Name: 肠内增殖细胞和死细胞的定量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 47 s
Description: 了解如何使用流式细胞术对小鼠回肠类器官进行细胞增殖与存活定量分析。该方法可评估药物及炎症细胞因子对肠上皮细胞的影响，为炎症性肠病研究提供可靠工具。

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本工作得到国家自然科学基金（31971062、31900326 和 31601022）、江苏省自然科学基金（BK20190043、BK20180838）、南京大学医药生物技术国家重点实验室研究基金（KF-GN-202004）、中国江苏省高校自然科学基金（19KJB320003）、苏州市民生科技项目（SYS2019030）以及江苏省研究生科研创新计划（KYCX19-1981）的资助。本工作还得到苏州大学唐仲英学者计划的支持。

本方案已获得苏州大学剑桥-苏大基因组资源中心（CAM-SU）动物护理与使用委员会的批准。
1. 肠道类器官的分离与培养
<ol>
	<li>肠道隐窝的分离与肠类器官培养
	<ol>
		<li>通过吸入 CO2 处死一只 8 周龄的野生型小鼠。使用组织镊子和精细虹膜剪剪取约 8 cm 的回肠组织。</li>
		<li>使用带有灌胃针头的注射器，以约 40 mL 冰冷的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）冲洗肠腔，然后用剪刀沿长轴剪开并展平回肠。</li>
		<li>将回肠切成小段（0.5−1.0 cm）。将组织段放入含有 5 mL 无菌冰冻 DPBS 的 15 mL 锥形管中，在冰上振荡 5 分钟。</li>
		<li>使用移液器控制器吸除 DPBS，并加入 10 mL 冷缓冲液 1（含 2 mM EDTA 的 DPBS）。在冰上振荡 30 分钟。</li>
		<li>使用移液器控制器吸除缓冲液 1，并加入 10 mL 冷缓冲液 2（含 54.9 mM D-山梨醇和 43.4 mM 蔗糖的 DPBS）。手动振摇 2−3 分钟（约 80 次/分钟）。</li>
		<li>振摇后取 20 µL 缓冲液 2 内容物，于显微镜下观察。</li>
		<li>用 70 µm 无菌细胞滤网过滤缓冲液 2 的内容物，用 50 mL 锥形管收集滤液。</li>
		<li>将 20 µL 滤液滴加至载玻片上计数隐窝数量。转移足量步骤 1.1.7 中的缓冲液 2，确保每孔含有约 500 个隐窝。</li>
		<li>在 4 °C 条件下以 150 x g 离心 10 分钟。离心结束后，小心吸除上清液。</li>
		<li>每 500 个隐窝用 50 µL 基底膜基质（如 Matrigel）重悬，轻柔吹打混匀（注意避免产生气泡），然后在 24 孔板的每个孔中央加入 50 µL 基底膜基质与隐窝的混合液。于 37 °C 培养箱中孵育 30 分钟，使基底膜基质聚合。</li>
		<li>聚合 30 分钟后，小心向每孔加入 600 µL 类器官培养基（高级杜氏改良伊格尔培养基 [DMEM]/F12，2 mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺，青霉素/链霉素 [100 单位/mL]，10 mM Hepes，N2 添加剂 [1:100]，B27 添加剂 [1:50]，并添加表皮生长因子 [EGF；50 ng/mL]、Noggin [100 ng/mL]、R-spondin [500 ng/mL] 和 Y27632 [10 µM]），然后将培养板放回 37 °C 培养箱。每日在显微镜下观察，并每 2−3 天更换一次培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>肠类器官传代 
	注：对于长期培养，肠类器官应大约每周传代一次。
	<ol>
		<li>进行传代时，将组织培养板置于冰上。吸除培养基，并向每孔加入 1 mL 冷 DPBS。使用 P1000 枪头反复吹打，直至无可见的基底膜基质块残留。</li>
		<li>将悬液通过 1 mL 胰岛素注射器（27 G）反复吹打一次，转移至 15 mL 锥形管中。在 4 °C 条件下以 150 x g 离心 5 分钟。</li>
		<li>用移液器吸除 DPBS。每孔用 50 µL 基底膜基质重悬沉淀。</li>
		<li>将培养板放入 37 °C 培养箱中孵育 30 分钟，使基底膜基质聚合。每孔覆盖 600 µL ENR 培养基（类器官培养基，含 50 ng/mL EGF、100 ng/mL Noggin 和 500 ng/mL R-spondin），然后将培养板放回培养箱。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 类器官中EdU阳性细胞的流式细胞术分析
注：图1展示了类肠体中EdU阳性细胞流式细胞术分析的工作流程。
<ol>
	<li>使用 EdU 孵育类肠器官
	<ol>
		<li>将步骤 1.2.4 中获得的类肠器官培养 5–7 天。以 1:2 的传代比例将类肠器官传代至新的 24 孔板中，每孔加入 600 µL ENR 培养基。在 37 °C 培养箱中孵育类肠器官 4–5 天。</li>
		<li>设置对照组（未处理类肠器官）和实验组（用 5 ng/mL 白细胞介素 22 [IL-22] 处理的类肠器官）。每组至少准备三个重复样本。</li>
		<li>将 EdU 加入 ENR 培养基中，配制浓度为 50 μM 的 EdU 培养基。每孔加入 600 μL EdU 培养基，在 37 °C 培养箱中孵育 2 小时。设置一个未加 EdU 处理的类肠器官孔作为阴性对照，用于背景扣除。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从基底膜基质中收获类肠器官
	<ol>
		<li>使用移液控制器吸除 EdU 培养基，并用 DPBS 洗涤一次。每孔加入 1 mL DPBS。</li>
		<li>使用 P1000 移液枪头反复吹打，直至无固体基底膜基质块残留。将悬液转移至 15 mL 离心管中，在 300 x g 条件下离心 5 分钟，弃去上清液。</li>
		<li>加入 500 μL 细胞解离酶（材料表），在 37 °C 孵育 15 分钟。使用 P200 移液枪头反复吹打，将类肠器官解离为单细胞。</li>
		<li>加入含 10% 胎牛血清（FBS）的 DMEM 培养基 3 mL，使用 P1000 移液枪头反复吹打。</li>
		<li>在 300 x g 条件下离心 5 分钟，吸除上清液。用 1 mL DPBS 重悬细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞固定与通透
	<ol>
		<li>将细胞悬液转移至 1.5 mL 离心管中，在 300 x g 条件下离心 5 分钟，弃去上清液。</li>
		<li>用 1 mL 4% 多聚甲醛（PFA）重悬细胞，在室温（RT）固定 15 分钟，然后在 300 x g 条件下离心 5 分钟。用移液枪头吸除上清液，用 DPBS 洗涤一次，离心后弃去上清液。</li>
		<li>用 1 mL 0.5% 非离子型表面活性剂重悬细胞，在室温孵育 10 分钟。</li>
		<li>在 300 x g 条件下离心 5 分钟，吸除上清液。用 DPBS 洗涤一次，离心后弃去上清液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>EdU 检测
	<ol>
		<li>预先配制各组分的储备液：1）Alexa Fluor 叠氮化物工作液，2）1x EdU 反应缓冲液工作液，3）EdU 缓冲液添加剂 10x 储备液。</li>
		<li>将 10x EdU 缓冲液添加剂用去离子水按 1:10 稀释，配制 1x 溶液。该溶液需现配现用。</li>
		<li>根据 表 1 配制反应混合液。 
		注：按表中列出的顺序依次加入各成分。反应混合液配制后需在 15 分钟内使用。</li>
		<li>向每个 1.5 mL 离心管中加入 100 μL 反应混合液。重悬细胞，避光，室温孵育 30 分钟。</li>
		<li>在 300 x g 条件下离心 5 分钟，用移液枪头轻轻吸除反应液。</li>
		<li>每管加入 0.5% 非离子型表面活性剂通透液，在室温洗涤一次。在 300 x g 条件下离心 5 分钟，用移液枪头轻轻吸除上清液，用 1 mL DPBS 重悬细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过流式细胞术分析细胞
	<ol>
		<li>用 40 μm 滤网过滤重悬的细胞，用 15 mL 尖底离心管收集滤过细胞。尽快进行上机 FACS 检测。 
		注：若条件受限，染色后的细胞样本应避光保存于 4 °C，并在 3 天内完成流式检测。</li>
		<li>根据 EdU 检测试剂盒中 Alexa Fluor 叠氮化物的类型（此处为红色通道）选择合适的检测通道及电压（此处约为 150–350 V）。</li>
		<li>设门策略
		<ol>
			<li>绘制 FSC-A（x 轴）vs. SSC-A（y 轴）伪彩色图，通过调节电压使大多数细胞位于点图的可见范围内。圈选细胞群体（R1），排除左下角的细胞碎片。</li>
			<li>从 R1 细胞群体中，建立 FSC-A（x 轴）vs. FSC-H（y 轴）伪彩色图，设门圈选单细胞群体（R2），以排除细胞团块。</li>
			<li>从 R2 细胞群体中，建立荧光强度（x 轴）vs. 细胞数量（y 轴）图，利用阴性对照设门。荧光信号区域即为阳性细胞区域（R3）。比较实验组与对照组中 EdU 阳性细胞（R3）的比例。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 类器官中碘化丙啶阳性细胞的流式细胞术分析
注意：图2展示了类肠体中PI阳性细胞流式细胞术分析的工作流程。
<ol>
	<li>用PI孵育类肠细胞
	<ol>
		<li>将1.2.4步骤中获得的类肠器官在培养箱中培养5–7天。以1:2的传代比例将类肠器官传代至新的24孔板中，每孔加入600 µL ENR培养基。在37 °C培养箱中孵育4–5天。</li>
		<li>设置对照组（未处理）和实验组（IL-22处理），每组至少设置三个重复。</li>
		<li>将PI加入ENR培养基中，配制浓度为3 μM的含PI培养基（PI培养基）。</li>
		<li>每孔加入600 μL PI培养基，在37 °C培养箱中孵育30分钟。设置一孔不加PI处理的类肠器官作为阴性对照，用于背景扣除。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照步骤2.2.1–2.2.5从基底膜基质中收获类肠器官。</li>
	<li>通过流式细胞术分析细胞
	<ol>
		<li>用40 μm细胞筛过滤重悬的细胞，并用15 mL锥形管收集滤过的细胞。</li>
		<li>尽快进行流式细胞仪上机检测。 
		注意：若条件受限，染色后的细胞样本应避光保存于4 °C，并在3天内完成流式检测。</li>
		<li>选择合适的检测通道（此处为红色通道）和电压（此处约为150–350 V）进行流式细胞术分析。</li>
		<li>采用与2.5.3节中所述相同的设门策略。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Odenwald, M. A., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intestinal+epithelial+barrier%3A+a+therapeutic+target%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Gastroenterology+%26+Hepatology%22%5BJournal%5D)">The intestinal epithelial barrier: a therapeutic target.</a> Nature reviews. Gastroenterology & Hepatology. 14 (1), 9-21 (2017).</li>
<li>Buckley, A., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Biology+of+Tight+Junction+Barrier+Regulation+and+Mucosal+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell Biology of Tight Junction Barrier Regulation and Mucosal Disease.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (1), (2018).</li>
<li>Gehart, H., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tales+from+the+crypt%3A+new+insights+into+intestinal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Gastroenterology+%26+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Tales from the crypt: new insights into intestinal stem cells.</a> Nature reviews. Gastroenterology & Hepatology. 16 (1), 19-34 (2019).</li>
<li>Vancamelbeke, M., Vermeire, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intestinal+barrier%3A+a+fundamental+role+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Gastroenterology+%26+Hepatology%22%5BJournal%5D)">The intestinal barrier: a fundamental role in health and disease.</a> Expert Review of Gastroenterology & Hepatology. 11 (9), 821-834 (2017).</li>
<li>Garcia-Carbonell, R., Yao, S. J., Das, S., Guma, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+Intestinal+Epithelial+Cell+RIPK+Pathways+Promotes+Chronic+Inflammation+in+the+IBD+Gut%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of Intestinal Epithelial Cell RIPK Pathways Promotes Chronic Inflammation in the IBD Gut.</a> Frontiers in Immunology. 10, 1094(2019).</li>
<li>Li, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+and+In+Vivo+Approaches+to+Determine+Intestinal+Epithelial+Cell+Permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), e57032(2018).</li>
<li>Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+mucosal+barrier+function+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Intestinal mucosal barrier function in health and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 9 (11), 799-809 (2009).</li>
<li>Graham, W. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+MLCK1+diversion+reverses+barrier+loss+to+restore+mucosal+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Intracellular MLCK1 diversion reverses barrier loss to restore mucosal homeostasis.</a> Nature Medicine. 25 (4), 690-700 (2019).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growing+self-organizing+mini-guts+from+a+single+intestinal+stem+cell%3A+mechanism+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications.</a> Science. 340 (6137), 1190-1194 (2013).</li>
<li>Friedrich, M., Pohin, M., Powrie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+Networks+in+the+Pathophysiology+of+Inflammatory+Bowel+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Cytokine Networks in the Pathophysiology of Inflammatory Bowel Disease.</a> Immunity. 50 (4), 992-1006 (2019).</li>
<li>Zha, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin+22+Expands+Transit-Amplifying+Cells+While+Depleting+Lgr5+Stem+Cells+via+Inhibition+of+Wnt+and+Notch+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Interleukin 22 Expands Transit-Amplifying Cells While Depleting Lgr5 Stem Cells via Inhibition of Wnt and Notch Signaling.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 7 (2), 255-274 (2019).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案详细介绍了体外培养肠类器官以及通过流式细胞术定量分析肠类器官中EdU和PI阳性细胞的必要步骤。该策略具有多项优势。首先，采用EdU标记法可检测肠类器官中的增殖细胞。与传统的BrdU检测方法相比，EdU标记法更快、更灵敏且更准确。EdU与胸腺嘧啶（T）非常相似，可在细胞分裂期间的DNA合成过程中取代胸腺嘧啶。与BrdU抗体检测相比，EdU更易于扩散进入细胞，且EdU的检测无需进行DNA变性及抗原-抗体反应。其次，流式细胞术分析能够快速而准确地定量肠类器官中的增殖细胞（EdU+）和死亡细胞（PI+）。
要成功完成整个实验流程，需考虑若干关键环节。首先，必须在适宜条件下培养肠类器官。生长良好的肠类器官应具有大量含有增殖细胞的芽状结构。其次，需及时对肠类器官进行传代消化。腔内积聚的碎片含有死亡细胞，可用碘化丙啶（PI）染色检测，这些碎片会对后续的流式细胞术分析产生不利影响。第三，由于实验步骤较多（如细胞染色、细胞固定、细胞膜破裂和离心等），细胞在操作过程中容易丢失。因此，收集足够数量的肠类器官至关重要。建议在固定前合并2−3孔（24孔板）的...

肠道上皮细胞的一个基本功能是防止管腔内容物（如致病菌和毒素）进入机体1,2。为了实现这一功能，肠干细胞持续增殖并分化为多种上皮细胞，包括吸收细胞和分泌细胞，这些细胞通过形成紧密连接构成屏障3。肠道上皮细胞的快速更新需要细胞增殖、细胞分化和细胞死亡之间的严格协调4,5。细胞增殖减少或细胞死亡过度均会导致上皮损伤和屏障功能受损1,6。肠道屏障功能障碍与炎症性肠病相关7,8。
已有研究开发出一种用于培养肠隐窝的方法。利用该技术，分离的小鼠肠隐窝可生长形成肠类器官（enteroids），其具有类似隐窝-绒毛的结构，并包含所有类型的肠上皮细胞谱系9,10。5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）是一种胸腺嘧啶类似物，可在细胞增殖过程中DNA复制时替代胸腺嘧啶（T）。通过EdU染色可快速、准确地标记增殖细胞。碘化丙啶（PI）是溴化乙锭的一种类似物，插入双链DNA后可发出红色荧光。PI可特异性地检测死亡细胞，因为它只能穿过受损的细胞膜进入细胞。
在本实验方案中，我们首先描述如何从小鼠小肠中分离隐窝，并将其在体外培养为肠类器官。随后，我们介绍如何通过EdU和PI掺入结合流式细胞术，分析肠类器官中的增殖细胞和死亡细胞。

<table><tbody><tr><td>15 ml 离心管</td><td>Corning</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>22 G 灌胃针</td><td>VWR</td><td>20068-608</td><td></td></tr><tr><td>24 孔板</td><td>Nunc</td><td>142475</td><td></td></tr><tr><td>40 mm 无菌细胞筛</td><td>BD</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 离心管</td><td>Corning</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>70 mm 无菌细胞筛</td><td>BD</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F-12</td><td>GIBCO</td><td>12634010</td><td></td></tr><tr><td>Attune NxT 声学聚焦流式细胞仪</td><td>Invitrogen</td><td>A24863</td><td></td></tr><tr><td>B-27 添加剂</td><td>GIBCO</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>缓冲液 1</td><td></td><td></td><td>DPBS 中含 2 mM EDTA</td></tr><tr><td>缓冲液 2</td><td></td><td></td><td>DPBS 中含 54.9 mM D-山梨醇和 43.4 mM 蔗糖</td></tr><tr><td>C57/B6 小鼠</td><td>南京大学南京生物医药研究院</td><td></td><td></td></tr><tr><td>细胞解离酶（TrypLE）</td><td>Life technologies</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 594 成像试剂盒</td><td>Life technologies</td><td>C10639</td><td></td></tr><tr><td>CO2 培养箱</td><td>Panasonic</td><td>MCO-18AC</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>GIBCO</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>D-山梨醇</td><td>BBI</td><td>SB0491</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>BBI</td><td>EB0185</td><td></td></tr><tr><td>ENR 培养基</td><td></td><td></td><td>Minigut 培养基，含 50 ng/ml EGF、100 ng/ml Noggin、500 ng/ml R-spondin</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>精细虹膜剪</td><td>Tansoole</td><td>2037454</td><td></td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX 添加剂</td><td>GIBCO</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>山羊血清</td><td>Life technologies</td><td>16210-064</td><td></td></tr><tr><td>HDMEM</td><td>Hyclone</td><td>SH30243.01B</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Minigut 培养基</td><td></td><td></td><td>Advanced DMEM/F12，含 2 mM Glutamax、青霉素/链霉素（100 单位/ml）、10 mM HEPES、N2 添加剂（1:100）、B27 添加剂（1:50）</td></tr><tr><td>N2 添加剂</td><td>R&amp;D</td><td>AR009</td><td></td></tr><tr><td>非离子型表面活性剂（Triton X）</td><td>BBI</td><td>TB0198-500ML</td><td></td></tr><tr><td>手术剪（12.5 cm）</td><td>Tansoole</td><td>2025785</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛（PFA）</td><td>sigma</td><td>158127-500g</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素（Penn/Strep）</td><td>Invitrogen</td><td>15140-148</td><td></td></tr><tr><td>相差显微镜</td><td>Nikon</td><td>TS1000</td><td></td></tr><tr><td>碘化丙啶</td><td>Sigma</td><td>P4170-25MG</td><td></td></tr><tr><td>重组 EGF</td><td>PeproTech</td><td>315-09</td><td></td></tr><tr><td>重组小鼠 Noggin</td><td>PeproTech</td><td>250-38</td><td></td></tr><tr><td>重组小鼠 R-Spondin 1</td><td>R&amp;D</td><td>3474-RS-050</td><td></td></tr><tr><td>重组小鼠 IL-22</td><td>PeproTech</td><td>210-22-10</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>BBI</td><td>SB0498</td><td></td></tr><tr><td>组织镊</td><td>Tansoole</td><td>2026704</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 2HC1</td><td>Selleck</td><td>S1049</td><td></td></tr></tbody></table>

类肠体中增殖细胞与死亡细胞的定量分析

Quantification of Proliferative and Dead Cells in Enteroids

肠上皮作为一道屏障，可防止管腔内容物（如致病性微生物群和毒素）进入机体其他部分。上皮屏障功能依赖于肠上皮细胞的完整性。虽然上皮细胞的增殖能够维持连续的细胞层以形成屏障，但上皮损伤会导致屏障功能障碍。结果，管腔内容物可通过非限制性途径穿过肠屏障。肠屏障功能障碍与多种肠道疾病相关，例如炎症性肠病。分离的小鼠肠隐窝可在体外培养并维持为类似隐窝-绒毛结构，这类结构被称为肠类器官或“肠体”。肠体是研究肠上皮细胞增殖与细胞死亡的理想模型。在本方案中，我们描述了一种简单的方法，用于定量培养中肠体内的增殖细胞和死亡细胞数量。使用5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）和碘化丙啶对肠体中的增殖细胞和死亡细胞进行标记，随后通过流式细胞术分析增殖细胞和死亡细胞的比例。该方法可用于检测药物处理对肠上皮细胞增殖和细胞存活的影响。

小肠隐窝被分离后在基底膜基质中以类器官形式进行培养。分离后第2天，类器官开始形成芽状结构。第6天时，类器官已形成多个芽状结构，腔内含有大量碎片（死亡细胞）。此时类器官已准备进行传代（图3）。
大量研究表明，炎症性细胞因子对于维持肠道上皮稳态至关重要。炎症性细胞因子的异常表达与炎症性肠病的发生密切相关11。例如，我们之前的研究表明，IL-22 能促进过渡扩增细胞的增殖，但同时会耗竭 Lgr5+ 干细胞12。
类肠器官经IL-22处理3天后，使用EdU标记合成DNA以指示细胞增殖。经IL-22处理的类肠器官中EdU+细胞数量增加（图4A）。通过流式细胞术分析，IL-22使增殖细胞比例从40.1%上升至83.5%（<strong class="...

本方案采用流式细胞术定量培养的小鼠肠类器官中增殖细胞和死亡细胞的数量。该方法有助于评估药物处理对类器官增殖和存活的影响。

肠上皮作为一道屏障，可防止管腔内容物（如致病性微生物群和毒素）进入机体其他部分。

该方案不仅可用于类肠体的培养与分离，还可用于研究类肠体中的细胞增殖及存活情况。科研人员可应用此技术培养类肠体，并在体外研究药物和炎性细胞因子对肠上皮细胞的影响。该技术的应用前景可拓展至炎症性肠病的水疗研究领域。我们应用此方法来寻找一些具有治疗作用的细胞因子。该方法可提供关于肠道上皮细胞增殖与存活的信息；此外，该方法也可用于培养源自肠道以外其他组织的类器官。为分离肠道隐窝并进行肠类器官培养，需使用组织镊子和虹膜剪，从一只安乐死的八周龄野生型小鼠中解剖出约八厘米长的回肠组织。使用带有灌胃针的注射器，用约 40 毫升冰冷的杜尔贝科磷酸盐缓冲液冲洗回肠，然后用剪刀沿纵轴剪开并展开回肠。将回肠剪成小段，放入含有 5 毫升无菌冰冷 DPBS 的 15 毫升锥形管中。随后将样品置于冰上振荡 5 分钟。使用移液控制器吸除DPBS，并加入10毫升冷缓冲液一。冰上振荡30分钟后，使用移液控制器吸除缓冲液一，再加入10毫升冷缓冲液二。随后手动振摇2至3分钟，频率约为每分钟80次。震荡后，在显微镜下观察20 µL缓冲液二的液滴，确保其中含有带颗粒状潘氏细胞的隐窝。使用70 µm无菌细胞筛过滤缓冲液二的内容物，并将滤液收集至50 mL锥形管中。用移液器吸取20 µL滤液至载玻片上，用于计数隐窝。转移足量的滤过缓冲液组分，确保每孔含有约500个隐窝。在4°C下以150 × g离心10分钟，然后小心吸除上清液。每500个隐窝用50 µL基底膜基质重悬。轻轻吹打，注意避免产生气泡。取50 µL基底膜基质与隐窝混合液，置于24孔板一个孔的中央。在37°C孵育30分钟，使基底膜基质聚合。聚合30分钟后，小心地向每个孔中加入600微升类肠器官培养基。将培养板放回37摄氏度的培养箱中，每天在显微镜下观察，并每两到三天更换一次培养基。传代类肠器官时，将组织培养板置于冰上，吸去培养基，然后向每个孔中加入1毫升冷的DPBS。使用 P1000 枪头反复吹打，直至无基质块残留。将样品通过一支 1 毫升胰岛素注射器向上推注，再向下转移至 15 毫升锥形管中。在 150 × g、4 摄氏度条件下离心 5 分钟后，用移液器吸除 DPBS。每孔用 50 微升基底膜基质重悬肠类器官。将培养板放入 37 摄氏度培养箱中孵育 30 分钟，使基底膜基质聚合。随后，每孔加入 600 微升 ENR 培养基，将培养板放回培养箱中继续培养。将类肠器官培养5至7天后，按1:2的传代比例将其传代至新的24孔板中。每孔加入600微升ENR培养基，然后将类肠器官置于37摄氏度培养箱中培养4至5天。设置未经处理的类肠器官作为对照组，以及用5纳克/毫升白细胞介素-22处理的类肠器官作为实验组。每个组至少准备三个重复样本。除一个孔作为阴性对照用于背景扣除外，向类肠体的每个孔中加入 600 µL EdU 培养基。将培养板置于 37 °C 培养箱中孵育 2 小时。为从基底膜基质中收获类肠体，使用移液器控制器吸除EdU培养基，并用DPBS洗涤一次。随后加入一毫升DPBS，用P1000移液器枪头反复吹打，直至无固体基底膜基质块残留。将样品转移至15毫升离心管中，在300 × g条件下离心5分钟，弃去上清液。加入500微升细胞解离酶，于37摄氏度孵育15分钟。然后使用P200移液器吸头反复吹打，将类肠体消化为单细胞。接下来，加入含有10%胎牛血清的3毫升达尔伯克改良伊格尔培养基，使用P1000移液器枪头反复吹打混匀。在300 × g条件下离心5分钟，吸除上清液后，将细胞重悬于1毫升DPBS中。为进行细胞固定和通透处理，首先将细胞悬液转移至1.5毫升离心管中，在300 × g条件下离心5分钟，弃去上清液。将细胞悬浮于1毫升4%多聚甲醛中，在室温下固定15分钟。在300 × g离心5分钟后，用移液器吸头吸除上清液。用DPBS洗涤细胞一次，再次离心以去除上清液。用1毫升0.5%非离子型表面活性剂重悬细胞，在室温下孵育10分钟，然后如前所述用DPBS洗涤细胞。为检测EdU，向每个1.5毫升离心管中加入100微升反应混合液。重悬细胞后，避光条件下于室温孵育30分钟。以300 × g离心5分钟后，用移液器吸头轻柔地吸除反应液。每管加入0.5%非离子型表面活性剂润湿剂，在室温下洗涤一次。按前述条件再次离心后，将细胞重悬于1毫升DPBS中。用40微米滤网过滤重悬的细胞，并将滤过的细胞收集至15毫升锥形管中。尽快进行机器检测的相关操作。选择适合的通道和电压用于流式细胞术分析。在设门策略中，绘制FSC-A与SSC-A的伪彩色图，并通过调整电压使大多数细胞分布在点图的可见范围内。选择细胞群为 R1，并排除位于左下角的细胞碎片。从 R1 细胞群中建立 FSC-A 与 FSC-H 的伪彩色图。设置门控以选择被指定为 R2 的单细胞，并排除细胞团块。从 R2 细胞群中建立荧光强度与细胞数量的关系图，并利用阴性对照设定门控。荧光信号区域为指定为 R3 的阳性细胞区域。比较实验组与对照组之间这些 EdU 阳性细胞的比例。小肠隐窝被分离并在基底膜基质中作为肠类器官进行培养。分离后两天，肠类器官开始形成芽状结构。第六天时，肠类器官已长出大量芽状结构，腔内存在较多碎片。此阶段肠类器官已准备就绪，可进行传代。类肠器官经IL-22处理3天后，使用EdU将合成的DNA标记为红色，以指示细胞增殖。经IL-22处理的类肠器官中EdU阳性细胞数量增加。通过流式细胞术分析，IL-22使增殖细胞比例从40.1%上升至83.5%。IL-22 处理还增加了类肠体中的细胞死亡，表现为红色的碘化丙啶染色。流式细胞术分析显示，IL-22 将死亡细胞比例从 4.9% 提高至 16.2%。在隐窝分离过程中，加入缓冲液后需进行适度振荡，以确保充分释放足够的隐窝。我们建议在显微镜下检查内容。通过此方法，还可以利用特异性标记物对分化后的上皮细胞类型和肠类器官进行定量分析。该方法将有助于研究人员在肠类器官中研究肠道上皮细胞的分化。该技术的发展为胃肠病学领域的研究人员探索发育或病理相关问题开辟了道路。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

肠内增殖细胞和死细胞的定量

我们介绍了一种从手术组织和活检样本中获取的小肠隐窝和结肠隐窝建立人类肠类器官和结肠类器官的方法。在这篇方法学文章中，我们介绍了成功培养和维持人类肠类器官与结肠类器官所必需的培养模式。...

从完整组织和活检样本建立人上皮类肠体和类结肠体

类肠器官正在成为研究人类疾病的一种新型模型。本方案描述了如何利用从新生儿组织获得的类肠器官，通过脂多糖（LPS）处理来模拟人类坏死性小肠结肠炎的类肠器官模型。所获得的类肠器官表现出类似于人类坏死性小肠结肠炎的炎症变化。...

一种新型的人类上皮类肠体坏死性小肠结肠炎模型

本方案描述了患者来源类球体的生成及后续分析，包括增殖定量、细胞毒性检测、流式细胞术、免疫荧光染色和共聚焦成像，以评估候选药物作为抗肿瘤治疗剂的潜力。该方案有助于精准医疗，可为每位患者及疾病阶段确定特定药物。...

用于靶向肿瘤干细胞的抗肿瘤药物筛选的生理性患者来源三维球体

本方案描述了一种利用极性反转的小肠类器官构建的“类器官培养皿中的坏死性小肠结肠炎（NEC）”模型，该模型为顶膜外翻型，可直接接触顶膜表面。我们提供了一种免疫荧光染色方案，用于检测与坏死性小肠结肠炎相关的上皮结构破坏，并介绍了一种评估在“类器官培养皿中的坏死性小肠结肠炎”模型处理后顶膜外翻类器官存活率的方法。...

体外 顶端朝外的肠类器官坏死性小肠结肠炎模型

本方案详细描述了从胎儿肠道组织建立类肠体（enteroid）这一三维肠道模型的过程。采用上皮生物标志物的免疫荧光成像对模型进行了表征。通过显微注射技术将细菌内毒素脂多糖（lipopolysaccharide）施加于上皮顶端，可诱导上皮通透性增加，其程度呈剂量依赖性，并通过荧光标记葡聚糖的渗漏情况进行测定。...

检测胎儿组织来源类肠体的上皮通透性

本方案描述了一种 体外 坏死性小肠结肠炎（NEC）模型，可用于疾病发病机制的机制性研究。该模型采用微流控芯片，芯片中接种了来源于人类新生儿肠道的肠类器官、内皮细胞以及一名重症NEC新生儿的肠道微生物组。...

结合人类新生儿肠类器官与失调微生物组的坏死性小肠结肠炎微流控模型

类肠体作为一种新型模型，正在被用于研究组织生理学与病理生理学、药物开发以及再生医学。本文中，我们描述了一种牛源原代细胞二维类肠体衍生培养系统，该系统允许与相关组织细胞类型进行共培养。该模型为胃肠道研究的建模提供了转化应用优势。...

用于转化医学研究的牛原代肠类器官二维单层培养体系的建立

本方案描述了一种简单且经济高效的方法，用于研究和量化人结肠类器官在细胞毒性干扰物（如细胞因子）作用下的细胞死亡。该方法采用荧光细胞死亡染料（SYTOX Green...

利用活细胞荧光显微镜定量人结肠类器官中细胞因子诱导的细胞死亡

本研究概述了一种从猪的小肠和大肠来源的类器官生成二维单层细胞的方案。这些单层细胞的生长伴随着跨上皮电阻（TEER）值的升高，表明上皮完整性良好。此外，在Ussing室实验中，施加佛司可林后，这些单层细胞表现出生理性的分泌反应。...

二维猪肠道类器官反映原生肠道的生理特性

本文介绍了一种从标准基质包埋的类器官培养物中生成顶膜朝外的肠道类器官的实验方案。同时概述了将EdU掺入活跃增殖细胞中的步骤，以及对EdU阳性细胞进行半自动定量分析的方法。...

生成顶面朝外的肠道类器官及利用EdU标记评估类器官增殖速率

了解如何使用流式细胞术对小鼠回肠类器官进行细胞增殖与存活定量分析。该方法可评估药物及炎症细胞因子对肠上皮细胞的影响，为炎症性肠病研究提供可靠工具。

类肠体中增殖细胞与死亡细胞的定量分析

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