Name: 生物信息学方法与实验验证的集成，了解诺奇信号在卵巢癌中的作用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: 了解生物信息学分析与实验验证相结合的方法，用于研究卵巢癌中的诺奇信号通路。该方法整合数据库信息与果蝇实验模型，帮助研究人员识别潜在治疗靶点并优化实验设计。

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本工作得到了佐治亚南方大学的启动资金、理学院与数学学院研究资助、暑期研究会奖项以及研究种子基金奖的支持。

1. 基因组谱预测临床结果（PRECOG）
注意：PRECOG 门户网站（precog.stanford.edu）可访问来自 165 个癌症表达数据集的公开数据，包括基因表达水平和患者临床结果17。该平台特别提供 Meta‒Z 分析，通过整合大规模数据集，生成 39 种癌症类型中不同基因的 Z‒分数，以反映患者的总体生存情况。正 Z‒分数值表示较差的生存率，负 Z‒分数值表示较好的生存率。
<ol>
	<li>使用与学术机构关联的电子邮件注册账户，以访问该数据库。输入与账户关联的电子邮件地址和密码。</li>
	<li>点击Meta-Z分析标题下方的查看详情按钮。</li>
	<li>将感兴趣的基因输入到搜索栏中。</li>
	<li>使用屏幕底部的滚动条，获取特定感兴趣癌症类型的生存Z分数。</li>
</ol>
2. CSIOVDB
注：CSIOVDB（<a href="http://csibio.nus.edu.sg/CSIOVDB/CSIOVDB.html" target="_blank">csibio.nus.edu.sg/CSIOVDB/CSIOVDB.html</a>）是由新加坡癌症科学研究所开发的用于研究卵巢癌的微阵列数据库18。该数据库包含来自不同肿瘤部位的癌组织数据以及正常卵巢组织数据。此外，CSIOVDB 提供了Kaplan‒Meier生存曲线图，用于评估不同基因表达水平患者的生存情况。CSIOVDB可用于研究基因表达水平与卵巢癌分期/分级之间的关联。
<ol>
	<li>输入目标基因，然后点击 搜索 按钮。</li>
	<li>点击 疾病状态 标签页。 
	注意：该标签页提供目标基因在卵巢癌不同疾病状态下的基因表达汇总统计信息。</li>
	<li>点击 组织学类型 标签页。 
	注意：该标签页提供目标基因在主要卵巢癌组织学类型中的基因表达汇总统计信息。</li>
	<li>点击 临床病理参数 标签页。 
	注意：该标签页通过 Mann-Whitney 检验，比较不同卵巢癌分期、分级以及临床治疗反应之间的基因表达水平。</li>
	<li>点击 生存分析 标签页。 
	注意：该标签页提供与 总生存期 和 无病生存期 相关的 Kaplan-Meier 生存曲线。在本数据库中，无病生存期定义为无进展且无复发的生存期18。该标签页还包含针对 总生存期 和 无病生存期 的多因素分析结果。多因素分析比较了与卵巢癌预后相关的特征（如分期、分级、手术减瘤情况、组织学类型、年龄）以及目标基因的影响。</li>
	<li>点击 分子亚型 标签页。 
	注意：该标签页提供目标基因在卵巢癌分子亚型中表达水平的汇总统计结果及 Mann-Whitney 检验。此外，还提供目标基因在卵巢癌不同分子亚型中与 总生存期 和 无病生存期 相关的 Kaplan-Meier 生存曲线。</li>
</ol>
3. 正常与肿瘤组织中的基因表达（GENT）
注意：GENT 门户（medical‒genome.kribb.re.kr/GENT）由韩国生物科学与生物技术研究所（Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology, KRIBB）开发并维护19。该数据库收集了 16,400 个（U133A 芯片；241 个数据集）和 24,300 个（U133plus2 芯片；306 个数据集）公开可用的样本。经过标准化处理后，GENT 提供了多种组织中的基因表达数据，并进一步将这些组织划分为肿瘤组织和正常组织。
<ol>
	<li>点击屏幕顶部的 搜索 标签。</li>
	<li>在标记为 1. 关键词 的部分，从下拉菜单中为 术语 选择 基因符号，在 关键词 部分的空白区域输入目标基因的基因符号，并为 类型 选项选择 组织。</li>
	<li>点击 1. 关键词 部分底部的 搜索 按钮。系统将显示基于 U133A 和 U122Plus2 平台的不同癌症类型中正常组织与肿瘤组织基因表达的概要图表。 
	注意：可选择性地在概要图表顶部使用 数据筛选 选项，以单独指定某个数据库进行研究。</li>
	<li>点击 结果数据下载 旁边的链接，以获取有关基因表达值、组织类型和数据来源的详细信息。</li>
</ol>
4. 布罗德研究所癌症细胞系百科全书（CCLE）
注意：CCLE（portals.broadinstitute.org/ccle）由布罗德研究所（Broad Institute）创建，提供了947种人类癌细胞系的基因组谱型和突变信息20。
<ol>
	<li>在搜索栏中输入目标基因，然后点击 搜索 按钮。</li>
	<li>在标有 选择数据集 的部分，从下拉菜单中点击 mRNA 表达（RNAseq） 选项。 
	注意：其他选项包括 mRNA 表达（Affy）、Achilles shRNA 沉默 和 拷贝数。</li>
	<li>点击 切换所有轨迹 按钮。从右侧的灰色框中选择感兴趣的目标组织类型。向下滚动至屏幕底部，点击 下载 mRNA 表达数据 按钮。</li>
	<li>打开下载的文本文件。将所有文本复制并粘贴到 工作表1 中。再将 工作表1 中的所有文本复制。</li>
	<li>点击电子表格软件底部的 工作表2 标签。右键单击 A 列，选择 选择性粘贴，然后在工作表2中选择 转置 选项。</li>
	<li>当文本被转置为 工作表2 上的两列后，点击 排序 &amp;#38; 筛选 选项标题旁的下拉箭头，然后选择 筛选 功能。在标有 基因 的标题区域将出现一个箭头。点击该箭头并输入感兴趣的目标组织类型。 
	注意：此步骤将筛选所有数据，仅显示目标组织类型的基因表达水平。</li>
</ol>
5. cBioPortal
注意：cBioPortal（www.cioportal.org）由纪念斯隆-凯特琳癌症中心（MSK）开发，用于访问、分析和可视化大规模癌症基因组数据21,22。该平台特别支持研究人员搜索基因改变和信号通路网络。
<ol>
	<li>在登录页面的查询区域，点击选择研究部分下感兴趣的器官/组织。选择特定的研究后，点击按基因查询按钮。</li>
	<li>在选择基因组谱型部分，从以下三个选项中进行选择：突变、GISTIC 推定的拷贝数改变或mRNA 表达。然后在选择患者/病例集的下拉菜单中进一步选择相应的数据。</li>
	<li>在输入基因的查询框中输入目标基因符号。点击提交查询按钮。</li>
	<li>点击页面顶部的网络标签，以获取所需基因网络。 
	注意：信号网络采用颜色编码。输入的基因由具有粗边框的种子节点表示。每个基因以红色圆圈表示，红色圆圈的颜色深浅反映其突变频率。基因之间通过不同颜色的线条连接。棕色线条表示&#34;在同一组分中&#34;，表示参与相同的生物学组分；蓝色线条表示&#34;与之反应&#34;，表示基因间的相互作用；绿色线条表示&#34;状态改变&#34;，提示一个基因可能引起另一个基因的状态变化。</li>
	<li>点击图像顶部的文件标签，选择另存为图像 (PNG)以下载网络图像。</li>
</ol>
6. 解剖 果蝇 具有目标基因型和DAPI染色
注意：收集具有目标基因型的雌性 Drosophila，解剖果蝇卵巢，进行DAPI染色处理，以便成像。
<ol>
	<li>准备果蝇品系 tj-Gal4, Gal80ts/CyO; UAS-NICD-GFP/TM6B、w*; UAS-mam.A; 和 w[1118]，以构建可过表达 NICD（tj-Gal4, Gal80ts/+; UAS-NICD-GFP/+）以及同时过表达 NICD 和 mam（tj-Gal4, Gal80ts/UAS-mam.A; UAS-NICD-GFP/+）的果蝇。</li>
	<li>采用时空基因表达靶向（TARGET）技术来控制基因的时空表达23。将果蝇在18 °C下培养至成虫阶段，然后转移至29 °C并饲喂酵母48小时，随后进行解剖。 
	注意：tj-Gal4 仅在较高温度下才能驱动 UAS 表达，此时 Gal80ts 的抑制作用被解除。解剖前添加酵母可使卵巢增大，便于采集。</li>
	<li>在胚胎收集皿中加入3 mL的1×磷酸盐缓冲液（PBS）（137 mM NaCl，2.7 mM KCl，10 mM Na2HPO4，1.8 mM KH2PO4）。使用CO2垫麻醉果蝇。</li>
	<li>选取一只雌性果蝇，用解剖镊小心夹住其胸部下部，并将其浸入胚胎收集皿中的1×PBS溶液中。用另一对镊子夹住腹部末端并轻轻拉出，以释放内部器官。</li>
	<li>识别并分离果蝇体内的成对卵巢。打破位于卵巢后端的肌鞘，并分离卵管（ovarioles）。 
	注意：为获得更高质量的染色结果，必须分离卵管并破坏肌鞘。</li>
	<li>将卵巢放入含有500 μL 1×PBS的1.5 mL离心管中。在收集完所有卵巢前，管子应始终置于冰上。</li>
	<li>移除1×PBS，向管中加入0.5 mL固定液（4%甲醛）。将管子置于摇床上孵育10分钟。</li>
	<li>移除固定液并将其弃入适当的废液容器中。用1 mL的1×PBT（含0.4% Triton™ X-100的1×PBS）清洗卵巢，每次15分钟，共洗3次。</li>
	<li>弃去最后一次PBT洗涤液，加入1 mL PBTG（含0.2%牛血清白蛋白和5%正常山羊血清的1×PBT），以防止非特异性结合。 
	注意：DAPI染色可省略此步骤，但抗体染色中该步骤至关重要。详细的免疫组织化学染色方法参见Jia等24。</li>
	<li>向管中加入150 μL DAPI（10 μg/mL），在摇床上孵育10–15分钟。弃去DAPI溶液，用1 mL 1×PBT清洗1次，每次10分钟。移除PBT后，再用1×PBS清洗2次，每次10分钟。</li>
	<li>吸除多余PBS，保留约300 μL PBS与卵巢共存于管中。使用200 μL移液器反复吹打数次，以释放卵室（egg chambers）。</li>
	<li>轻柔离心后，小心吸除尽可能多的1×PBS溶液，避免丢失卵巢。向管中加入120 μL封片液（1 g没食子酸丙酯，5 mL 10×PBS，40 mL甘油，5 mL dH2O）。 
	注意：封片液具有黏性，难以精确转移120 μL。为缓解此问题，可使用1,000 μL移液器吸头向管中加入三滴封片液。</li>
	<li>将200 μL移液器吸头前端截去约0.33 mm，使用新切割的吸头将封片液转移至显微镜载玻片上。</li>
	<li>将盖玻片轻轻覆盖在封片液上，并用透明指甲油密封盖玻片边缘。 
	注意：密封盖玻片边缘可防止在采集共聚焦图像时卵室在封片液中移动。</li>
	<li>使用共聚焦显微镜按以下参数采集图像：物镜放大倍数 = 10倍；数值孔径 = 0.8；DAPI发射波长 = 410–513 nm。</li>
</ol>

<ol><li>Bocchicchio, S., Tesone, M., Irusta, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convergence+of+Wnt+and+Notch+signaling+controls+ovarian+cancer+cell+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Convergence of Wnt and Notch signaling controls ovarian cancer cell survival.</a> Journal of Cellular Physiology. , (2019).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

由于生物信息学的应用方法多种多样，目前有大量在线数据库向公众开放。从每个数据库中都可以提取海量信息，但某些数据库更适合特定用途，例如根据特定输入评估患者生存率。对从不同独立数据库中获取的数据进行系统性分析，能够有力地得出重要的科学发现。
本研究通过生物信息学方法，重点分析Notch信号通路在卵巢癌中的作用。例如，利用PRECOG门户网站数据库进行Meta-Z分析，获得Z值，以反映临床癌症研究中患者的生存结果。CSIOVDB是另一个用于研究卵巢癌患者生存结果的荟萃分析数据库。CSIOVDB的数据成功验证了PRECOG门户网站的研究结果，即NOTCH2、NOTCH3和MAML1对患者总体生存具有关键作用。随后，GENT和CCLE数据库的应用进一步表明，NOTCH2、NOTCH3和MAML1在卵巢肿瘤及癌细胞系中高表达。这些数据库的联合使用系统地揭示了NOTCH2、NOTCH3和MAML1在卵巢癌中的重要作用。此类生物信息学方法...

Notch 信号通路是一种高度保守的信号通路，在生物体的多种发育过程中具有重要作用。研究表明，Notch 信号在细胞增殖和自我更新中发挥关键作用，而该通路的异常可导致多种癌症1,2,3,4,5,6。在某些情况下，Notch 信号通路既与组织生长和癌症发生相关，也与细胞死亡和肿瘤抑制有关7。多种 Notch 受体（NOTCH 1−4）以及共激活因子 Mastermind（MAML 1−3）具有不同的功能，进一步增加了该通路的复杂性。尽管 Notch 信号通路在功能上十分复杂，但从分子层面来看，其核心通路却相对简单8。Notch 受体作为跨膜蛋白，由胞外区和胞内区组成9。配体与 Notch 受体的胞外区结合后，可促进其发生蛋白水解切割，从而使 Notch 胞内结构域（NICD）释放并进入细胞核。NICD 随后与共激活因子 Mastermind 结合，激活下游基因的表达10。
近年来，Notch 信号通路已被证实可在多种物种的多种癌症发生与进展过程中发挥多种作用6,11例如，Notch 信号通路已被证实与人类肿瘤发生相关 NOTCH1 基因12最近， NOTCH2、NOTCH3、Delta样3（DLL3）、Mastermind样蛋白1（MAML1），以及 含解整合素和金属蛋白酶结构域蛋白17（ADAM17） 基因被证实与卵巢癌密切相关，尤其是与患者的总体生存率较差显著相关13.
随着实验数据和与患者相关数据的持续增加，对可用数据进行分析的需求也在不断上升。这些数据分散在各类出版物中，可能呈现出不一致甚至相互矛盾的研究结果。近几十年来，随着下一代测序等新技术的发展，可用数据量呈指数级增长。尽管这标志着科学领域的快速进步，并为持续的生物学研究提供了机遇，但如何评估公开数据的意义以解决科研问题，仍是一项重大挑战14。我们认为，生物信息学是一种从大规模数据集中提取关键信息的有效方法。通过应用多种生物信息学手段，研究人员能够快速、可靠且高效地解读这些大型数据集，从而获得具有洞察力的发现。这些发现可能涵盖潜在新药物治疗靶点或疾病生物标志物的识别，乃至实现个体化患者治疗15,16。
生物信息学本身正在迅速发展，随着技术进步席卷医学和生命科学领域，相关研究方法也在不断变化。目前，常见的生物信息学方法包括利用公开可访问的数据库和软件程序来分析DNA或蛋白质序列，鉴定具有特定相关性或重要性的基因，并通过功能基因组学确定基因及其产物的相关性16。尽管生物信息学领域显然不仅限于这些方法，但这些方法在帮助临床医生和研究人员管理生物数据、从而整体上造福患者方面具有重要意义。
本研究旨在介绍若干重要的数据库及其在Notch信号通路研究中的应用。 NOTCH2, NOTCH3，及其共激活因子 MAML1 被用作数据库研究的示例。选择这些基因的原因在于Notch信号通路在卵巢癌中的重要性已被证实。对检索数据的系统性分析进一步确认了Notch信号在卵巢癌中的关键作用。此外，由于Notch信号通路在不同物种间高度保守，已证实其过表达 黑腹果蝇 黑腹果蝇 NICD 和 主控因子 共同可诱导肿瘤的形成 果蝇 卵巢，支持数据库的研究结果，证实了Notch信号通路在卵巢癌中具有重要且保守的作用。

<table><tbody><tr><td>DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚，盐酸盐）</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>1:1000 稀释</td></tr><tr><td>PBS，磷酸盐缓冲液，10X 粉剂，pH 7.4</td><td>ThermoFisher</td><td>FLBP6651</td><td>用 ddH₂O 溶解配制成 1X PBS</td></tr><tr><td>山羊血清</td><td>Gibco</td><td>16210064</td><td>血清</td></tr><tr><td>胚胎培养皿</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70543-45</td><td>解剖皿</td></tr><tr><td>旋转混合器</td><td>Fisherbrand</td><td>88861041</td><td>旋转摇床</td></tr><tr><td>tj-Gal4, Gal80ts/ CyO; UAS-NICD-GFP/ TM6B</td><td>佛罗里达州立大学 Wu-Min Deng 博士</td><td>N/A</td><td>果蝇品系</td></tr><tr><td>w*; UAS-mam.A</td><td>布卢明顿果蝇资源中心</td><td>#27743</td><td>果蝇品系</td></tr><tr><td>w[1118]</td><td>布卢明顿果蝇资源中心</td><td>#5905</td><td>果蝇品系</td></tr><tr><td>PRECOG 数据门户</td><td>斯坦福大学</td><td>precog.stanford.edu</td><td>公开可访问的癌症表达数据集数据库</td></tr><tr><td>CSIOVDB</td><td>新加坡癌症科学研究所</td><td>csibio.nus.edu.sg/CSIOVDB/CSIOVDB.html</td><td>用于研究卵巢癌的微阵列数据库</td></tr><tr><td>正常与肿瘤组织基因表达数据库（GENT 门户）</td><td>韩国生物科学与生物技术研究所（KRIBB）</td><td>medical&amp;ndash;genome.kribb.re.kr/GENT</td><td>公开可访问的跨多种组织的基因表达数据数据库，分为肿瘤组织和正常组织</td></tr><tr><td>布罗德研究所癌症细胞系百科全书（CCLE）</td><td>布罗德研究所与诺华生物医学研究中心</td><td>portals.broadinstitute.org/ccle</td><td>提供人类癌症细胞系的基因组谱型和突变信息</td></tr><tr><td>cBioPortal</td><td>纪念斯隆-凯特琳癌症中心（MSK）</td><td>cioportal.org</td><td>供研究人员查询基因改变和信号通路网络的门户平台</td></tr><tr><td>蔡司 710 倒置共聚焦显微镜</td><td>卡尔·蔡司</td><td>ID #M 210491</td><td>用于荧光标记样本的观察与图像采集</td></tr></tbody></table>

整合生物信息学方法与实验验证以解析notch信号通路在卵巢癌中的作用

Integration of Bioinformatics Approaches and Experimental Validations to Understand the Role of Notch Signaling in Ovarian Cancer

Notch 信号通路是一种高度保守的调控通路，参与多种细胞过程。该信号通路的失调常常会干扰正常发育，在某些情况下甚至可能导致癌症的发生或进展。由于该通路具有复杂而多样的功能，可通过多种不同方法对其进行深入研究。其中，生物信息学提供了一种无可置疑的经济高效、易于操作且用户友好的研究方法。生物信息学是一种从大规模数据集中提取关键信息的有效手段。通过应用多种生物信息学方法，研究人员能够快速、可靠且高效地解读这些大规模数据集，从而获得具有深刻意义的应用成果和科学发现。本文介绍了一种整合生物信息学方法以研究 Notch 信号通路在卵巢癌中作用的实验方案。此外，还通过实验对生物信息学分析结果进行了验证。

使用步骤1中提到的PRECOG数据库方法，获得了卵巢癌中NOTCH2、NOTCH3和MAML1的Z值（分别为1.3、2.32、1.62）。负的Z值表明这三个基因高表达的患者总体生存率较差。利用电子表格软件的条件格式功能，Z值在图1中以彩色条形图形式展示。
使用 CSIOVDB 数据库验证研究结果。根据步骤 2 中的说明，依次在 CSIOVDB 数据库的搜索区域输入 NOTCH2、NOTCH3 和 MAML1，并从 生存分析 选项卡中获取患者生存数据。除 总生存期 数据外，CSIOVDB 还提供 无病生存期 数据。CSIOVDB 还根据基因表达水平的四分位数（Q1 与 Q4，即最低四分位数与最高四分位数）对患者进行分组，以展示相应的生存数据。结果与先前研究一致，NOTCH2</...

生物信息学是一种处理大规模数据集的有效方法。通过应用生物信息学手段，研究人员能够快速、可靠且高效地获得具有洞察力的应用成果和科学发现。本文展示了生物信息学在卵巢癌研究中的应用，并通过实验成功验证了生物信息学分析的结果。

整合生物信息学方法与实验验证以解析Notch信号通路在卵巢癌中的作用

Notch 信号通路是一种高度保守的调控通路，参与多种细胞过程。该信号通路的失调常导致……

生物信息学是从数据集中提取信息的有效方法，而实验验证同样至关重要。我们结合这两种方法来研究 Notch 信号通路在卵巢癌中的作用。该技术的主要优势在于，研究人员可在开展实验之前，利用生物信息学数据库中的信息来规划研究方向。随着人类疾病相关生物信息学数据的不断积累，科学家们不再盲目探索。现在可以通过实验来验证特定发现，从而改进疾病的治疗方法或诊断手段。针对目标基因与特定类型癌症关联性的meta-A分析，使用附属学术机构的电子邮箱注册账户以访问PRECOG数据库，并在登录终端中输入与该账户关联的邮箱地址和密码。点击“查看详细信息”，在搜索栏中输入目标基因。然后使用滚动条获取所关注特定癌症类型的生存Z分数。为了研究基因表达水平与卵巢癌分期之间的关联，请访问 CSIOVDB 网站，将目标基因名称输入搜索栏，然后点击“Survival”标签。为了评估基因在不同正常组织和肿瘤组织中的表达数据，请访问 GENT 数据库，并点击“Search”标签。在关键词部分，从下拉菜单中选择基因符号作为术语，输入目标基因的基因符号，并在类型选项中选择“组织”。点击“搜索”按钮。系统将显示基于 U133A 和 U122 Plus 2 平台的不同癌症类型中正常组织和肿瘤组织内基因表达的汇总图表。然后点击“结果数据下载”链接，以获取有关基因表达值、组织类型和数据来源的详细信息。要搜索基因改变和信号通路网络，请打开cBioPortal网页，在登录页面的查询区域中，点击“选择研究”部分下的感兴趣器官或组织，选择特定的感兴趣研究，然后点击“按基因查询”。在“选择基因组谱型”部分，选择突变、GISTIC预测的拷贝数变异，或mRNA表达选项。从“选择患者/病例集”菜单中选择相应的数据，并在“输入基因”查询框中输入目标基因符号。点击“提交查询”按钮，然后打开“网络”选项卡以获取所需的基因网络。接着点击“文件”选项卡，选择“另存为图像 PNG”以下载网络图像。为了获得过表达NICD或同时过表达NICD和mam的果蝇，需准备相应的果蝇品系，并根据标准实验方案，采用时空特异性基因表达靶向技术来调控基因的时空表达。将果蝇在18摄氏度下培养至成虫阶段，随后转移至29摄氏度并添加酵母培养48小时。在29摄氏度培养结束时，向胚胎收集皿中加入3毫升PBS，并使用二氧化碳垫麻醉果蝇培养物。使用解剖显微镜识别一只已麻醉的雌性果蝇，并用一对解剖镊子小心夹住果蝇的下部胸节。将果蝇浸入胚胎收集皿中的磷酸盐缓冲液（PBS）内，用另一对镊子夹住其腹部末端，轻轻牵拉以释放内部器官。找到并从果蝇体内分离出一对卵巢，撕裂位于卵巢后端的肌肉鞘，从而分离出卵室（ovaries）。然后将分离的卵巢置于含有500 µL PBS并置于冰上的1.5 mL离心管中。待所有卵巢收集完毕后，弃去PBS，加入500 µL 4%多聚甲醛，将离心管置于旋转摇床（nutator）上固定10分钟。固定结束后，弃去固定液，用1 mL PBT溶液洗涤卵巢，每次15分钟，共洗涤三次。最后一次洗涤后，在振荡器上用150微升浓度为10微克/毫升的DAPI对卵巢进行标记，孵育10–15分钟。孵育结束后，用1毫升PBT洗涤卵巢一次，持续10分钟，随后用PBS洗涤两次，每次10分钟。第二次洗涤后，除去大部分PBS，仅保留最后300微升，并使用200微升移液枪头反复吹打卵巢数次，以释放卵室。接下来，将卵巢组织在微型离心机中短暂离心，轻轻沉淀，并尽可能多地移除PBS，注意不要扰动卵巢沉淀物。使用1,000微升移液枪头，向离心管中转移约三滴封片液，并用末端剪去约0.33毫米的200微升移液枪头，将含有卵巢的全部120微升封片液转移至玻璃显微镜载玻片上。轻轻将盖玻片覆盖在封片液上，并用透明指甲油密封边缘。然后使用共聚焦显微镜，在10倍放大倍数和0.8孔径下获取染色并封片的卵巢图像。如示例所示，通过PRECOG数据库门户可获得卵巢癌中NOTCH2、NOTCH3和MAML1的Z值。负Z值表明这三个基因高表达的患者总体生存率较差。利用 CSIOVD 数据库验证这些发现进一步表明，NOTCH2、NOTCH3 和 MAML1 的高表达与较差的总生存率和无病生存率相关。进一步的置换检验提示，NOTCH2、NOTCH3 和 MAML1 在肿瘤组织中高表达。基于这三个核心基因，可构建一个信号网络，以提供在同一通路中突变频率最高且最常发生改变的 50 个邻近基因。值得注意的是，仅过表达果蝇中的 NOTCH 基因同源物 NICD，并不会在果蝇中诱导肿瘤形成。而同时过表达 NICD 和 mam 则可在果蝇中诱导肿瘤，表现为出现多层上皮结构和细胞积聚。进一步的实验验证有望为发现潜在的新药物治疗靶点、疾病生物标志物以及个体化治疗方案铺平道路。

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Research

科研

JoVE Journal

Cancer Research

癌症研究

生物信息学方法与实验验证的集成，了解诺奇信号在卵巢癌中的作用

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建立用于成像质谱分析的卵巢癌通讯模型：一种鉴定转移性卵巢肿瘤发展中小分子化学信使的方法

我们描述了一种非侵入性动物成像平台，可用于检测、定量和监测卵巢癌的生长及复发。这种腹腔内异种移植模型模拟了卵巢癌患者的临床特征。...

用于非侵入性成像检测与监测卵巢癌复发的小鼠模型

我们描述了一种适用于女性生殖道正常及转化上皮研究的卵巢脂肪垫移植实验方法。小鼠脂肪垫可实现大块组织片段的移植，手术和成像操作便捷，并为苗勒氏管来源的组织提供了最有利的天然微环境。...

移植至小鼠卵巢脂肪垫

Notch 信号通路是一种依赖细胞间直接接触的细胞通讯形式。要有效诱导 Notch 信号通路 体外，Notch 配体必须以固定化状态呈递给细胞。本方案描述了相关方法 体外 小鼠破骨细胞前体中 Notch...

小鼠破骨细胞前体中Notch信号通路的激活

卵巢癌干细胞（OCSC）负责肿瘤的发生、复发、治疗耐药性和转移。OCSC的血管微环境被认为可促进OCSC的自我更新，从而导致化疗耐药。本实验方案为体外建立可重复的OCSC血管微环境模型提供了基础。.

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小鼠原位接种卵巢癌细胞构建原发肿瘤及腹膜转移的实验模型 via 正位接种卵巢癌细胞

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