Name: 冠状血管化后心血管预后冠状动脉祖细胞和可溶性生物标志物 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: 了解冠状动脉祖细胞和可溶性生物标志物在预测血管成形术后主要不良心血管事件中的应用。该方法通过评估血管损伤与修复程度，帮助临床医生进行心血管风险分层和预后管理。

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作者感谢机构项目 E015 以及 FOSSIS-CONACYT 行业基金（SALUD-2014-1-233947）的支持。

本方案符合人类研究伦理委员会的机构指南。
1. 冠状动脉造影、超声检查和采血
<ol>
	<li>在冠状动脉介入治疗前获取基线临床和人口统计学信息。收集个体的数据：年龄、性别、当前吸烟状况、体重指数（BMI）、高血压、血脂异常、糖尿病、用药情况以及本次冠状动脉造影的适应证。</li>
	<li>通过经桡动脉途径的心导管术进行冠状动脉造影。该操作应在导管室的透视引导下由经验丰富的心脏病专家完成。 
	注：确定可评估血管。本研究中，可评估血管定义为管径大于1.5 mm且管腔狭窄程度超过50%的动脉。</li>
	<li>将血管内超声导管送至目标区域并记录图像。使用相应软件定位并测量最小管腔面积。</li>
	<li>使用冠状动脉导管从斑块最近处采集10 mL血液。</li>
	<li>患者出院后，安排定期医学评估以随访研究终点。若无法通过电话联系或医生就诊延迟超过2个月，应要求一位预先指定的授权人员核实研究终点。 
	注：以下任一情况均视为主要不良心血管事件（MACE）：1）心血管死亡；2）新发心肌梗死；3）不稳定型心绞痛导致24小时内非计划性就医；4）冠状动脉造影证实的支架内再狭窄；5）需临床干预的失代偿性心力衰竭发作。</li>
</ol>
2. 循环MPC的测定（图2）
<ol>
	<li>采集血液后1小时内进行处理。将6 mL采集的血液转移至15 mL锥形管中，并以1×磷酸盐缓冲液（PBS，pH = 7.4）按1:1（v/v）体积比稀释。</li>
	<li>向三支试管中各加入2 mL密度梯度介质。小心地将等体积的稀释血液分装至含有密度梯度介质的三支试管中。 
	注意：密度梯度介质与稀释血液的总体积不得超过试管最大容量的四分之三。</li>
	<li>在1,800 × g、4 °C条件下离心30分钟。将两层之间的界面条带转移至新管中。加入2 mL PBS，在1,800 × g、4 °C条件下离心6分钟。沉淀物中即为MPCs。</li>
	<li>多次洗涤沉淀物。吸除上清液，用新鲜PBS轻柔重悬细胞沉淀。后续每次洗涤时，在1,800 × g、4 °C条件下离心2分钟。重复该过程6次。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于1 mL PBS中。取20 µL细胞悬液与0.4%台盼蓝按1:1（v/v）稀释后混合。取一滴悬液加入血细胞计数板，在光学显微镜下计数未染色的活细胞。</li>
	<li>进行MPCs鉴定。标记5 mL流式细胞术管，每管分装1 × 106个细胞。准备相应的同型对照抗体。在1,800 × g、4 °C条件下离心6分钟，弃去上清液。</li>
	<li>将一抗用100 µL抗体孵育液稀释，孵育液成分为1× PBS（pH = 7.4）、2 mM乙二胺四乙酸（EDTA）和0.05%牛血清白蛋白（BSA）。涡旋混匀10秒，4 °C避光孵育20分钟。可在本步骤暂停实验流程，通过加入含4%多聚甲醛的PBS固定淋巴细胞，并将样本在4 °C保存不超过24小时。 
	注意：本方案中一抗的终浓度分别为CD45 1:50、CD34 1:20、KDR 1:50、CD184 1:20、CD133 1:50。</li>
	<li>在1,800 × g、4 °C条件下离心2分钟，弃去上清液。用500 µL 1× PBS（pH = 7.4）、2 mM EDTA重悬细胞。</li>
	<li>进行流式细胞术分析。使用同型对照抗体设定背景染色阈值。然后在FSC/SSC图中选择淋巴细胞群，尽量排除通常位于图左下方的残余粒细胞、细胞碎片及其他颗粒。将该区域定义为100%。</li>
	<li>设置一个包含大量具有共同免疫表型CD45+和CD34+细胞的门控。对于双阳性免疫表型，使用先前确定的CD45+、CD34+门控，并进一步加入KDR（VEGFR-2）+、CD133+或CD184+进行分析。根据特异性细胞表面标志物鉴定MPC亚群，并以门控事件的百分比形式报告结果。</li>
	<li>鉴定MPC的主要亚群。本研究中的主要免疫表型包括CD45+CD34+CD133+、CD45+CD34+CD184+、CD45+CD34+CD133+CD184+、CD45+CD34+KDR+、CD45+CD34+KDR+CD133+以及CD45+CD34+KDR+CD184。 
	注意：所用细胞表面标志物分别为CD45（淋巴细胞标志物）、CD34（内皮细胞和/或血管细胞标志物）、KDR（VEGFR-2，内皮细胞膜标志物）、CD133（内皮祖细胞标志物）和CD184（造血干细胞及内皮细胞标志物）。</li>
</ol>
3. 血浆可溶性生物标志物的测定
<ol>
	<li>使用酶联免疫吸附测定法（ELISA）测定可溶性细胞间黏附分子-1（SICAM-1）和基质金属蛋白酶-9（MMP-9）的浓度（图3，上排）。
	<ol>
		<li>将血液样本在室温下以3,000 × g 离心5分钟，收集血浆。</li>
		<li>标记标准品、样本管和对照管。用ELISA试剂盒中提供的洗涤缓冲液洗涤检测板上的预包被孔2次，使孔内试剂平衡。</li>
		<li>将标准品、样本和对照品加入相应孔中。密封后于37 °C孵育90分钟。 
		注意：切勿让孔内液体完全干燥。</li>
		<li>弃去孔内内容物，加入生物素标记的检测抗体。密封后于37 °C孵育60分钟。</li>
		<li>弃去孔内内容物，洗涤3次。将板密封后依次加入链霉亲和素工作液和四甲基联苯胺底物，于37 °C避光孵育30分钟。每次孵育之间洗涤3次。显色后加入终止液，并使用酶标仪读取各孔的光密度吸光值。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用免疫磁珠多重检测法测定肿瘤坏死因子α（TNFα）和白细胞介素1β（IL-1β）的浓度（图3，下排）。
	<ol>
		<li>标记标准品、样本管和对照管。</li>
		<li>将磁珠管涡旋振荡30秒。将磁珠悬液转移至适当大小的试管中，再转移至多重检测板的孔中。定期涡旋振荡以防止磁珠沉淀。</li>
		<li>将手持式磁板洗涤器牢固插入板中。静置2分钟，使磁珠沉降至各孔底部，然后迅速将手持式磁板洗涤器与板组件一同在水槽或废液容器上方倒置。注意使用手持式磁板洗涤器以确保磁珠保留在孔内。</li>
		<li>向每孔加入150 µL洗涤缓冲液，静置30秒使磁珠沉降。按步骤3.2.3的方法弃去孔内液体。随后，每孔加入25 µL通用检测缓冲液（试剂盒提供），再加入25 µL已配制的标准品、样本和对照品。</li>
		<li>密封检测板，在室温下避光、以500 rpm恒定振荡孵育至少60分钟。或者，若条件允许，可在4 °C避光、以500 rpm恒定振荡过夜孵育。</li>
		<li>每次加入150 µL洗涤缓冲液，静置30秒，进行2次洗涤。插入手持式磁板洗涤器，弃去孔内液体。等待2分钟，将板在水槽或废液容器上方倒置。</li>
		<li>依次加入25 µL检测抗体混合液和25 µL链霉亲和素-PE溶液，在室温下密封、避光、以500 rpm恒定振荡孵育30分钟。每次孵育之间按步骤3.2.6所述方法洗涤2次。</li>
		<li>获取读数。每孔加入120 µL读板缓冲液，密封后在室温下避光、以500 rpm恒定振荡孵育5分钟。在多重检测仪上进行读数，并根据每种分析物调整读数参数。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Cassar, A., Holmes, D. R. Jr, Rihal, C. S., Gersh, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+coronary+artery+disease%3A+diagnosis+and+management%5BTitle%5D)+AND+%22Mayo+Clinic+Proceedings%22%5BJournal%5D)">Chronic coronary artery disease: diagnosis and management.</a> Mayo Clinic Proceedings. 84 (12), 1130-1146 (2009).</li>
<li>Regueiro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mobilization+of+endothelial+progenitor+cells+in+acute+cardiovascular+events+in+the+PROCELL+study%3A+time-course+after+acute+myocardial+infarction+and+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Mobilization of endothelial progenitor cells in acute cardiovascular events in the PROCELL study: time-course after acute myocardial infarction and stroke.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 80, 146-155 (2015).</li>
<li>Sen, S., McDonald, S. P., Coates, P. T., Bonder, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+progenitor+cells%3A+novel+biomarker+and+promising+cell+therapy+for+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Science+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Endothelial progenitor cells: novel biomarker and promising cell therapy for cardiovascular disease.</a> Clinical Science (Lond). 120 (7), 263-283 (2011).</li>
<li>Samman Tahhan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progenitor+Cells+and+Clinical+Outcomes+in+Patients+With+Acute+Coronary+Syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Progenitor Cells and Clinical Outcomes in Patients With Acute Coronary Syndromes.</a> Circulation Research. 122 (11), 1565-1575 (2018).</li>
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<li>Jaumdally, R., Varma, C., Macfadyen, R. J., Lip, G. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronary+sinus+blood+sampling%3A+an+insight+into+local+cardiac+pathophysiology+and+treatment%3F%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Coronary sinus blood sampling: an insight into local cardiac pathophysiology and treatment?</a> European Heart Journal. 28 (8), 929-940 (2007).</li>
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<li>Suárez-Cuenca, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronary+circulating+mononuclear+progenitor+cells+and+soluble+biomarkers+in+the+cardiovascular+prognosis+after+coronary+angioplasty%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Coronary circulating mononuclear progenitor cells and soluble biomarkers in the cardiovascular prognosis after coronary angioplasty.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (7), 4844-4849 (2019).</li>
<li>Suárez-Cuenca, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relation+of+Coronary+Artery+Lumen+with+Baseline%2C+Post-angioplasty+Coronary+Circulating+Pro-Inflammatory+Cytokines+in+Patients+with+Coronary+Artery+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Angiology+Open+Access%22%5BJournal%5D)">Relation of Coronary Artery Lumen with Baseline, Post-angioplasty Coronary Circulating Pro-Inflammatory Cytokines in Patients with Coronary Artery Disease.</a> Angiology Open Access. 7, 01(2019).</li>
<li>Schmidt-Lucke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+circulating+endothelial+progenitor+cells+using+the+modified+ISHAGE+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Quantification of circulating endothelial progenitor cells using the modified ISHAGE protocol.</a> PLoS One. 5 (1), e13790(2010).</li>
<li>Moyer, C. F., Sajuthi, D., Tulli, H., Williams, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+IL-1+alpha+and+IL-1+beta+by+arterial+cells+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Synthesis of IL-1 alpha and IL-1 beta by arterial cells in atherosclerosis.</a> American Journal of Pathology. 138 (4), 951-960 (1991).</li>
<li>Morales-Portano, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Echocardiographic+measurements+of+epicardial+adipose+tissue+and+comparative+ability+to+predict+adverse+cardiovascular+outcomes+in+patients+with+coronary+artery+disease%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cardiovascular+Imaging%22%5BJournal%5D)">Echocardiographic measurements of epicardial adipose tissue and comparative ability to predict adverse cardiovascular outcomes in patients with coronary artery disease.</a> International Journal of Cardiovascular Imaging. 34 (9), 1429-1437 (2018).</li>
<li>Huang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+progenitor+cells+correlated+with+oxidative+stress+after+mild+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Yonsei+Medical+Journal%22%5BJournal%5D)">Endothelial progenitor cells correlated with oxidative stress after mild traumatic brain injury.</a> Yonsei Medical Journal. 58 (5), 1012-1017 (2017).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

从受累冠状动脉采血可能较为困难，有时冠状动脉几乎无法接近。在此情况下，可考虑从静脉窦采样作为替代方法。我们进行了验证试验，比较了冠状动脉与静脉窦中循环生物标志物的水平，结果显示无显著差异。然而，循环生物标志物的性能仅在冠状动脉采样条件下得到验证，因此从静脉窦获取的生物标志物性能仍有待进一步探索。
采集血液后应最好在3小时内处理样本以分离MPCs。因此，心脏病学团队与实验室研究人员之间应建立良好的沟通。在分离MPCs过程中，进行密度梯度制备时加入血液样本以及洗涤MPCs沉淀时需格外小心。为方便起见，我们通常将细胞转移至流式管中，加入一抗，固定后于4 °C过夜保存，次日进行流式细胞术检测。关于循环MPCs的生物标志物作用，目前已有重要努力致力于在前体细胞中标准化最具临床应用价值的免疫表型12，但本研究的一个局限性在于，对于冠状动脉疾病（CAD）或其他血管疾病中的所有临床情况，循环前体细胞的特定亚群尚未被充分表征。因此，每项研究都应探索不同的循环前体细胞亚群。
在检测可溶性标志物时，E...

冠状动脉成形术和支架植入术是冠状动脉疾病（CAD）患者的补救性治疗措施。然而，主要不良心血管事件（MACEs），包括心血管死亡、心肌梗死、冠状动脉再狭窄以及心绞痛或失代偿性心力衰竭发作，可能在冠状动脉介入治疗后数月内发生，导致患者非计划性入院。MACEs 在全球范围内较为常见，其发病率和死亡率均较高1。
冠状动脉缺血性损伤会引发早期血管反应及修复机制，其中包括由于MPCs的分化能力及/或血管修复潜能所导致的MPCs动员，以及细胞间黏附分子（ICAMs）、基质金属蛋白酶（MMPs）和活性氧等可溶性分子的产生，这些分子反映了细胞黏附、组织重塑和氧化应激过程。尽管已采用斑块特征和冠状动脉复杂性等内在血管特征来预测主要不良心血管事件（MACEs），但一些研究表明，与冠状动脉内皮损伤和修复机制相关的生物标志物可能在接受冠状动脉成形术的冠心病（CAD）患者中对心血管事件的早期识别和预后评估具有重要价值2,3,4,5。
人们对理解冠状动脉疾病（CAD）损伤与修复机制的持续关注，促使研究人员致力于研究冠状动脉内循环生物标志物，因为冠状动脉取样能更准确地反映血管损伤与修复情况6。然而，在人类研究中，冠状动脉生物标志物的特征描述仍较为匮乏7,8,9。因此，本研究旨在描述一种用于测定冠状动脉循环中祖细胞（MPCs）及可溶性分子含量的方法，以反映血管损伤与修复过程，并探讨这些生物标志物是否与主要不良心血管事件（MACEs）以及接受冠状动脉成形术的冠心病患者临床预后相关。该方法基于获取最接近血管损伤部位的血管相关性循环MPCs和可溶性分子。该方法还可适用于下肢缺血、卒中、血管炎、静脉血栓及其他涉及血管损伤与修复的临床研究。

<table><tbody><tr><td>BSA</td><td>Roche</td><td>10735086001</td><td>牛血清白蛋白（BSA），用作缓冲剂、稳定剂、标准品以及用于混合。</td></tr><tr><td>校准微珠</td><td>Miltenyi Biotec / MACS</td><td>#130-093-607</td><td>MACQuant 校准微珠以含 0.05% 叠氮化钠的水溶液形式提供，3.5 ml 可用于最多 100 次检测。</td></tr><tr><td>CD133/1 (AC133)-PE</td><td>Milteny Biotec / MACS</td><td>#130-080-801</td><td>与 R-藻红蛋白偶联的抗体，溶于 PBS/EDTA 缓冲液中。</td></tr><tr><td>CD184 (CXCR4)-PE-VIO770</td><td>Miltenyi Biotec / MACS</td><td>#130-103-798</td><td>单克隆抗体，同型为重组人 IgG1，已偶联。</td></tr><tr><td>CD309 (VEGFR-2/KDR)-APC</td><td>Miltenyi Biotec / MACS</td><td>#130-093-601</td><td>与 R-藻红蛋白偶联的抗体，溶于 PBS/EDTA 缓冲液中。</td></tr><tr><td>CD34-FITC</td><td>Miltenyi Biotec / MACS</td><td>#130-081-001</td><td>单克隆抗体克隆 AC136 可识别 CD34 的 III 类表位。</td></tr><tr><td>CD45-VioBlue</td><td>Miltenyi Biotec / MACS</td><td>#130-092-880</td><td>单克隆 CD45 抗体，人源化偶联。</td></tr><tr><td>锥形管</td><td>Thermo SCIENTIFIC</td><td>#339651</td><td>15 ml 锥形离心管。</td></tr><tr><td>流式细胞管</td><td>FALCON Corning Brand</td><td>#352052</td><td>5 mL 聚苯乙烯圆底管，12×75 型，无菌。</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>BIO-RAD</td><td>#161-0729</td><td>重金属（以铅计）&amp;lt;10 ppm，铁 &amp;lt;0.01%，砷 &amp;lt;1 ppm，不溶物 &amp;lt;0.005%。</td></tr><tr><td>改良纽鲍尔计数板</td><td>无品牌</td><td>无货号</td><td>用于细胞计数的血细胞计数板（范围 0.1000 mm，0.0025 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;）。</td></tr><tr><td>K2 EDTA 血液采集管</td><td>BD Vacutainer</td><td>#367863</td><td>紫色塑料真空采血管（K2E），含 10.8 mg，6 mL。</td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>Stemcell Technologies</td><td>01-63-12-002-A</td><td>无菌且经内毒素检测合格。密度：1.077&amp;plusmn;0.001 g/mL。</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>#SZBF0920V</td><td>用于生物样本固定（粉末，95%）。</td></tr><tr><td>1.3 mL 移液管</td><td>CRM Globe</td><td>PF1016, PF1015</td><td>移液管是一种可实现更精确液体转移的工具。</td></tr><tr><td>试管</td><td>KIMBLE CHASE</td><td>45060 13100</td><td>耐热试管，尺寸/管帽：13 × 100 mm。</td></tr></tbody></table>

冠状动脉祖细胞与可溶性生物标志物在冠状动脉血管成形术后心血管预后中的作用

Coronary Progenitor Cells and Soluble Biomarkers in Cardiovascular Prognosis after Coronary Angioplasty

主要不良心血管事件（MACEs）会因冠状动脉缺血性损伤而对接受冠状动脉成形术患者的 cardiovascular 预后产生负面影响。冠状动脉损伤程度以及血管修复机制是影响未来 MACEs 发生的因素。诸如斑块特征和冠状动脉复杂性等内在血管特征已被证实可提供 MACEs 的预后信息。然而，有研究提出，冠状动脉内循环生物标志物的检测可作为早期识别和评估 MACEs 预后的便捷方法，因其更能准确反映与冠状动脉损伤及修复相关的动态机制。在成形术期间测定冠状动脉循环生物标志物，例如单个核祖细胞（MPCs）亚群的数量，以及反映炎症、细胞黏附和修复过程的可溶性分子浓度，有助于评估冠状动脉成形术后6个月内的 MACEs 发生风险及预后情况。该方法具有良好的转化应用价值，且在预测 MACEs 及评估心血管预后方面优于外周血循环生物标志物，因此可用于接受成形术的冠状动脉疾病患者的风险分层。

采集了52名接受冠状动脉造影（图1）的患者的冠状动脉、静脉窦及外周血样本，这些患者中高血压和血脂异常的患病率较高。在临床随访期间，冠状动脉造影术后6个月发生了11例（21.1%）主要不良心血管事件（MACE）：死亡（n = 1）、需住院治疗的心绞痛（n = 6）、心肌梗死（n = 2）和/或心力衰竭证据（n = 4）。
发生主要不良心血管事件（MACE）的患者，其大多数MPCs的基础冠状动脉浓度显著较低（图4），其中CD34+CD133+和CD45+CD34+CD133+CD184+亚群的下降更为明显。同样，发生MACE的患者冠状动脉中sICAM-1的基础水平升高，而MMP-9水平降低（表...

主要不良心血管事件的发生会影响冠状动脉成形术后的心血管预后，其发生受冠状动脉损伤程度和血管修复情况的影响。检测对血管损伤和修复具有反应性的新型冠状动脉细胞和可溶性生物标志物，有助于预测主要不良心血管事件的发生及患者预后。

主要不良心血管事件（MACEs）对因冠状动脉疾病接受冠状动脉成形术患者的 cardiovascular 预后产生负面影响

尽管血管成形术有助于治疗冠状动脉疾病患者，但在手术后仍可能发生心血管事件。由于祖细胞（MPCs）和可溶性分子来源于冠状循环，其水平可与血管损伤和修复程度相关。因此，冠状动脉疾病患者在接受冠状动脉血管成形术时，其冠状循环中的MPC及可溶性介质水平可用于评估心血管事件的发生风险及预后情况。间充质祖细胞（MPCs）和可溶性分子也可用于评估在不同缺血条件下发生的并发症和预后情况，例如复发性肢体缺血或脑卒中。演示该实验操作的人员包括实验室技术人员 Eduardo Vera-Gomez 和 Alejandro Hernandez-Patricio，本科生 Karen De La Vega-Moreno 与 Carlos Zamora-Aleman。此外，参与演示的还有理学硕士研究生 Gabriela Alexandra Dominguez-Perez、博士研究生 Alberto Melchor-Lopez，以及理学硕士合作者 Mario Antonio Tellez-Gonzalez。采集后一小时内，将六毫升收获的血液样本转移至15毫升锥形管中，并用PBS以1:1比例稀释血液。向三支试管中各加入两毫升密度梯度介质，然后小心地将等量稀释血液分成三份，分别加入各试管的密度梯度介质中。通过离心分离细胞，并将界面处的细胞转移至新管中。用两毫升 PBS 清洗收集的细胞一次，持续六分钟，随后每次用两毫升新鲜 PBS 清洗，共清洗六次，每次两分钟。最后一次清洗后，将含有 MPC 的细胞沉淀重悬于一毫升 PBS 中进行计数，并将 1×10⁶ 个细胞加入标记好的五毫升流式细胞术管中。通过离心沉淀细胞，然后向每管中加入 100 微升用抗体孵育液稀释的相应目标抗体。每加入一种抗体混合液后，轻轻混匀细胞10秒，将样品置于4摄氏度避光孵育20分钟。孵育结束后，离心样品，并将沉淀重悬于500 µL含2 mmol/L EDTA的PBS中。使用同型对照设置背景染色，按照标准操作流程通过流式细胞术分析样品，在前向散射光与侧向散射光散点图中圈选淋巴细胞，以排除残留的粒细胞、细胞碎片及其他颗粒。设置一个门以包含大量具有CD45阳性CD34阳性表型的细胞。接着，利用CD45阳性CD34阳性门来筛选激酶插入结构域受体CD133或CD184阳性细胞。随后，可通过其特异的细胞表面标志物鉴定MPC亚群，并以门控事件的百分比形式报告结果。为了测定采集的血液样本中可溶性生物标志物的浓度，首先使用试剂盒提供的洗涤缓冲液将相应的预包被ELISA板洗涤两次，并标记标准品、样本和对照管。离心血液样本以分离血液成分，并将血浆分装至样本管中。将标准品、样本和对照品加入相应的孔中，密封后于37摄氏度孵育90分钟。孵育结束后，弃去孔内液体，向每孔中加入生物素检测抗体。在37摄氏度孵育一小时后，弃去板内液体，并用新鲜洗涤缓冲液洗涤孔板，每

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冠状血管化后心血管预后冠状动脉祖细胞和可溶性生物标志物

人类心脏组织中含有多种具有多向分化潜能的血管周围前体细胞群体，这些细胞可能适用于心肌再生。本文所述技术可同时分离和纯化两种与天然血管相关的多能间充质细胞群体， 即 CD146+CD34- 周细胞和CD34+CD146-...

从人心脏组织中分离血管周围多能前体细胞群体

我们提出了三种新颖且更高效的方案，用于将人诱导性多能干细胞分化为心肌细胞、内皮细胞和平滑肌细胞，并提供了一种递送方法，通过结合细胞注射与补片介导的细胞因子递送，提高移植细胞的定植效率。...

多能干细胞来源的心脏细胞用于心肌修复

内皮祖细胞（EPCs）在缺血组织的新生血管形成中起着至关重要的作用。本方法描述了从外周血中分离人源EPCs，以及鉴定其对心脏外科患者血清样本的迁移潜能。...

健康志愿者内皮祖细胞的分离及其受心脏术后血清样本影响的迁移潜能

本方案介绍了一种安全且高效的CD133+造血干细胞修饰方法。所展示的非病毒性、基于磁性多聚复合物（polyplex）的技术，可为优化治疗性干细胞效应以及通过磁共振成像监测所给予的细胞产品提供基础。...

将microRNA导入成年骨髓来源造血干细胞的方案：实现细胞工程与磁性靶向的结合

本文介绍一种通过过表达GATA4、Hand2、Mef2c、Tbx5、miR-1和miR-133（GHMT2m）并同时抑制TGF-β信号通路，将原代胚胎成纤维细胞重编程为功能性心肌细胞的稳健方法。本方案在转导后最早7天即可生成搏动的心肌细胞，重编程效率高达60%。...

抑制促纤维化信号通路增强因子介导的小鼠胚胎成纤维细胞向诱导型心肌细胞的重编程

本方案描述了一种心脏前体细胞的内皮分化技术，重点介绍血清浓度和细胞接种密度如何影响内皮分化潜能。...

低血清条件下诱导心脏前体细胞向内皮细胞分化

冠状血管生成的体外模型可用于揭示冠状血管生成的细胞和分子机制。静脉窦和心内膜组织的体外植块培养在VEGF-A刺激下表现出显著的生长，并显示出与体内相似的COUP-TFII表达模式。...

冠状动脉血管生成的体外模型

即使在严重肢体缺血（CLI）患者接受阻塞血管的血管成形术后，仍可能发生下肢截肢。单核祖细胞（MPCs）反映了血管修复能力。本方案描述了在血管成形术前后循环中MPCs的定量方法，及其与内皮功能障碍的关系，并用于预测下肢截肢风险。...

利用血管成形术治疗的严重肢体缺血患者局部循环单个核祖细胞预测截肢风险

本研究介绍了一种由于进行性冠状动脉狭窄导致慢性心肌缺血的猪外科模型，该模型在无心肌梗死的情况下引起心脏功能受损。缺血发生后，动物接受非体外循环冠状动脉旁路移植术，并在心外膜放置富含干细胞来源外泌体的胶原贴片作为辅助治疗。该辅助疗法可改善心肌功能和恢复。...

外泌体负载胶原贴片联合非体外循环冠状动脉旁路移植术治疗慢性心肌缺血的猪外科模型

采用优化的解离方案对冠状动脉内膜切除术组织样本进行处理，以分离单个细胞核。通过三种互补方法验证分离细胞核的完整性：台盼蓝排斥染色法评估细胞膜完整性，DAPI标记共聚焦显微镜观察确认细胞核形态，流式细胞术定量细胞核得率与纯度。...

冠状动脉旁路移植术患者冠状动脉内膜剥脱组织的单细胞核分离

了解冠状动脉祖细胞和可溶性生物标志物在预测血管成形术后主要不良心血管事件中的应用。该方法通过评估血管损伤与修复程度，帮助临床医生进行心血管风险分层和预后管理。

冠状动脉祖细胞与可溶性生物标志物在冠状动脉血管成形术后心血管预后中的作用

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