肠内增殖细胞和死细胞的定量
January 31st, 2020
提出的协议使用流细胞测定来量化培养小鼠肠细胞中的增殖和死细胞数量。该方法有助于评价药物治疗对器官增殖和存活的影响。
除了研究细胞增殖和肠体存活率外，此协议还可用于培养中的肠体分离。科学家可以应用这项技术进行培养性肠体，并研究药物和炎症细胞因子对体外肠道上皮细胞的影响。这项技术的影响延伸到炎症性肠病的水疗法。
我们应用这种方法来寻找一些治疗性细胞因子。这种方法提供了对肠道上皮增殖和生存的见解;此外，它也可用于器官，在肠道以外的组织周围培养。为了分离肠道墓穴并进行肠道培养，请使用组织钳子，并找到虹膜剪刀，从安乐死八周大的野生型小鼠中解剖出大约八厘米的虹膜。
使用带加瓦奇喂养针的注射器，用约40毫升的冰冷Dulbecco磷酸盐缓冲盐水冲洗水，然后用剪刀剪长，然后打开盐水。将 ileum 切成小块，在 15 毫升锥形管中将它们放入 5 毫升无菌冰冷 DPBS 中。然后在冰上摇动样品五分钟。
使用移液器控制器吸气 DPBS 并将其替换为 10 毫升的冷缓冲器。在冰上摇动30分钟后，使用移液器控制器吸气缓冲器一，代之以10毫升的冷缓冲器二。然后用手握手两到三分钟，每分钟大约 80 次摇动。
摇动后，在显微镜下检查20微升缓冲液的缓冲液，以确保有颗粒的Panth细胞的墓穴。使用 70 微米无菌细胞滤株过滤缓冲两个内容物，并在 50 毫升锥形管中收集过滤缓冲液。将 20 微升滤液移到幻灯片上，以计算墓穴。
传输足够体积的过滤缓冲器两个内容，以确保有大约500个墓穴每井。在 4 摄氏度下以 150 倍 G 旋转 10 分钟，然后小心吸进上一液。每 500 个墓穴将 50 微升的地下室膜基质重新暂停。
上下移位小心，避免气泡。将 50 微升的基底膜基质液滴和墓穴混合在 24 孔板的一个孔的中心。在37摄氏度下孵育30分钟，以聚合地下室膜基质。
聚合30分钟后，仔细向每井添加600微升微升微糖介质。将板返回37摄氏度的培养箱，每天在显微镜下观察，每两到三天更换一次介质。要通过肠子，请将组织培养板放在冰上，吸气介质，并在每个井中加入一毫升冷DBS。
使用 P1000 尖端上下移液器，直到没有矩阵区块保留。通过一毫升胰岛素注射器将样品向上传递，并放入15毫升的圆锥管中。在 150 倍 G 和 4 摄氏度下旋转 5 分钟后，使用移液器取出 DPBS。
每孔50微升基膜基质中重新悬浮内层。将板放在37摄氏度的培养箱中30分钟，使地下室膜基质聚合。然后，将每一个井与 600 微升的 ENR 介质覆盖，然后将板返回孵化器。
使用一到二的分裂比将肠子生长五到七天，然后将它们传递到新的24井板中。在每个井中加入600微升ENR介质，然后在37摄氏度的培养箱中孵育4至5天。建立未经治疗的肠子对照组和每毫升白细胞-22用5毫微克治疗的肠状细胞的实验组。
准备每个组至少三个副本。将 600 微升 EdU 介质添加到每个输入的井中，但一个井用作背景减法的负控。在37摄氏度的培养箱中孵育板两小时。
要从地下室膜基质中采集肠子，请使用移液器控制器吸气 EdU 介质并使用 DPBS 洗涤一次。然后，添加一毫升的 DPBS。使用 P1000 移液器尖端上下移液器，直到没有固体地下室膜基块仍然存在。
将样品转移到15毫升管中，在G下旋转300次5分钟，然后丢弃上一液。加入500微升细胞分离酶，在37摄氏度下孵育15分钟。然后使用 P200 移液器尖端上下移液器，将肠状体分解成单个细胞。
接下来，加入三毫升的Dulbecco的修改鹰介质含有10%的胎儿牛血清，并反复移液器与P1000移液器尖端。在300次G离心5分钟后，吸升液，我们悬浮在DPBS的一毫升细胞。要对细胞进行固定和渗透，首先将细胞悬浮液转移到一点五毫升管中，在300次G下旋转5分钟，然后丢弃上经剂。
我们悬浮在4%甲醛的一毫升细胞，并在室温下固定15分钟。在 300 次 G 下离心 5 分钟后，用移液器尖端吸出上经剂。用 DPBS 清洗细胞一次，然后再次向下旋转以去除上一液。
用1毫升0.5%非离子表面活性剂重新暂停细胞，并在室温下孵育10分钟，然后像以前一样用DPBS清洗细胞。要检测EdU，在每根1.5毫升的管中加入100微升的反应鸡尾酒。重新暂停细胞，并保护它们免受光，在室温下孵育30分钟。
在300次G下离心5分钟后，用移液器尖端轻轻吸气反应溶液，将0.5%的非离子表面活性剂进入每个管子，在室温下清洗一次。离心后，和以前一样，我们暂停在一毫升的DPBS细胞。用40微米滤株过滤再增的细胞，并在15毫升的圆锥管中收集过滤的细胞。
尽快对机器检测执行事实。选择适当的通道和电压进行流量细胞仪分析。对于浇注策略，绘制 FSC-A 与 SSC-A 伪色图，通过调整电压将大部分单元分布到点贴图的可见范围。
选择单元格总体为 R1 并排除左下角的单元格碎片。从 R1 单元格总体，建立 FSC-A 与 FSC-H 伪色图。设置栅极以选择指定为 R2 的单单元并排除细胞团。
从R2细胞总体，建立荧光强度与细胞数图，并使用负控设置门。荧光信号区域为正细胞区域，指定R3.比较实验组与对照组之间这些EdU阳性细胞的比例。小肠道墓穴被分离，并在地下室膜基质中作为肠状体进行培养。
肠黄体在隔离两天后开始形成芽。在第六天，肠子有许多芽，流明中有很多碎片。进入者准备在这个阶段通过。
肠子用IL-22治疗3天，之后合成DNA被标记为红色EdU，以指示细胞增殖。IL-22治疗的肠状细胞显示EdU阳性细胞的数量增加。IL-22通过流式细胞分析，增殖细胞从40.1%增加到83.5%。
IL-22治疗也增加了由红色碘化染色表明的肠状细胞死亡。IL-22通过流式细胞测定分析，死细胞从4.9%增加到16.2%。在加密分离过程中，需要添加缓冲区后进行公平晃动，以确保有足够的加密器被摇动下来。
我们建议在显微镜下检查内容物。遵循这个程序，我们还可以量化分化的上皮分型和肠体使用特定的这种方法将帮助研究人员研究肠道上皮分化的肠状体。这个问题在开发之后，为胃肠病学领域的研究人员探索切中发育或病理问题铺平了道路。
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概述
该协议概述了一种从小鼠回肠中分离肠类器官的方法，并使用流式细胞术评估细胞增殖和存活。它特别适用于评估药物治疗和炎性细胞因子对肠道上皮细胞的影响。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 胃肠病学
背景
- 肠类器官是模拟肠道上皮的3D培养物。
- 流式细胞术可用于定量细胞健康和增殖。
- 该技术可应用于研究影响肠道细胞的各种治疗方法。
- 它对理解炎症性肠病有重要意义。
研究目的
- 分离肠道隐窝以进行肠类器官培养。
- 研究药物和细胞因子对细胞存活的影响。
- 增强对肠道上皮动态的理解。
使用的方法
- 从小鼠回肠中分离肠道隐窝。
- 在体外培养肠类器官。
- 应用流式细胞术进行细胞分析。
- 评估药物对细胞增殖和存活的影响。
主要结果
- 成功从小鼠组织中分离和培养肠类器官。
- 定量处理后增殖和死亡的细胞。
- 对治疗性细胞因子效果的洞察。
- 在研究肠道疾病中的潜在应用。
结论
- 该方法提供了一种可靠的方法来研究肠道上皮细胞。
- 它可以适用于其他类器官培养。
- 未来的研究可以探索进一步的治疗意义。
常见问题
Executive Industry Relevance
Quantitative assessment of proliferative and dead cells in enteroids enables high-confidence evaluation of intestinal epithelial responses to drug candidates and cytokines. This capability supports predictive de-risking at the discovery stage for gastrointestinal disease targets and informs portfolio triage decisions for compounds affecting epithelial barrier integrity. The method's compatibility with flow cytometry ensures scalable, reproducible outputs for cross-program comparison.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct quantification of epithelial cell proliferation and death in a controlled, disease-relevant system.
- Supports mechanistic de-risking by distinguishing proliferative from cytotoxic compound effects.
- Facilitates functional target validation for pathways modulating epithelial integrity.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized enteroid-based assay platform for compound and cytokine screening.
- Delivers quantitative, reproducible readouts via flow cytometry for high-throughput workflows.
- Enables robust comparison of experimental and control groups for assay optimization.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro epithelial responses with translational biomarker strategies for gastrointestinal disease models.
- Supports continuity from early discovery through preclinical validation by quantifying cell fate outcomes.
- De-risks advancement of candidates by linking mechanistic effects to disease-relevant endpoints.
Pipeline & Workflow Integration
This enteroid quantification method integrates into the discovery-to-preclinical continuum, bridging early target validation, compound screening, and translational research for intestinal disease programs.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing on epithelial proliferation and survival under drug or cytokine challenge.
- Screening: Provides assay-ready, reproducible enteroid cultures for compound evaluation.
- Analytics: Generates quantitative flow cytometry data for statistical comparison of treatment effects.
- Translational Research: Connects in vitro epithelial outcomes to preclinical disease models and biomarker development.
- Enterprise Reuse: Adaptable to other organoid systems for broader platform deployment across therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in epithelial target modulation and compound safety.
- Operational Value: Standardizes enteroid culture and analysis for reproducible, scalable workflows.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by quantifying both proliferative and cytotoxic responses.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of candidates targeting epithelial barrier function.
Implementation Considerations
- Requires expertise in organoid culture and flow cytometry analysis.
- Demands access to cell dissociation, fixation, and flow cytometry instrumentation.
- Necessitates standardized gating and analysis protocols for cross-study comparability.
- Adaptable to other tissue-derived organoids with protocol optimization.
- Dependent on quality of crypt isolation and enteroid viability for reliable outputs.
