激光捕获显微切割小鼠胚胎软骨与骨骼用于基因表达分析

骨骼结构的异质性是研究软骨和骨骼发育过程中基因表达的一个障碍。本方案提供了一种精确分离相邻但不同组织的方法。我们采用焦宁蓝染色对软骨和骨骼进行可视化，优化了激光显微切割技术，以实现精确采集，并保持高完整性的RNA，用于后续分析。

如果焦油紫染色能够充分区分目标组织，并且经过我们的处理方法后RNA质量仍然较高，则也可分离其他组织，例如颅面缝和脑组织。冷冻切片是本方案中技术要求最高的步骤。

为保持RNA的最高完整性，应迅速进行组织的解剖和包埋。开始此操作时，先解剖目标胚胎或组织。将样本置于一次性包埋模具中，并用最佳切割温度化合物包埋，然后用枪头或针调整标本的方向。

将样品在干冰和甲基-2-丁烯浴中迅速冷冻。接着，准备一个带盖的容器，在干冰上放置一张铝箔，用于冷冻切片过程中临时存放解剖样本切片。将新鲜冷冻的标本转移至干冰桶中。

将一层最佳切割温度包埋剂（optimal cutting temperature compound）置于冷冻切片机的样本夹持器上，立即轻轻施加压力将样本放置在最佳切割温度包埋剂之上。当最佳切割温度包埋剂完全冻结后，将带有样本的夹持器固定到冷冻切片机的切片臂上。将样本在冷冻切片机中放置15分钟，使其温度平衡至切片所需温度。

然后，将组织切成12微米厚度，并将切片收集到PEN膜载玻片上。在膜上对齐连续切片。待载玻片上的切片完成后，让其干燥数分钟，随后将载玻片转移至干冰容器中的铝箔上，直至收集完所有所需载玻片。

将载玻片置于 -80 摄氏度的载玻片盒中保存。首先，准备三个已标记的 15 毫升离心管。向每个管中加入 45 毫升 80% 乙醇。

将三支试管置于冰上。将一支含有45毫升95%乙醇的试管和一支含有100%乙醇的试管置于冰上。接着，在室温下向一支50毫升离心管中加入45毫升二甲苯。

将PEN膜载玻片置于戴手套的手上短暂解冻，然后在含有80%乙醇的离心管中振荡洗涤两次，每次30秒，以去除包埋剂（optimal cutting temperature compound）。随后，将载玻片平放在一张铝箔上。用移液器吸取8毫升1%焦宁染液（cresyl violet）与50%乙醇的混合液滴加到载玻片上，染色30秒。

将玻片放入第三个含有80%乙醇的试管中清洗30秒。依次将玻片通过含有95%乙醇的试管（30秒）、含有100%乙醇的试管（30秒），最后通过含有二甲苯的试管（30秒），以完成脱水。随后，将玻片置于洁净擦拭纸上静置5分钟，使二甲苯流尽，并让组织切片自然干燥。

首先，打开激光显微切割显微镜、激光器和计算机。登录计算机并启动软件。当绿灯亮起时，按下红色按钮以激活激光器。

当指示灯变为红色时，激光器已准备就绪，可以使用。将一个5毫升PCR管的管盖插入收集装置中。用移液器向管盖中加入50微升提取缓冲液，然后将收集装置插入显微镜。

在换样收集器装置窗口中，单击移至参考点按钮，将收集器移至参考点。调节焦距以清晰观察参考点。接着，单击工具栏中的左侧卸载按钮，降低载玻片支架。

将载玻片放入持片架中，使组织切片朝下，然后将持片架重新插入载物台。在更换样本窗口中点击继续。为设置激光参数，请选择激光菜单中的控制选项，或点击激光图标。

根据需要调整以下参数：功率（即激光的功率）、光圈（即激光束的宽度）以及速度（即在“绘制并切割”模式下的切割速度）。首先使用5倍物镜找到感兴趣的区域，然后切换到最能清晰显示该区域的物镜。通过单击收集器上的标记来选择用于收集的收集管，然后选择“移动并切割”或“绘制并切割”模式。

切割完成后，带有 PEN 膜的目标组织将因重力作用落入收集管的管盖中。如有需要，重复该选择和切割过程，以获取多个感兴趣区域。之后，卸下收集装置，并小心关闭 PCR 管。

将显微解剖的组织置于干冰上。在室温下解冻显微解剖的组织，然后短暂离心，并将样品在42摄氏度孵育30分钟。之后，将裂解缓冲液离心至5毫升PCR管中。

使用RNA提取试剂盒进行DNase处理和RNA提取，并遵循制造商的说明。本研究中采用优化的激光显微切割技术对软骨和骨组织进行分离，重点介绍了一种快速使用焦宁Y染色的方法，以可视化软骨和骨组织，实现精确的组织采集，同时保持高质量的RNA完整性，用于后续分析。对切片的观察显示，所有检测的软骨均被染成洋红色，所有矿化组织均被染成棕色或黑色。

软骨和骨组织在多个解剖部位均易于与其他组织区分。通过激光捕获显微切割技术选择并分离麦氏软骨、髁突软骨以及下颌骨区域。为获得足够的RNA用于测序，分别将10个麦氏软骨区域、10个髁突软骨区域或4个下颌骨区域收集至三个独立的收集管中。

随后提取RNA，并使用生物分析仪对总RNA进行分析。该激光捕获显微切割技术已应用于不同发育阶段的多种组织，RNA完整性数值检测结果表明RNA质量较高。随后进行差异基因表达分析。

下颌骨与梅克尔软骨之间有 4,006 个基因的表达存在显著差异。成骨细胞或骨细胞特异性基因在下颌骨中表达水平较高，而软骨细胞特异性基因在梅克尔软骨中表达水平较高。此外，破骨细胞标志物在下颌骨中的表达水平也更高，表明目标组织已成功分离。

通过该实验流程，可进行基因表达分析，包括qPCR和RNA-seq。这些方法可用于分析异质性组织中特定组织或目标区域的转录组基因表达情况。