整合生物信息学方法与实验验证以解析Notch信号通路在卵巢癌中的作用

生物信息学是从数据集中提取信息的有效方法，而实验验证同样至关重要。我们结合这两种方法来研究 Notch 信号通路在卵巢癌中的作用。

该技术的主要优势在于，研究人员可在开展实验之前，利用生物信息学数据库中的信息来规划研究方向。随着人类疾病相关生物信息学数据的不断积累，科学家们不再盲目探索。现在可以通过实验来验证特定发现，从而改进疾病的治疗方法或诊断手段。

针对目标基因与特定类型癌症关联性的meta-A分析，使用附属学术机构的电子邮箱注册账户以访问PRECOG数据库，并在登录终端中输入与该账户关联的邮箱地址和密码。点击“查看详细信息”，在搜索栏中输入目标基因。然后使用滚动条获取所关注特定癌症类型的生存Z分数。

为了研究基因表达水平与卵巢癌分期之间的关联，请访问 CSIOVDB 网站，将目标基因名称输入搜索栏，然后点击“Survival”标签。为了评估基因在不同正常组织和肿瘤组织中的表达数据，请访问 GENT 数据库，并点击“Search”标签。

在关键词部分，从下拉菜单中选择基因符号作为术语，输入目标基因的基因符号，并在类型选项中选择“组织”。点击“搜索”按钮。系统将显示基于 U133A 和 U122 Plus 2 平台的不同癌症类型中正常组织和肿瘤组织内基因表达的汇总图表。

然后点击“结果数据下载”链接，以获取有关基因表达值、组织类型和数据来源的详细信息。要搜索基因改变和信号通路网络，请打开cBioPortal网页，在登录页面的查询区域中，点击“选择研究”部分下的感兴趣器官或组织，选择特定的感兴趣研究，然后点击“按基因查询”。在“选择基因组谱型”部分，选择突变、GISTIC预测的拷贝数变异，或mRNA表达选项。

从“选择患者/病例集”菜单中选择相应的数据，并在“输入基因”查询框中输入目标基因符号。点击“提交查询”按钮，然后打开“网络”选项卡以获取所需的基因网络。接着点击“文件”选项卡，选择“另存为图像 PNG”以下载网络图像。

为了获得过表达NICD或同时过表达NICD和mam的果蝇，需准备相应的果蝇品系，并根据标准实验方案，采用时空特异性基因表达靶向技术来调控基因的时空表达。将果蝇在18摄氏度下培养至成虫阶段，随后转移至29摄氏度并添加酵母培养48小时。在29摄氏度培养结束时，向胚胎收集皿中加入3毫升PBS，并使用二氧化碳垫麻醉果蝇培养物。

使用解剖显微镜识别一只已麻醉的雌性果蝇，并用一对解剖镊子小心夹住果蝇的下部胸节。将果蝇浸入胚胎收集皿中的磷酸盐缓冲液（PBS）内，用另一对镊子夹住其腹部末端，轻轻牵拉以释放内部器官。找到并从果蝇体内分离出一对卵巢，撕裂位于卵巢后端的肌肉鞘，从而分离出卵室（ovaries）。

然后将分离的卵巢置于含有500 µL PBS并置于冰上的1.5 mL离心管中。待所有卵巢收集完毕后，弃去PBS，加入500 µL 4%多聚甲醛，将离心管置于旋转摇床（nutator）上固定10分钟。固定结束后，弃去固定液，用1 mL PBT溶液洗涤卵巢，每次15分钟，共洗涤三次。

最后一次洗涤后，在振荡器上用150微升浓度为10微克/毫升的DAPI对卵巢进行标记，孵育10–15分钟。孵育结束后，用1毫升PBT洗涤卵巢一次，持续10分钟，随后用PBS洗涤两次，每次10分钟。第二次洗涤后，除去大部分PBS，仅保留最后300微升，并使用200微升移液枪头反复吹打卵巢数次，以释放卵室。

接下来，将卵巢组织在微型离心机中短暂离心，轻轻沉淀，并尽可能多地移除PBS，注意不要扰动卵巢沉淀物。使用1,000微升移液枪头，向离心管中转移约三滴封片液，并用末端剪去约0.33毫米的200微升移液枪头，将含有卵巢的全部120微升封片液转移至玻璃显微镜载玻片上。轻轻将盖玻片覆盖在封片液上，并用透明指甲油密封边缘。

然后使用共聚焦显微镜，在10倍放大倍数和0.8孔径下获取染色并封片的卵巢图像。如示例所示，通过PRECOG数据库门户可获得卵巢癌中NOTCH2、NOTCH3和MAML1的Z值。负Z值表明这三个基因高表达的患者总体生存率较差。

利用 CSIOVD 数据库验证这些发现进一步表明，NOTCH2、NOTCH3 和 MAML1 的高表达与较差的总生存率和无病生存率相关。进一步的置换检验提示，NOTCH2、NOTCH3 和 MAML1 在肿瘤组织中高表达。基于这三个核心基因，可构建一个信号网络，以提供在同一通路中突变频率最高且最常发生改变的 50 个邻近基因。

值得注意的是，仅过表达果蝇中的 NOTCH 基因同源物 NICD，并不会在果蝇中诱导肿瘤形成。而同时过表达 NICD 和 mam 则可在果蝇中诱导肿瘤，表现为出现多层上皮结构和细胞积聚。进一步的实验验证有望为发现潜在的新药物治疗靶点、疾病生物标志物以及个体化治疗方案铺平道路。