（Qalbumin）相关联，可进一步减少因个体屏障功能差异引起的Qprotein变异。这两种校正的结合通常被称为蛋白指数，其计算方式为Qprotein/Qalbumin比值4,6</sup...

脑脊液（CSF）是一种清澈无色的液体，环绕于脑和脊髓周围，在临床医学和基础科学研究中具有重要意义。脑脊液可维持中枢神经系统（CNS）的电解质环境，调节全身酸碱平衡，为神经元和胶质细胞提供营养，发挥中枢神经系统的淋巴样功能，并在中枢神经系统内运输激素、神经递质、细胞因子及其他神经肽1。因此，由于脑脊液的成分能够反映中枢神经系统的活动状态，这种液体为评估中枢神经系统的生理与病理状态提供了宝贵但间接的途径。
脑脊液已用于诊断影响中枢神经系统的疾病超过一百年，在此期间，它主要被临床医生作为一种诊断工具进行研究。然而，近年来神经生物学家认识到脑脊液在研究中枢神经系统病理生理学方面的潜力。特别是，神经科学领域已引入多种高通量蛋白质分析工具，使得能够对脑脊液的蛋白质组成进行详细研究，期望通过此类分析有助于深入了解中枢神经系统内发生的动态变化。
Luminex 和 Simoa 等多重免疫测定技术的不断发展2,3，使研究人员如今能够以极低的浓度检测数百种蛋白质。此外，这些技术还可使用微量样本，从而推动了小动物（包括小鼠）相关研究的开展；在过去，由于脑脊液样本量有限，难以对其进行详细的成分分析，而如今这一限制已得到克服。
然而，需要注意的是，脑脊液（CSF）中检测到的蛋白质可能来源于鞘内合成，和/或由于受损的血脑界面（BBI）导致血清成分渗出。遗憾的是，单独对脑脊液进行蛋白质分析仅能测定这两部分来源的总和。为了区分渗出蛋白与鞘内产生的蛋白质，必须根据个体血清蛋白浓度以及屏障完整性的差异，对使用任何现有蛋白分析工具测得的脑脊液蛋白浓度进行校正。然而，尽管这种校正在临床实践中已有应用，例如脑脊液IgG指数在检测鞘内IgG合成方面具有高敏感性4,5,6，但迄今为止，极少有研究在分析脑脊液蛋白浓度时对血清浓度和屏障完整性进行了校正7,8。
目前，Reibergram 方法是评估血脑屏障功能及蛋白质鞘内合成的最佳方式。该方法通过脑脊液/血清商数图进行图解分析，以整合的方式同时分析屏障功能（或功能障碍）以及鞘内蛋白质合成情况，并以一种完全来源于血液的蛋白质作为参照9,10。通常选择含量丰富的白蛋白作为参考蛋白，因为白蛋白仅在肝脏中产生，且其分子量约为 70 kDa，介于小分子与大分子蛋白质之间11。该分析图最早由 Reiber 和 Felgenhauer 于 1987 年针对主要类别的免疫球蛋白（Igs）提出11，其建立基于对数千份人类样本分析结果的实证数据9。随后，该方法通过应用菲克扩散定律（Fick’s laws of diffusion）在分子扩散/流速理论中的推导得以验证12。该理论表明，蛋白质穿过屏障的扩散呈双曲线分布，能够定量解释中枢神经系统（CNS）中蛋白质的动态变化9,13。总体而言，使用 Reibergram 方法来证明蛋白质鞘内合成的优势在于，它可同时识别从血清进入脑脊液的蛋白质组分以及因局部合成而在脑脊液中出现的蛋白质含量。
本文及相关实验方案详细描述了从脑脊液和血液采集到最终校正脑脊液蛋白质水平计算的完整流程，用于在神经系统疾病的小鼠模型中定量测量鞘内蛋白质合成。该方法为评估（1）脑脊液中任何蛋白质的病理生理来源，以及（2）血脑屏障完整性的稳定性与功能意义提供了基线依据。该实验流程不仅适用于小鼠脑脊液样本的分析，也可广泛应用于多种神经系统疾病动物模型及人类患者的脑脊液研究。

<table><tbody><tr><td>1 mL 胰岛素注射器</td><td>BD</td><td>329650</td><td></td></tr><tr><td>1 mL 注射器</td><td>BD</td><td>329622</td><td></td></tr><tr><td>25 号针头</td><td>BD</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>3 mL 注射器</td><td>BD</td><td>309582</td><td></td></tr><tr><td>30 号胰岛素针头</td><td>BD</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>吸水垫</td><td>任何合适的品牌</td><td></td><td></td></tr><tr><td>乙酰丙嗪（Acepromazine）</td><td>Patterson Vet Supply Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioPlex 手持式磁力洗涤仪</td><td>BioRad</td><td>171020100</td><td>磁铁</td></tr><tr><td>BioPlex MAGPIX 多重检测仪</td><td>BioRad</td><td>171015001</td><td></td></tr><tr><td>BioPlex Pro 平底板</td><td>BioRad</td><td>171025001</td><td></td></tr><tr><td>生物素化检测抗体</td><td>任何合适的来源</td><td></td><td>该抗体必须针对目标蛋白的物种。</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>盐酸丁丙诺啡（Buprenorphine hydrochloride）</td><td>PAR Pharmaceutical</td><td>NDC 42023-179-05</td><td></td></tr><tr><td>毛细管</td><td>Sutter Instrument</td><td>B100-75-10</td><td>外径：1.0 mm，内径：0.75 mm，硼硅酸盐玻璃，10 cm；在本生灯上拉制以缩小内径。</td></tr><tr><td>离心管，0.2 mL</td><td>VWR</td><td>20170-012</td><td></td></tr><tr><td>离心管，0.5 mL</td><td>VWR</td><td>87003-290</td><td></td></tr><tr><td>离心管，1.5 mL</td><td>VWR</td><td>87003-294</td><td></td></tr><tr><td>双醋氯己定（Chlorhexidine diacetate）</td><td>Nolvasan</td><td>E004272</td><td></td></tr><tr><td>一次性移液器吸头</td><td>任何合适的品牌</td><td></td><td></td></tr><tr><td>耳杆</td><td>KOPF Instruments</td><td>1921 或 1922</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Kopter</td><td>V1001</td><td></td></tr><tr><td>冷冻机</td><td>VWR</td><td>VWR32086A</td><td></td></tr><tr><td>纱布</td><td>Medline</td><td>NON25212</td><td></td></tr><tr><td>加热垫</td><td>Sunbeam</td><td></td><td>XL 加大号 SoftTouch，4 档加热并带自动关闭功能，青绿色，12 英寸 × 24 英寸</td></tr><tr><td>诱导室</td><td>VETEQUIP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>异氟烷（Isoflurane）</td><td>Patterson Vet Supply Inc</td><td>NDC 14043-704-06</td><td></td></tr><tr><td>氯胺酮（Ketamine，KetaVed）</td><td>Patterson Vet Supply Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MagPlex 微球（抗体偶联）</td><td>BioRad</td><td></td><td>抗体偶联磁珠</td></tr><tr><td>微孔板振荡器</td><td>Southwest Scientific</td><td>SBT1500</td><td></td></tr><tr><td>微型牵开器</td><td>Carfill Quality</td><td>ACD-010</td><td>钝头，1 mm</td></tr><tr><td>Microsoft Office（Excel）</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MilliPlex MAP 小鼠免疫球蛋白同种型磁珠检测试剂盒</td><td>EMD Millipore</td><td>MGAMMAG-300K</td><td>商品化试剂盒，用于通过 Luminex 技术定量检测小鼠体液中一组免疫球蛋白同种型及亚类。</td></tr><tr><td>小鼠白蛋白捕获 ELISA 试剂盒</td><td>Novus Biological</td><td>NBP2-60484</td><td>商品化试剂盒，用于通过 ELISA 技术定量检测小鼠体液中的白蛋白。</td></tr><tr><td>多通道移液器</td><td>Eppendorf</td><td>3125000060</td><td></td></tr><tr><td>非无菌棉签</td><td>MediChoice</td><td>WOD1002</td><td>需经高压灭菌以达到无菌</td></tr><tr><td>氧气</td><td>AIRGAS</td><td>OX USPEA</td><td></td></tr><tr><td>巴斯德移液管</td><td>Fisher</td><td>13-678-20A</td><td>5&amp;amp; 3/4&quot;</td></tr><tr><td>PDS 缝线带一次性针头，6-0 Prolen</td><td>Patterson Vet</td><td>8695G</td><td>P-3 反向切割，18&quot;</td></tr><tr><td>PE-链霉亲和素（PE-Streptavidin）</td><td>BD Biosciences</td><td>554061</td><td></td></tr><tr><td>移液器</td><td>Eppendorf</td><td>Research seriers</td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>冷冻离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td>ALLEGRA X-12R</td><td></td></tr><tr><td>天平</td><td>Uline</td><td>H2716</td><td></td></tr><tr><td>手术刀</td><td>Feather</td><td>EF7281</td><td></td></tr><tr><td>剃毛器</td><td>Harvard Apparatus</td><td>52-5204</td><td></td></tr><tr><td>标准蛋白</td><td>任何合适的来源</td><td></td><td>最佳参考标准是目标蛋白的纯化品，且浓度已知。</td></tr><tr><td>立体定位仪</td><td>KOPF Instruments</td><td>Model 900LS</td><td>标准配件</td></tr><tr><td>无菌 1× PBS</td><td>Corning Cellgro</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>无菌生理盐水</td><td>Baxter</td><td>0338-0048-02</td><td>0.9% 氯化钠注射液 USP</td></tr><tr><td>弯头手术镊，7 号（2 把）</td><td>Fine Science Tools</td><td>11271-30</td><td>Dumont</td></tr><tr><td>手术剪</td><td>Fine Science Tools</td><td>14094-11</td><td>不锈钢，25 倍</td></tr><tr><td>蒸发器 + 流量计</td><td>Moduflex Anhestesia Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>涡旋振荡器</td><td>Fisher</td><td>02-215-414</td><td></td></tr><tr><td>保温垫</td><td>Kent Scientific Corporation</td><td>RT-JR-20</td><td></td></tr><tr><td>水浴超声仪</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-08895-01</td><td></td></tr><tr><td>赛拉嗪（Xylazine）</td><td>Patterson Vet Supply Inc</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠鞘内合成蛋白质的定量测量

Quantitative Measurement of Intrathecally Synthesized Proteins in Mice

脑脊液（CSF）是存在于脑和脊髓中的一种液体，对基础科学和临床医学均具有重要意义。脑脊液蛋白质成分的分析可为神经科学基础研究以及神经系统疾病提供关键信息。需要注意的是，脑脊液中检测到的蛋白质可能来源于鞘内合成，也可能来源于血清的渗出，因此脑脊液蛋白质分析仅能测定这两部分的总和。为了在动物模型及人体中区分蛋白质由血液渗出与鞘内产生的部分，使用常规蛋白质分析工具进行脑脊液蛋白质谱检测时，必须计算白蛋白脑脊液/血清比值（Qalbumin）——这是血脑界面（BBI）完整性的标志物，以及蛋白质指数（Qprotein/Qalbumin）——用于评估鞘内蛋白质合成水平。本实验方案详细描述了从脑脊液和血液采集到比值与指数计算的完整流程，旨在实现对神经系统疾病小鼠模型中鞘内蛋白质合成水平及血脑界面功能障碍的定量测定。

本项代表性实验旨在比较两种具有临床相关性的多发性硬化症（MS）啮齿类动物模型中IgG的鞘内合成情况：PLP139-151诱导的复发-缓解型实验性自身免疫性脑脊髓炎（R-EAE）和慢性进行性Theiler病毒诱导的小鼠脑脊髓炎脱髓鞘疾病（TMEV-IDD）。R-EAE模型有助于研究复发-缓解型MS，而TMEV-IDD模型则模拟慢性进行性MS19。
本研究对R-EAE（n = 12）和TMEV-IDD（n = 28）模型中的鞘内IgG合成进行了定量分析。两组均在其疾病高峰期进行分析。另设一组10只小鼠进行假手术处理，作为年龄匹配的对照组（cR-EAE，n = 4；cTMEV-IDD假手术组，n = 6）。
采用市售试剂盒（材料表）提供的磁珠法检测配对的血清和脑脊液样本中的总IgG。总IgG值由IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3亚类数值相加得出。由于当时尚无白蛋白的Luminex检测方法，因此使用商业化的鼠白蛋白ELISA...

脑脊液蛋白水平升高可能是血脑屏障改变后血浆蛋白扩散所致，也可能是鞘内合成的结果。本文介绍了一种优化的检测方案，有助于区分这两种情况，并提供对鞘内合成蛋白的定量测量。

脑脊液（CSF）是存在于脑和脊髓中的一种液体，对基础科学和临床医学均具有重要意义。脑脊液的分析……

该方案允许采集脑脊液和血液，通过定量校正脑脊液蛋白水平来测量小鼠神经系统疾病模型中的鞘内蛋白合成。此操作提供了基线依据，可用于评估目标脑脊液蛋白的病理生理来源，以及血脑脊液屏障完整性的稳定性和功能意义。鞘内蛋白合成与屏障完整性的分析可应用于其他动物模型及人类研究。例如，用于检查中枢神经系统疾病。在小鼠中采集足量且纯净的脑脊液在技术上具有挑战性，因此建议反复练习该技术，直至能够获得大量无污染的样本。本次操作演示将由达特茅斯学院实验与分子医学项目研究生、我们新成立的免疫学研究小组成员 Micheal Linzey 完成。通过眼后静脉丛采血获取血清。在确认体重超过15克的麻醉小鼠对足底反射无反应后，用非惯用手的拇指和食指捏住小鼠耳后方的松弛皮肤，并用食指将眼睛上方的皮肤向后拉。用拇指将眼睛下方的皮肤向后拉，将一支移液管（以大约45度角持握）的尖端插入眼球下方的眼眶，方向朝向眼眶中部，同时用手指旋转移液管。然后施加短暂而轻柔的压力后松开，使血液进入毛细管。采集完血液样本后，轻轻取下毛细管，避免损伤眼睛，并将血液转移至1.5毫升离心管中。闭合眼睑后，用纱布轻轻按压，以防止继续出血。在室温下静置血液30至60分钟使其凝固，然后通过离心沉淀样品。采用无菌移液技术，将分离出的血清收集到一个新的、已标记的500微升小瓶中，并立即在-80摄氏度下冷冻血清。在确认足底反射无反应后，去除足够大面积的毛发，以便立即从麻醉小鼠颅骨尾端采集脑脊液。在无菌条件下，将小鼠俯卧位固定于立体定位仪上，并用耳杆固定头部。用30%醋酸氯己定擦拭手术区域，在枕骨下方做矢状皮肤切口，暴露覆盖小脑延髓池的肌肉。使用镊子钝性分离皮下组织和肌肉，用微型牵开器将肌肉分开，暴露小脑延髓池上方的硬脑膜脑膜层。用无菌 PBS 轻柔冲洗组织，以去除任何可能的血液污染，并使用无菌棉签将硬脑膜擦干。将初始穿刺点定位在小脑延髓池对于获取大量且无污染的脑脊液至关重要。使用 30 号针头轻柔穿刺覆盖小脑延髓池的膜，并迅速而轻柔地将一根细小的玻璃毛细管插入穿刺孔中。当收集到 5 至 12 微升脑脊液后，小心地将导管从膜上取下，并使用一段聚乙烯导管将导管连接至一支 3 毫升注射器。将收集的脑脊液注入预先标记并置于冰上的 500 微升离心管中，使用一次性针头和不同规格的聚对二氧环己酮缝线关闭切口。清除任何干涸的血液或组织残留物，并将小鼠置于清洁、温暖的笼子中持续监测，直至完全恢复卧姿。通过离心收集脑脊液（CSF），并肉眼检查沉淀物和上清液，观察是否有血液污染的迹象。然后采用无菌移液技术，将含有脑脊液的上清液转移至新的200 µL离心管中，并用PBS按1:3的比例稀释，立即于-80°C保存。通过心脏穿刺采集血清时，在如上所述完成脑脊液采集后，立即将小鼠置于仰卧位。用70%酒精擦拭腹部皮肤。使用剪刀打开胸腔，暴露心脏，并将连接至3毫升注射

quantitative-measurement-of-intrathecally-synthesized-proteins-in-mice

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

小鼠体内合成蛋白的定量测量

阿尔茨海默病（AD）的转基因（Tg）小鼠模型为研究疾病进展过程中人脑脊液（CSF）内Aβ或tau蛋白水平变化的机制和原因提供了极佳的机会。本文中，我们展示了一种改良的大脑池穿刺技术，用于对小鼠进行系列脑脊液取样。...

一种在小鼠中通过大池进行脑脊液连续采集的技术

本方案详细介绍了如何通过免疫细胞化学方法，在分离的神经元培养物和脑切片中定量突触数量。利用特定区室的抗体，我们标记突触前终末以及突触后特化位点。我们将突触定义为这些标记物产生的信号之间共定位的位点。...

量化突触：一种基于免疫细胞化学的突触数量检测方法

本视频演示了对小鼠脑切片进行免疫荧光染色，以定量分析特定突触前蛋白的分布情况。该过程包括封闭非特异性结合位点，依次加入靶蛋白的一抗和参考标记物的一抗，随后进行二抗标记以及细胞核复染。参考标记物可提供一致的基准信号，确保定量结果的准确性，通过共聚焦显微镜对突触前蛋白在不同脑区的分布进行分析。...

使用免疫荧光法定量小鼠脑内突触前蛋白的分布

识别调控突触可塑性和记忆的分子与通路，至今仍是神经科学领域的主要挑战之一。本文描述了一种工作流程，用于在听觉学习范式中，对可能参与学习与记忆巩固过程中突触分子重组的突触蛋白进行相对定量分析。...

小鼠听觉辨别学习后脑区突触蛋白质组的高分辨率定量分析

本文描述了一种基于固相萃取和液相色谱串联质谱法对人体脑脊液中Aβ1-42进行绝对定量的参考测量方法。...

使用质谱参考测量程序对脑脊液中Aβ1-42进行绝对定量

我们已成功建立了两种底物特异性的γ-分泌酶检测方法。本文介绍的两种基于细胞的检测方法均通过萤火虫荧光素酶报告基因的信号输出来定量γ-分泌酶的酶活性。...

基于细胞的荧光素酶报告基因检测平台中γ-分泌酶介导的淀粉样前体蛋白和Notch切割的定量测量

蛋白质合成是 细胞的一项关键生物学过程。在大脑中，该过程对适应性变化至关重要。测量完整大脑中的蛋白质合成速率需要仔细考虑方法学因素。本文介绍了L-[1-14体内脑区蛋白质合成速率测定的C-亮氨酸定量放射自显影法...

体内脑区蛋白质合成速率的定量放射自显影测定方法

本文介绍了一种定量分析方法，通过免疫荧光染色、共聚焦显微镜和计算机辅助分析，确定突触蛋白相对于标记蛋白的分布情况。...

使用免疫荧光法量化小鼠脑内突触蛋白的异质性分布

本方法介绍了一种采用标准化定量蛋白质印迹技术，对不同组织及不同发育阶段的蛋白质水平进行可靠且可重复比较的实验方案。...

使用标准化定量 Western Blotting 在不同组织及发育过程中对蛋白质水平进行稳健比较

本方案旨在高效定量啮齿类动物脑组织不同细胞区室中泛素-蛋白酶体系统（UPS）的活性。使用者可在同一只动物中检测核、胞质和突触组分内的UPS功能，从而减少进行此类复杂分析所需的时间和动物数量。...

量化啮齿类动物大脑中亚细胞水平的泛素-蛋白酶体活性

本研究描述了一种利用细胞核内流式细胞术对分离自脑组织的小胶质细胞进行全基因组组蛋白修饰定量的实验方案。本研究还包含了用于数据采集的小胶质细胞分离方案。...

利用核内流式细胞术定量分析分离的小鼠脑小胶质细胞中组蛋白全局翻译后修饰

学习在小鼠模型中定量测量脑脊液蛋白水平的方法，以区分血脑屏障损伤与鞘内合成导致的蛋白升高。该方案通过优化采集技术确保样本纯净，为神经疾病研究提供可靠的蛋白质来源分析基础。

小鼠鞘内合成蛋白质的定量测量

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