Name: 将葛兰阴性细菌的细胞包络分离到内膜和外膜分数，对阿辛托巴基的培养素进行技术调整 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: 学习革兰阴性细菌内膜与外膜分离技术，无需使用去污剂即可在近似天然环境中分析脂质、蛋白质与糖类成分。该方法适用于研究抗生素耐药机制及病原体致病机理，为开发新型抗菌策略提供重要基础。

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本工作由授予 Z. D. Dalebroux 的 P20GM10344 和 R01AI139248 项目资助。

1. 膜提取所需常规试剂与培养基的配制
<ol>
	<li>细菌培养基：在彻底清洁并经过高压灭菌的 2 L 三角瓶中制备并灭菌 1 L 液体培养基。</li>
	<li>通用重悬缓冲液（1 M Tris 缓冲液，pH 7.5；50 mL）：将 6.05 g Tris 碱溶解于 30 mL H2O 中，用 5 M HCl 调节 pH 至 7.5，再用超纯 H2O 定容至 50 mL。</li>
	<li>二价阳离子螯合溶液母液（0.5 M EDTA，pH 8；100 mL）：将 18.6 g 乙二胺四乙酸二钠盐·2H2O 加入 80 mL H2O 中，剧烈搅拌，并用 NaOH 调节 pH 至 8.0，再用超纯 H2O 定容至 100 mL。 
	注意：EDTA 的二钠盐只有在加入 NaOH 将溶液 pH 调节至约 8.0 时才会溶解。</li>
	<li>渗透缓冲液 A（0.5 M 蔗糖，10 mM Tris，pH 7.5；1 L）：称取 171.15 g 蔗糖，转移至 1 L 量筒中，加入 10 mL 1 M Tris 缓冲液（pH 7.5），用超纯 H2O 定容至 1 L，4 °C 保存。</li>
	<li>溶菌酶（10 mg/mL；5 mL）：称取 50 mg（鸡卵清）溶菌酶，溶于 5 mL 超纯 H2O 中，4 °C 保存。</li>
	<li>稀释的二价阳离子螯合溶液（1.5 mM EDTA；500 mL）：取 1.5 mL 0.5 M EDTA（步骤 1.3）加入 497.5 mL 超纯 H2O 中，4 °C 保存。</li>
	<li>渗透缓冲液 B（0.2 M 蔗糖，10 mM Tris，pH 7.5；2 L）：称取 136.8 g 蔗糖，转移至 2 L 量筒中，加入 20 mL 1 M Tris 缓冲液（pH 7.5），用超纯 H2O 定容至 2 L，4 °C 保存。</li>
	<li>核酸酶辅因子（1 M MgCl2；10 mL）：将 2.03 g MgCl2·6H2O 溶解于 8 mL 超纯 H2O 中，定容至 10 mL，室温保存。</li>
	<li>含 RNase 和 DNase 酶的核酸酶溶液混合物：见 材料表，-20 °C 保存。</li>
	<li>蛋白酶抑制剂混合物：见 材料表，4 °C 保存。</li>
	<li>低密度等密度蔗糖梯度溶液（20% w/v 蔗糖，1 mM EDTA，1 mM Tris，pH 7.5；100 mL）：称取 20 g 蔗糖，转移至 200 mL 量筒中，加入 100 µL 1 M Tris 缓冲液（pH 7.5）和 200 µL 0.5 M EDTA（pH 8），用超纯 H2O 定容至 100 mL，室温保存。</li>
	<li>中密度等密度蔗糖梯度溶液（53% w/v 蔗糖，1 mM EDTA，1 mM Tris，pH 7.5；100 mL）：称取 53 g 蔗糖，转移至 200 mL 量筒中，加入 100 µL 1 M Tris 缓冲液（pH 7.5）和 200 µL 0.5 M EDTA（pH 8），用超纯 H2O 定容至 100 mL，室温保存。 
	注意：由于蔗糖浓度较高，为确保准确性，应在量筒中配制该溶液。加入磁力搅拌子并持续搅拌，直至蔗糖完全溶解，此过程可能需要数小时。</li>
	<li>高密度等密度蔗糖梯度溶液（73% w/v 蔗糖，1 mM EDTA，1 mM Tris，pH 7.5；100 mL）：称取 73 g 蔗糖，转移至 200 mL 量筒中，加入 100 µL 1 M Tris 缓冲液（pH 7.5）和 200 µL 0.5 M EDTA（pH 8），用超纯 H2O 定容至 100 mL，室温保存。 
	注意：由于蔗糖浓度较高，为确保准确性，应在量筒中配制该溶液。加入磁力搅拌子并持续搅拌，直至蔗糖完全溶解，此过程可能需要数小时。</li>
	<li>分离膜保存缓冲液（10 mM Tris 缓冲液，pH 7.5；1 L）：将 1 mL 1 M Tris 缓冲液（pH 7.5）加入 1 L 三角瓶中，用超纯 H2O 定容至 1 L。</li>
	<li>β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）（10 mg/mL 溶液）：将 10 mg NADH 溶于超纯 H2O 中，每周新鲜配制，-20 °C 保存。</li>
	<li>用 10 mM Tris HCl（pH 8.0）、1 mM EDTA 平衡的苯酚溶液：见 材料表，4 °C 保存。</li>
	<li>脂多糖凝胶染色试剂盒：见 材料表。</li>
	<li>Bradford 试剂：见 材料表。 
	注意：所有溶液和培养基应在实验当周内配制，以确保结果的一致性。</li>
</ol>
2. 膜提取用细菌的制备
<ol>
	<li>从冷冻甘油菌种中挑取细菌，在新鲜的琼脂平板上划线接种。待菌落形成后，将平板置于 4 °C 保存。挑取单个菌落接种至含有 5 mL 液体培养基的离心管中，根据需要过夜培养细菌。</li>
	<li>将过夜培养的菌液按比例稀释至 1 L 适宜的液体培养基中，继续培养细菌直至达到目标光密度。 
	注意：对于容易抑制生长表型的突变基因型，建议将单个菌落直接接种至 1 L 液体培养基中；但某些革兰氏阴性菌的生长速度天然较慢。若通过单菌落接种无法获得足够的培养密度，可采用将过夜培养物稀释至 1 L 培养基中的策略以同步生长。细菌膜的组成会随培养生长阶段（对数期与稳定期）而变化13。应对所有菌株进行生长曲线测定，即测量细菌培养物光密度随时间的变化，以将培养密度与生长阶段相关联。</li>
	<li>将装有液体培养物的锥形瓶置于冰上。在 600 nm 波长下测定光密度（OD600），并计算相当于 6.0 至 8.0 × 1011 个细菌菌落形成单位（cfu）的培养物体积。对于 S. Typhimurium，这相当于 OD600 为 0.6–0.8 时的 1 L 培养物，因为 OD600 为 1.0 时约等于 1.0×109 cfu/mL。将该体积的培养物加入离心管中，并确保其余培养物在使用前始终保持在冰上。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，使用固定角度高速离心机以 7,000–10,000 × g 离心 10 分钟，使细菌沉淀。 
	注意：离心机应预先冷却并始终保持低温。整个操作过程中样品需保持在冰上。</li>
	<li>小心倾去并弃除上清液。 
	注意：若膜组分不立即提取，菌体沉淀可迅速冷冻并/或在 -80 °C 保存。但建议在收获细胞的当天直接进行质壁分离操作，尤其推荐对非肠杆菌类物种采取此做法。</li>
</ol>
3. 外膜解离与质壁分离
<ol>
	<li>若细胞沉淀先前保存在 -80 °C 条件下，请在冰上解冻，并在后续操作过程中始终保持样品处于冰上。在离心管中用 12.5 mL 缓冲液 A 重悬每个细胞沉淀。向细胞悬液中加入一个磁力搅拌子。</li>
	<li>向每份细胞重悬液中加入 180 µL 的 10 mg/mL 溶菌酶（终浓度为 144 μg/mL）。在冰上搅拌 2 分钟，期间保持样品处于冰上。</li>
	<li>向每份细胞重悬液中加入 12.5 mL 的 1.5 mM EDTA 溶液，并继续在冰上搅拌 7 分钟。</li>
	<li>将悬液倒入 50 mL 圆锥形离心管中，在 4 °C 条件下以 9,000–11,000 × g 离心 10 分钟。</li>
	<li>将上清液弃入生物危害废物容器中，细胞沉淀则保留在冰上。</li>
	<li>向细胞沉淀中加入 25 mL 缓冲液 B。</li>
	<li>向覆盖在细胞沉淀上方的缓冲液 B 中加入 55 µL 的 1 M MgCl2、1 µL RNase/DNase 核酸酶试剂（以避免细菌在均质化前发生质壁分离所导致的黏度问题）以及 1 µL 蛋白酶抑制剂混合物。</li>
	<li>用缓冲液 B 混合液重悬沉淀。剧烈移液并涡旋，直至形成均匀的溶液。 
	注意：在进入本方案的第 4 步之前，确保溶液均匀非常重要。重悬后的细胞应呈现类似蛋糕面糊的黏稠外观和质地。</li>
	<li>每份样品涡旋 15 秒。将悬液保持在冰上，并进入第 4 步。</li>
</ol>
4. 加压均质与裂解
注意： 裂解可采用多种方法。超声处理因会产生热量，故非理想选择。渗透裂解虽可实现，但通常效率较低。因此，我们推荐使用高压裂解。高压裂解可通过多种仪器实现，建议使用均质机，例如法国压滤器（French Press）或Emusliflex。我们研究多种革兰氏阴性菌，其对高渗蔗糖溶液的反应各不相同。高压均质步骤可提高裂解的效率、重复性和得率。
<ol>
	<li>将French Press细胞室预冷至4 °C，或将匀浆机的金属线圈置于冰上。</li>
	<li>将样品倒入French-pressure细胞室或匀浆机样品筒中，并将细胞室升至所需的匀浆压力（使用French Press时通常10,000 psi已足够，使用匀浆机时为20,000 psi）。</li>
	<li>若使用French Press，保持压力的同时调节出口流速至大约每秒一滴。</li>
	<li>将细胞裂解液收集至50 mL锥形管中，并始终保持样品置于冰上。</li>
	<li>重复步骤4.2–4.4三至五次，以实现完全裂解，通常以样品透明度逐渐增加为标志。 
	注意：样品室在处理不同样品之间应使用缓冲液B清洗并平衡。</li>
	<li>将已裂解的细胞保持在冰上。</li>
</ol>
5. 全膜组分分离
<ol>
	<li>将裂解的细菌样品在 4 °C 条件下以 6,169 × g 离心 10 分钟，以沉淀残留的完整细胞成分（例如未裂解的细菌细胞）。</li>
	<li>将上清液的剩余部分（现含有均质化的膜组分）转移至聚碳酸酯瓶中，用于超速离心。 
	注意：如有需要，可通过加入缓冲液 B 稀释来平衡细胞样品。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，以 184,500 × g 对细胞裂解物进行超速离心，至少 1 小时。此步骤可过夜进行，不会影响膜的质量。</li>
	<li>弃去超速离心管中残留的上清液，将膜沉淀物保留在冰上（图 1）。</li>
	<li>使用玻璃Dounce匀浆器将膜沉淀物重悬于 1 mL 低密度等密度蔗糖梯度溶液中。用玻璃巴斯德吸管将样品匀浆液转移至 1.5 mL 微量离心管中，并置于冰上保存。 
	备注：若仅需进行总膜组分分析，可用 1 mL 膜分离储存缓冲液替代 1 mL 低密度等密度蔗糖梯度溶液。若仅需总细菌膜样品，则步骤 5.5 即为分离终点。将样品储存于 -20 °C，直至后续分析需要时使用。</li>
</ol>
6. 密度梯度超速离心法分离双层膜
<ol>
	<li>准备适当数量的13 mL聚丙烯或超透明开口管，用于摆动桶转子和超速离心机。</li>
	<li>将离心管略微倾斜固定，按照以下顺序从高密度到低密度缓慢加入蔗糖溶液，制备蔗糖梯度： 
	2 mL 73% w/v 蔗糖，1 mM EDTA，1 mM Tris pH 7.5 
	4 mL 53% w/v 蔗糖，1 mM EDTA，1 mM Tris pH 7.5
	<ol>
		<li>随后加入已重悬于20% w/v 蔗糖溶液中的总膜组分（1 mL，见步骤5.5）。避免使膜组分与下方的蔗糖溶液混合。各层之间应能清晰分辨出界面。</li>
		<li>最后用低密度等密度蔗糖梯度溶液加满离心管（约6 mL）。聚丙烯和超透明开口管应尽可能加满（距管口2至3 mm），以提供足够的管体支撑。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>鲍曼不动杆菌 17978的调整方案
	<ol>
		<li>针对不同细菌样本可调整蔗糖梯度方案。对于A. baumannii，以下蔗糖梯度可实现更完全的膜分离（图2）。 
		2 mL 73% w/v 蔗糖，1 mM EDTA，1 mM Tris pH 7.5 
		4 mL 45% w/v 蔗糖，1 mM EDTA，1 mM Tris pH 7.5</li>
		<li>随后加入已重悬于20% w/v 蔗糖溶液中的总膜组分（1 mL，见步骤5.5）。避免使膜组分与下方的蔗糖溶液混合。各层之间应能清晰分辨出界面。</li>
		<li>最后用低密度等密度蔗糖梯度溶液加满离心管（约6 mL）。聚丙烯和超透明开口管应尽可能加满（距管口2至3 mm），以提供足够的管体支撑。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用摆动桶转子在288,000 × g、4 °C条件下对样品进行过夜超速离心。 
	注意：针对前述步骤所用体积，建议离心时间为16至23小时。</li>
	<li>将P1000移液器吸头尖端剪去约5 mm。用该吸头小心吸除上层棕色内膜（IM）层，并将IM组分转移至聚碳酸酯离心瓶中，用于后续超速离心。</li>
	<li>在53%-73%界面之上保留约2 mL蔗糖溶液，以确保下层白色外膜（OM）不被IM组分交叉污染。参照步骤6.4的操作方法，对OM组分进行同样的移液收集（图1）。 
	注意：也可通过针头穿刺离心管底部的方式收集各膜组分，逐滴收集各组分。</li>
	<li>用膜储存缓冲液补满超速离心管中剩余的空间，并通过倒置或移液混匀。将样品置于冰上保存。</li>
	<li>将洗涤并分离后的膜在184,500 × g、4 °C条件下超速离心1小时，进行收集。</li>
	<li>弃去上清液，通过Dounce匀浆器重悬膜沉淀。加入500–1000 μL储存缓冲液。将样品收集于2 mL微量离心管中。</li>
	<li>将细菌膜样品在-20 °C条件下保存。</li>
</ol>
7. 确认双层膜的分离
注意：由于技术误差或某些物种独特的细胞包膜组成，可能导致双层膜分离不完全。为确认分离效果，我们建议使用两种独立的检测方法来定量评估双层膜之间的交叉污染程度。第一种检测方法针对仅存在于内膜（IM）中的NADH脱氢酶的酶活性。第二种检测方法检测主要存在于外膜（OM）中的脂寡糖（LOS）或脂多糖（LPS）的存在情况。
<ol>
	<li>确认外膜已与内膜分离
	<ol>
		<li>使用 Bradford 蛋白质测定法测定每个分离膜组分中的蛋白质浓度。</li>
		<li>取相当于 50 至 500 µg 蛋白质的样品体积加入到一个空的 2 mL 微量离心管中。蛋白质浓度因物种而异，但通常对于肠杆菌科（Enterobacteriaceae）50 µg 已足够。加入适量的 10 mM Tris 缓冲液，使总体积达到 990 μL。将内容物转移至分光光度测定用比色皿中。</li>
		<li>向样品中加入 10 μL 的 10 mg/mL NADH 溶液，并在 340 nm 处测定初始吸光度。</li>
		<li>继续每 30 秒测量一次吸光度，持续 5 分钟。</li>
		<li>整理数据，并绘制每个膜组分的吸光度变化（y 轴）相对于时间变化（x 轴）的曲线图（图 3）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>确认内膜已与外膜分离
	<ol>
		<li>取相当于 50 至 500 µg 蛋白质的样品体积加入到一个空的 2 mL 微量离心管中。蛋白质浓度因细菌种类而异，但通常对于肠杆菌科（Enterobacteriaceae）50 µg 已足够。用磷酸盐缓冲液补足至终体积 100 μL，该缓冲液在此后称为水相。</li>
		<li>向水相中加入 5 μL 蛋白酶 K（储存液为 800 U/mL），并在 59 °C 下孵育过夜。</li>
		<li>将 10 mL Tris 饱和苯酚于 68 °C 预热 10 分钟。</li>
		<li>将经蛋白酶 K 处理的水相样品离心沉淀，按 1:1 比例加入“热”的 Tris 饱和苯酚，剧烈涡旋混匀，并在 68 °C 下孵育 10 分钟。</li>
		<li>将呈乳白色样品从 68 °C 转移至冰水浴中，孵育 10 分钟。</li>
		<li>在 4 °C 下以 2,100 x g 离心 10 分钟。</li>
		<li>将上层水相转移至新管中，若样品不立即使用，则将管置于 -20 °C 保存。</li>
		<li>用 SDS 上样缓冲液稀释样品，并加样至 4–20% Tris-甘氨酸梯度凝胶的加样孔中。</li>
		<li>电泳 45 分钟，或直至染料前沿迁移至凝胶底部。</li>
		<li>按照制造商说明书使用脂多糖（LPS）染色试剂盒对凝胶进行染色。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Thorne, K. J., Thornley, M. J., Glauert, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+analysis+of+the+outer+membrane+and+other+layers+of+the+cell+envelope+of+Acinetobacter+sp%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Chemical analysis of the outer membrane and other layers of the cell envelope of Acinetobacter sp.</a> Journal of Bacteriology. 116, 410-417 (1973).</li>
<li>Geisinger, E., Huo, W., Hernandez-Bird, J., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acinetobacter+baumannii%3A+Envelope+Determinants+That+Control+Drug+Resistance%2C+Virulence%2C+and+Surface+Variability%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Acinetobacter baumannii: Envelope Determinants That Control Drug Resistance, Virulence, and Surface Variability.</a> Annual Review of Microbiology. 73, 481-506 (2019).</li>
<li>Kamischke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Acinetobacter+baumannii+Mla+system+and+glycerophospholipid+transport+to+the+outer+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">The Acinetobacter baumannii Mla system and glycerophospholipid transport to the outer membrane.</a> Elife. 8, (2019).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

该方法将继续帮助研究人员深入理解细胞包膜在细菌生理学和致病过程中的作用。通过连续的超速离心步骤，可获得纯化的总膜、内膜及外膜组分。这些膜组分可被独立地用于验证与膜蛋白定位和功能、跨周质空间的物质转运与运输，以及在不同环境条件下各双分子层组成相关的假设。利用该技术分离得到的膜组分，还可通过动物和细胞模型开展生物学研究，探讨外膜组分（如脂寡糖/脂多糖和外膜蛋白）在致病机制中的具体作用。
我们的实验流程已针对肠杆菌科细菌优化 S. 伤寒沙门氏菌，其产生的LPS分子含有链长可变的O抗原。本方案也适用于模式细菌， E. coli K-12，其已丧失合成O-抗原的遗传能力。使用野生型和O-抗原缺陷型 S. 鼠伤寒沙门氏菌 14028s 和 E. coli K-12菌株DH5α的结果表明，这些微生物的膜分离能力在很大程度上不受O-抗原存在的影响。然而，对于产生脂寡糖（LOS）的细菌，其外膜的分离则有所不同。 A. baumannii 17978，为了分离双分子层，我们需要降低不连续梯度中中等密度蔗糖溶液的浓...

革兰氏阴性菌具有两层膜结构，中间由周质空间和肽聚糖细胞壁隔开1。内膜（IM）包裹细胞质，由对称的磷脂双分子层构成。肽聚糖可抵抗膨压并赋予细菌特定的细胞形态，并通过脂蛋白与外膜（OM）相连2,3。外膜包围周质空间，主要呈不对称结构：内小叶由磷脂组成，外小叶则由称为脂寡糖（LOS）或脂多糖（LPS）的糖脂构成4,5。外小叶中LOS/LPS分子的脂质不对称性及其生物化学特性赋予细胞表面屏障功能，使细菌能够抵御环境中各种有害物质的侵害6,7。
LPS 分子由三个组分构成：脂质A双糖脂、核心寡糖以及O-多糖（即O-抗原）。脂质A是一种多酰基化的双糖脂。核心寡糖由10–15个糖残基组成，称为粗糙型LPS（R-LPS）。核心部分进一步分为内核区和外核区：内核区包含2-酮-3-脱氧-D-甘露辛糖酸（Kdo）以及一个或多个庚糖残基；外核区通常由己糖（如葡萄糖或半乳糖）、庚糖或乙酰氨基糖组成5。外核区在成分和结构上比内核区更具变异性。Salmonella spp. 中仅描述了一种核心结构，而在Escherichia coli中则存在五种不同的核心结构（分别命名为K-12、R1、R2、R3和R4）8。本实验所使用的E. coli K-12 DH5α菌株携带一种突变，导致其产生R-LPS9。R-LPS分子缺失O-抗原部分，其分子量与LOS分子相似。
将O抗原添加到R-LPS上会将这种分子转化为光滑型LPS（S-LPS）。O抗原由短的3-4个碳水化合物亚基构成，具有多种模式，并且链长各异10。一些产生LPS的细菌，如伤寒沙门菌鼠伤寒血清型（Salmonella enterica serovar Typhimurium，S. Typhimurium），在其表面表现出三峰分布的LPS分子10,11。极长链O抗原可包含超过一百个亚基，分子量超过一百千道尔顿。O抗原赋予细菌特定的表面特性，使其能够抵抗抗生素、逃避噬菌体的捕食，并引发疾病。
空肠弯曲菌（Campylobacter）、博德氏菌（Bordetella）、不动杆菌（Acinetobacter）、嗜血杆菌（Haemophilus）、奈瑟菌（Neisseria）及其他一些细菌在其表面生成脂寡糖（LOS）分子而非脂多糖（LPS）分子12。LOS分子由脂质A和核心寡糖组成，但缺乏O-抗原。这类革兰氏阴性菌通过在核心寡糖上添加额外的糖类或糖类组合来修饰其结构，从而改变表面特性12。产生LOS和LPS的微生物均会在脂质A和核心分子的磷酸基团上衍生化带正电荷的基团7。这些修饰包括磷酸乙醇胺、半乳糖胺和氨基阿拉伯糖的取代，其作用是中和表面负电荷，从而抵御阳离子抗菌肽的攻击。革兰氏阴性菌还可对核心寡糖结构进行可变的非化学计量比的糖类取代，或添加额外的Kdo分子，并改变脂质A双糖脂上酰基链的数量7。
从革兰氏阴性菌中分离内膜（IM）与外膜（OM）的能力，对于理解细胞包膜在抗菌药物耐药性和疾病发病机制中的作用至关重要11,12。该方法的衍生技术已被用于推断外膜中蛋白质、磷脂和糖脂组分的组装、维持及重塑机制。
本实验室常规进行细菌脂质组学分析，以研究多种革兰氏阴性菌中由蛋白质介导的脂质调控及脂质功能。本方案中所用体积反映了该实验流程的常规操作，用于通过薄层色谱法和液相色谱-串联质谱法分析非放射性标记的磷脂13,14。
该方案首先将革兰氏阴性菌的冷悬液暴露于高渗透压的蔗糖溶液中，并加入溶菌酶，以使外膜（OM）与下方的肽聚糖层解离（图1）12。随后加入EDTA以促进溶菌酶的渗透，因为螯合二价阳离子会破坏相邻LOS/LPS分子之间的横向静电桥接相互作用15。我们所采用的方法源自一项原始方案，该原始方案要求形成球状体，即一种仅包含质膜和胞质溶胶、但缺乏肽聚糖层和外膜的革兰氏阴性菌细胞形态。尽管在改进后的方法中可能产生球状体，但本技术的成功并不依赖于或旨在形成球状体。相反，在经溶菌酶和EDTA处理后，细菌通过离心迅速收集，并在加压裂解前重悬于较低浓度的蔗糖溶液中。理论上，若形成了球状体，则其释放的外膜应可从处理后细胞的上清液中回收，但本文未详细描述此方法。最终，处理后的细胞经历常规的匀浆和裂解过程，从而提高膜分离步骤的效率与可重复性16。
裂解后，通过超速离心收集总膜，并将其加载到不连续的蔗糖密度梯度中，以分离内膜（IM）和外膜（OM）。经典方法采用更为连续的梯度，由至少五种不同浓度的蔗糖溶液组成11,12。本方案中的不连续梯度由三种蔗糖溶液组成，可将双层膜分离为两个不同的组分17。革兰氏阴性菌外膜中的脂寡糖（LOS）和脂多糖（LPS）分子促使包膜分离为上层的浅棕色低密度内膜组分和下层的白色高密度外膜组分（图1 和 图2）。
Acinetobacter baumannii 是一类重要的多重耐药性人类病原体，其外膜含有 LOS 分子，并形成难以分离的细胞包膜18,19。近期研究表明，本文所介绍方案的一种改进版本可用于分离这些生物体的双层膜结构20。因此，我们对 A. baumannii 17978 菌株应用了该方案。最初，该程序效果不佳。然而，通过调整中密度溶液中的蔗糖浓度，我们显著改善了分离效果（图 2）。我们采用 NADH 脱氢酶活性检测以及 LOS/LPS 提取与检测方法，验证了 A. baumannii、野生型 S. Typhimurium 以及两种缺乏 O-抗原的肠杆菌基因型（即 galE 突变型 S. Typhimurium 和实验室菌株 E. coli DH5α）的膜分离效果（图 3 和 图 4）。
本研究旨在提供一种简化的方案，以可重复地分离革兰氏阴性细菌的膜结构。该实验方案可用于研究这些微生物的多种膜相关分子。

<table><tbody><tr><td>1 L 离心瓶，PC/PPCO，超高速，带密封盖，Nalgene</td><td>VWR</td><td>525-0466</td><td></td></tr><tr><td>1 L Pyrex 培养基储存瓶，带耐高温盖</td><td>VWR</td><td>10416-312</td><td></td></tr><tr><td>2,000 mL 窄口锥形瓶</td><td>VWR</td><td>10545-844</td><td></td></tr><tr><td>4-20% mini PROTEAN 预制蛋白凝胶，12 孔</td><td>BIORAD</td><td>4561095</td><td></td></tr><tr><td>4x Laemmli 上样缓冲液，10 mL</td><td>BIORAD</td><td>1610747</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 无菌聚丙烯离心管</td><td>VWR</td><td>89049-174</td><td></td></tr><tr><td>7 mL Dounce 组织匀浆器，配两个玻璃研杵</td><td>VWR</td><td>71000-518</td><td></td></tr><tr><td>70 mL 聚碳酸酯瓶组件</td><td>Beckman Coulter Life Sciences</td><td>355622</td><td></td></tr><tr><td>琼脂粉</td><td>VWR</td><td>A10752</td><td></td></tr><tr><td>B10P 台式 pH 计，带 pH 探头</td><td>VWR</td><td>89231-664</td><td></td></tr><tr><td>Barnstead GenPure xCAD Plus UV/UF - TOC（台式）</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>50136146</td><td></td></tr><tr><td>Benzonase 核酸酶</td><td>MilliporeSigma</td><td>70746-3</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 二钠盐二水合物 99.0-101.0%，晶体，超纯级，生物试剂，分子生物学级，J.T. Baker</td><td>VWR</td><td>4040-01</td><td></td></tr><tr><td>EmulsiFlex-C3</td><td>Avestin, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiberlite F13-14 x 50cy 固定角转子</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>75006526</td><td></td></tr><tr><td>盐酸 6.0 N</td><td>VWR</td><td>BDH7204</td><td></td></tr><tr><td>IBI Scientific 轨道平台摇床</td><td>Fischer Scientific</td><td>15-453-211</td><td></td></tr><tr><td>LB 肉汤（Miller 培养基）</td><td>VWR</td><td>214906</td><td></td></tr><tr><td>溶菌酶，蛋清来源，超纯级</td><td>VWR</td><td>VWRV0063</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁六水合物</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>NADH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10107735001</td><td></td></tr><tr><td>Optima XPN-80 - IVD</td><td>Beckman Coulter Life Sciences</td><td>A99839</td><td></td></tr><tr><td>Pharmco Products&amp;nbsp;PURE ALCOHOL 200 PROOF GL 4/CS&amp;nbsp;</td><td>Fischer Scientific</td><td>NC1624582</td><td></td></tr><tr><td>苯酚溶液，用含 10 mM Tris HCl（pH 8.0）、1 mM EDTA 的溶液平衡，生物试剂，适用于分子生物学</td><td>Sigma - Millipore</td><td>P4557</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Coomassie Plus（Bradford）蛋白定量检测试剂盒</td><td>Thermofisher</td><td>23238</td><td></td></tr><tr><td>Pro-Q emerald 300 脂多糖凝胶染色试剂盒</td><td>Thermofisher</td><td>P20495</td><td></td></tr><tr><td>Proteacease -50，无 EDTA</td><td>G Biosciences</td><td>786-334</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶 K，分子生物学级</td><td>New England Biolabs</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠 &amp;ge;99.99%</td><td>VWR</td><td>AA45780-22</td><td></td></tr><tr><td>Sorval RC 6 Plus 离心机</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>36-101-0816</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>MilliporeSigma</td><td>SX1075-3</td><td></td></tr><tr><td>SW 41 Ti 摆桶转子</td><td>Beckman Coulter Life Sciences</td><td>331362</td><td></td></tr><tr><td>Tris(羟甲基)氨基甲烷（TRIS，三羟甲基氨基甲烷）&amp;ge;99.9%（干燥基），超纯级，生物试剂，分子生物学级，J.T. Baker</td><td>VWR</td><td>JT4109-6</td><td></td></tr><tr><td>Type 45 Ti 固定角钛转子</td><td>Beckman Coulter Life Sciences</td><td>339160</td><td></td></tr><tr><td>超透明离心管，14 x 89 mm</td><td>Beckman Coulter Life Sciences</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>Vortex-Genie 2 涡旋振荡器</td><td>VWR</td><td>102091-234</td><td></td></tr></tbody></table>

将革兰氏阴性菌细胞包膜分离为内膜和外膜组分的技术方法及对acinetobacter baumannii的优化调整

Separation of the Cell Envelope for Gram-negative Bacteria into Inner and Outer Membrane Fractions with Technical Adjustments for Acinetobacter baumannii

该方法通过将革兰氏阴性菌的包膜分离为总膜、内膜和外膜（OM）组分，并通过后续检测评估双层膜的纯度。与内膜相比，外膜的整体密度更高，这主要归因于外小叶中存在脂寡糖（LOS）和脂多糖（LPS）。LOS和LPS是两亲性糖脂分子，具有相似的结构，均由脂质A双糖脂和核心寡糖取代基组成。然而，只有LPS分子具有第三个亚基，即O-多糖或O-抗原。生物体中存在的糖脂类型和数量会影响其外膜密度。因此，我们测试了糖脂含量不同的细菌是否也可使用本技术成功分离其膜组分。对于产生LPS的生物体，如伤寒沙门氏菌（Salmonella enterica）鼠伤寒血清型和大肠杆菌（Escherichia coli），其膜组分易于分离，且LPS的O-抗原部分不影响双层膜的分离。鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）产生LOS分子，其分子质量与缺乏O-抗原的LPS分子相似；然而，最初这些微生物的膜无法被有效分离。我们推测鲍曼不动杆菌（A. baumannii）的外膜密度低于肠杆菌科细菌，因此调整了蔗糖梯度，最终成功分离出膜组分。因此，该技术可针对其他生物体进行适应性调整和优化。

该技术为分离革兰氏阴性菌的内膜（IMs）和外膜（OMs）提供了一种有效方法。整个操作流程的示意图如下所示（图1）。通常情况下，将培养物按OD值进行归一化处理600 在1升培养基中光密度为0.6–0.8，或在6.0至8.0 × 10之间收获11 细菌细胞的数量将确保收集到适量的膜材料，用于后续分离。
细菌裂解后经超速离心，可在超速离心管底部观察到黏稠的棕色总膜沉淀。刮取沉淀后，经Dounce匀浆器匀浆，并在不连续蔗糖密度梯度上进行超速离心，内膜（IM）与外膜（OM）应如图所示分离图2）。我们发现，20%/53%/73%（w/v）蔗糖密度梯度不足以分离包膜的 A. baumannii，而20%的/45%73% w/v 梯度已足够（图2).
可采用多种分析方法来...

革兰氏阴性细菌具有两个空间上分离的膜结构。外膜与内膜之间由周质空间和肽聚糖层分隔。分离这些微生物双层膜的能力对于理解其生理学和致病机制至关重要。

将革兰氏阴性菌细胞包膜分离为内膜和外膜组分的技术方法及对Acinetobacter baumannii的优化调整

该方法通过将革兰氏阴性菌的包膜分离为总膜、内膜和外膜（OM）组分，最后进行检测以……

研究微生物如何调控各双分子层的化学组成，将有助于我们深入了解抗生素杀菌机制、抗菌耐药性以及疾病发病机制。该技术无需使用去污剂，即可将革兰氏阴性菌的细胞包膜分离为两个明确的组分，因此可在接近天然的环境中对脂质、蛋白质和糖类进行分析。某些步骤具有时间依赖性，需要集中注意力并协调操作。最初可使用一至两个样本，待操作熟练程度提高后，再逐步增加样本数量。每次处理的样本不应超过六个。本实验为多日操作流程，设置视觉检查点有助于评估实验效果与操作误差。在执行某些最终步骤之前，需做好相应准备。从冻存的甘油菌种中挑取细菌，在新鲜的琼脂平板上划线。待菌落生长后，将平板置于4°C保存。挑取单个菌落接种于装有5 mL液体培养基的离心管中，根据需要过夜培养细菌。将过夜培养的细菌培养物用一升优选的肉汤培养基进行回稀释，并将烧瓶进行培养。当达到所需的光密度时，将烧瓶从培养箱中取出并置于冰上。在600纳米处测定培养物的光密度，并计算相当于六至八乘以十的十一次方个细菌菌落形成单位的培养物体积。将此体积的培养物加入离心管中，并确保其余培养物在使用前保持在冰上。在固定角度、高速离心机中，于 7,000 至 10,000 ×g 及 4 °C 条件下离心 10 分钟，使细菌沉淀。小心倾去上清液并弃去。将每份细胞沉淀重悬于12.5毫升缓冲液A中。向细胞悬液中加入一个磁力搅拌子。向每份细胞重悬液中加入180微升浓度为10毫克/毫升的溶菌酶。在通过离心收集经溶菌酶和EDTA处理的细菌后，迅速向细菌中加入蛋白酶抑制剂、氯化镁和核酸酶，并立即用缓冲液B重悬细胞。保持悬液在冰上，搅拌2分钟。接下来，向每份细胞重悬液中加入 12.5 毫升 1.5 毫摩尔的 EDTA 溶液，继续在冰上搅拌 7 分钟。将悬液倒入 15 毫升锥形管中。在 4°C 条件下，以 9,000 至 11,000 ×g 离心 10 分钟。将上清液弃入生物危害废物容器中，并将沉淀物保留在冰上。向每份细胞沉淀中加入25毫升缓冲液B。然后，加入55微升1摩尔的氯化镁、1微升RNase/DNase/核酸酶试剂以及1微升蛋白酶抑制剂混合物。将沉淀重悬于混合液中。充分吹打并涡旋振荡，直至溶液呈现均匀状态。将悬液置于冰上保存。将样品倒入匀浆器样品筒中，并将压力升至20,000 PSI。为避免病原体气溶胶化，在加入细菌悬液前，先用缓冲液B对加压装置进行预处理，并调节压力水平。启动压力腔，并作为预防措施，加入10毫升缓冲液B。将细胞裂解液收集到50毫升锥形管中，置于冰上，同时保持样品处于冰上。为实现完全裂解，重复此过程三至五次。为沉淀残留的完整细胞成分，将裂解后的细菌样品在4°C、6,169 × g条件下离心10分钟。将现在含有匀浆化膜的上清液分装至聚碳酸酯管中，用于超速离心。在4°C条件下，以184,500 × g离心细胞裂解物至少1小时。弃去上清液，将膜沉淀物保留在冰上。使用玻璃Dounce匀浆器，将膜沉淀物重悬于1毫升低密度等密度蔗糖梯度溶液中。然后，用玻璃巴斯德吸管将样品匀浆液转移至1.5毫升微量离心管中，并将管子置于冰上。为制备蔗糖梯度，将聚丙烯或超透明开口离心管保持轻微倾斜的位置。缓慢加入两毫升高密度蔗糖溶液。然后加入四毫升低密度蔗糖溶液。制备密度梯度时，应缓慢加入蔗糖溶液，以避免各层混合。蔗糖层应略微可见，且整体界限清晰。接下来，加入先前用1 mL低密度等密度蔗糖溶液重悬的总膜组分。最后，加入约6 mL低密度等密度蔗糖梯度溶液，补满离心管的剩余部分。使用水平转子在 288,000 × g 和 4 °C 条件下超速离心样品 16 至 23 小时。从 P1000 移液器吸头尖端约五毫米处剪去末端。离心结束后，用移液器去除管中上层的棕色部分。将含有内膜组分的这一层转移至聚碳酸酯离心管中，用于超速离心。保留约两毫升位于53%蔗糖与73%蔗糖界面之上的蔗糖溶液，以确保下方白色的外膜组分不会污染内膜组分。再次使用剪去末端的P1000移液枪头，移除外膜层，并将其转移至另一聚碳酸酯离心管中。用分离的膜储存缓冲液填满聚碳酸酯瓶中的剩余空间，并通过倒置或移液混匀。将样品置于冰上保存。为收集膜，需在4°C条件下，以184,500 × g离心聚碳酸酯瓶1小时。最后，弃去上清液，加入 500 至 1,000 微升储存缓冲液。通过 Dounce 匀浆器重悬膜组分，将样品收集至 2 毫升微量离心管中。将总膜沉淀物刮下后，使用Dounce匀浆器匀浆，并在蔗糖密度梯度上进行超速离心，以分离内膜和外膜。对于某些细菌菌株，20%–53%–73%的蔗糖密度梯度足以实现分离；但对于鲍曼不动杆菌（A. baumannii），该梯度无法有效分离，而采用20%–45%–73%的梯度可成功实现分离。为了评估分离效率，对膜样品进行了NADH脱氢酶检测，该酶位于细菌内膜中。在340纳米处光密度的降低表明该酶的存在。测定野生型S.typhimurium、E.coli K12 DH5a和galE突变型S.typhimurium的内膜和外膜组分各50微克样品的光密度。在检测鲍曼不动杆菌膜组分纯度时，使用了更高浓度的蛋白，因为初步实验表明，当使用50微克蛋白时，鲍曼不动杆菌的NADH脱氢酶相对水平低于其他细菌菌株。为评估内膜组分与外膜组分之间的交叉污染，提取并可视化了脂多糖（LPS）和脂寡糖（LOS）。将提取物上样至聚丙烯酰胺凝胶，并用Pro-Q Emerald 300染色。鲍曼不动杆菌是一种高度优先关注的多重耐药人类病原体。本实验方案有助于研究人员理解脂寡糖、磷脂和脂蛋白在这一独特且重要病原体的耐药性及毒力机制中的作用。该方法适用于对革兰氏阴性菌双层膜中常见的磷脂、糖脂类碳水化合物、蛋白质及小分子进行后续分析。

separation-cell-envelope-for-gram-negative-bacteria-into-inner-outer

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科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

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革兰氏阴性菌内膜与外膜组分的分离

来源：Watson, D. C., et.al. 大肠杆菌及其他细菌来源细胞外囊泡的可扩展分离与纯化. J. Vis. Exp.

细菌外膜来源的胞外囊泡的分离与富集

来源：Figueroa, D. et. al. 细菌球状体与原生质体的制备及可视化以表征抗菌肽的定位。 J. Vis. Exp.

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