Name: 自由游泳鱼中可移动的特龙对神经元的无线电生理记录 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: 学习在自由游动的金鱼中进行无线细胞外神经信号记录的方法。该防水装置包含四极电极和微驱动器，可在自然行为状态下实时采集神经数据，为水生动物神经科学研究提供新工具。

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我们感谢Nachum Ulanovsky及Ulanovsky实验室成员提供的所有帮助。此外，我们感谢Tal Novoplansky-Tzur在技术方面给予的有益协助。本研究获得了以色列科学基金会-FIRST项目（资助号：281/15）以及通过内盖夫本-古里安大学农业、生物与认知机器人计划由赫尔姆斯利慈善信托基金提供的财政支持，特此致谢。

所有手术操作必须经过动物福利本地伦理委员会（例如 IACUC）批准。
1. 微驱动装置外壳的构建
<ol>
	<li>制作外壳时，使用锯子将1 mm厚的黄铜板切割成19 mm × 29 mm × 1 mm的板片。在长边两侧各切割两个5.5 mm的狭缝，狭缝方向垂直于边缘，且每个狭缝距离窄边6.5 mm（图2A）。</li>
	<li>使用钳子将长边两侧狭缝之间的区域向内弯折，然后将底部向内弯折，上部向外弯折，从而形成外壳（图2B,C）。</li>
	<li>使用3 mm钻头在外壳上钻出用于螺钉的孔。 
	注意：这些孔稍后将用于将外壳固定到记录仪盒上（图2D）。</li>
	<li>对外壳的接缝处进行焊接。</li>
	<li>使用细圆锉在外壳底部加工出一个半径为1.5 mm的小型半圆形狭缝（图2E）。 
	注意：该狭缝稍后用于插入不锈钢管以引导电极。</li>
	<li>使用1 mm钻头在外壳背面钻一个用于四极电极（tetrodes）的孔（图2F）。 
	注意：外壳的3D模型见补充文件 housing.stl。</li>
</ol>
2. 微驱动装置的构建
<ol>
	<li>使用切割工具，从单排针座条上截取一段三针部分（图1H）。用镊子拔出中间的针脚。</li>
	<li>使用切割工具将剩余的针脚切割至10 mm长度（比螺丝长度短2 mm）。另一种方法是使用更长的螺丝（见步骤2.4）。</li>
	<li>使用#65钻头在中间针脚孔位置钻孔，并使用00−99丝锥攻螺纹。</li>
	<li>将微型驱动器与黄铜片（7.5 mm × 2.5 mm × 0.6 mm，见补充图4）组装，使黄铜片与针脚接触。将螺丝（#00-90圆头，12 mm，黄铜材质）依次穿过第一片黄铜片、针座螺纹孔和第二片黄铜片。最后在螺丝末端装上螺母，并轻轻拧紧组装好的微型驱动器。</li>
	<li>将针脚与黄铜片焊接在一起，并将螺母与螺丝顶端焊接固定。</li>
	<li>在微型驱动器外壳侧面的四个位置，将微型驱动器焊接到外壳上。</li>
	<li>截取一段长度为6 mm、内径为1.5 mm的不锈钢管，以及另一段长度为3 mm、内径为1.2 mm的不锈钢管。对管端进行抛光处理，以避免锐边。</li>
	<li>使用环氧树脂将6 mm长的不锈钢管粘接到微型驱动器外壳底部的小半圆形狭缝处。将3 mm长的不锈钢管粘接到针座上，并与外壳上的6 mm长管对齐。</li>
	<li>截取两段长度均为5 cm、直径为0.64 mm的硅胶管，以及一段长度为5 cm、直径为0.250 mm的聚酰亚胺管。</li>
	<li>将这三根管依次插入两段不锈钢管中。使用氰基丙烯酸酯胶水将这些管固定在连接于针座的不锈钢管上。将微型驱动器完全旋至顶部，然后从上下两端剪去不锈钢管中多余的管材。 
	注意：带外壳的微型驱动器现已准备就绪，可供使用（图1C）。</li>
</ol>
3. 准备四极电极阵列
<ol>
	<li>为了制作一个每个四极电极上带有四个电极的双四极电极植入体，准备八根长度均为 12 cm、直径为 25 µm 的钨丝，表面涂有 Formvar 绝缘层。 
	注意：相同的结构设计也可用于容纳四个四极电极。</li>
	<li>将一个16通道电极接口板（EIB-16）PCB（见材料表）的支架置于显微镜下。</li>
	<li>使用尖端柔软的镊子和打火机，用火焰烧除八根导线每根一端的绝缘涂层。 
	注意：此步骤可确保导线后续能与PCB连接器实现良好连接。</li>
	<li>将一根导线带绝缘层的一端插入EIB-16的一个孔中。插入插针后用钳子压紧。通过测量插针与导线裸露端之间的电阻来检查导通性。 
	注意：电阻值通常在几十欧姆量级。</li>
	<li>对全部八根导线重复步骤 3.4。</li>
	<li>在每根导线的末端，使用胶带将四根导线分为两组并分别缠绕固定。 
	注意：每组导线后续将被粘合在一起形成一个四极电极。</li>
	<li>剪取一段长度为 12 cm、直径为 50 µm 的钨丝，并将其连接至 EIB-16 的一个连接点。 
	注意：该导线将作为参考电极。</li>
	<li>剪取两根长度为 12 cm、直径为 75 µm 的裸银丝，作为记录仪的接地线。将这两根导线焊接到 EIB-16 的接地连接点上。</li>
	<li>将 EIB-16 固定在电动旋转装置上方，将一组四根导线的胶带端固定在电动旋转装置上。顺时针旋转130圈，随后逆时针旋转20圈。然后涂上氰基丙烯酸酯胶水以包裹四极电极。</li>
	<li>等待胶水完全固化后，靠近胶带处剪断四极电极。</li>
	<li>对第二个四极电极重复步骤 3.9 和 3.10。 
	注意：由此得到最终的双四极电极阵列（图 1D）。</li>
</ol>
4. 植入物的组装
<ol>
	<li>将微型驱动器完全拧到底。</li>
	<li>使用1个3M十字圆头螺丝，将EIB-16固定到PVC板上。</li>
	<li>使用软头镊子，将所有簇状电极（tetrodes）和导线从记录仪盒盖前部的孔中穿出。</li>
	<li>使用2个6M十字平头螺丝，将PVC板固定到记录仪盒盖上。确保EIB-16连接器方向正确，以便记录仪能够安装在EIB-16上。务必固定好EIB-16，以避免记录信号中出现运动伪迹。</li>
	<li>使用环氧树脂将导线与盒体密封。用量应尽量少，因为主要密封将在后续使用室温硫化硅橡胶（RTV）完成。</li>
	<li>使用2 mm螺丝将微型驱动器外壳固定到记录仪盒盖上。</li>
	<li>将簇状电极和所有导线从微型驱动器外壳后部的孔中穿出。将簇状电极穿过微型驱动器内的两根硅胶管。将50 µm的钨丝穿过微型驱动器内的聚酰亚胺管。</li>
	<li>在管子顶端涂抹氰基丙烯酸酯胶水，将簇状电极和导线粘附于对应的管子上，以确保其运动与微型驱动器保持一致。将微型驱动器完全拧至顶部位置。</li>
	<li>在微型驱动器外壳内部暴露的簇状电极和导线上涂抹软质石蜡（见材料表），以防止移动。</li>
	<li>使用加热的剃须刀片切割一个12 mm × 14.5 mm的培养皿底部作为窗口。用环氧树脂将该窗口粘接到微型驱动器外壳前端。确保接地导线位于窗口外部。</li>
	<li>在记录仪盒盖与微型驱动器外壳之间的暴露簇状电极和导线上涂覆RTV涂层。</li>
	<li>待RTV固化后，在盒内放入一个小重物并将其整夜浸入水中，以确认盒体无漏水现象。</li>
	<li>使用锋利的剪刀将簇状电极和参考电极剪至所需长度。</li>
	<li>将标记过的挤出聚苯乙烯泡沫（见材料表）粘附到盒体上。调整其尺寸，使其在水浴中浸没时浮力达到平衡。</li>
	<li>将簇状电极尖端浸入铂黑溶液中，并施加直流电流（-0.2 µA）进行电极镀膜，以调节电极阻抗至所需值。使用多通道电极阻抗测试仪（见材料表）进行镀膜和阻抗测量。 
	注意：在金鱼的大脑皮层（pallium）中，40 kOhm的阻抗值效果最佳。根据具体应用需求，可通过调整铂黑镀层来调节电极阻抗10,11。</li>
</ol>
5. 麻醉剂配制——1% MS-222 储存液
注意：麻醉剂配制过程中使用了粉末状 MS-222，该物质为致癌物。因此，步骤 5.2 和 5.3 必须在化学通风橱中佩戴手套操作。
<ol>
	<li>向一个容量超过 100 mL 的试管中加入 100 mL 水。</li>
	<li>在化学通风橱内，将一次性称量盘放在天平上。用药匙称取 1 g MS-222 粉末，然后将其加入试管中。</li>
	<li>充分振荡试管。 
	注意：MS-222 在液态时可在化学通风橱外操作，需佩戴手套，但无需佩戴口罩。</li>
	<li>将一次性称量盘放在天平上。用药匙称取 2 g 碳酸氢钠粉末，然后将其加入试管中。充分振荡试管。</li>
</ol>
6. 准备鱼类头骨
注意： 此时，鱼已准备好进行植入手术。手术前，需确保所有组件和用品均已通过适当程序灭菌。此步骤需要使用一个离水的U形鱼固定装置。在本方案中，使用一个可容纳体长（头至尾）15 cm的金鱼的铝制固定器。该系统可在将鱼体保持在水面之外的同时，向其鳃部灌注含氧水。详见Vinepinsky等8。
<ol>
	<li>将鱼置于含0.02% MS-222的水浴中20分钟，直至鱼进入睡眠状态。</li>
	<li>戴上无菌手套，将鱼从水中取出并放入固定装置中。 
	注意：灌注鱼体的含氧水中含有浓度为0.02%的MS-222，以确保鱼在手术过程中持续处于麻醉状态。</li>
	<li>使用无菌刮勺，在预定手术区域上方的皮肤涂抹5%利多卡因糊剂，持续10分钟，然后清除利多卡因。 
	注意：请参考适当的大脑图谱以准确定位特定脑区。</li>
	<li>使用无菌15号刀片手术刀，切除植入区域颅骨上方的皮肤。</li>
	<li>使用配备0.7 mm钻头的牙科钻，在颅骨上钻四个孔。在插入螺钉前，立即在每个孔内涂上氰基丙烯酸酯胶水，并插入1 mm直径、3 mm长的螺钉。</li>
	<li>使用牙科抛光器，将牙科水泥涂抹于螺钉及暴露颅骨的周围边缘。</li>
	<li>使用牙科钻，在目标脑区上方颅骨处钻出一个直径为5 mm的孔。使用精细镊子和软组织纸小心清除颅骨与脑组织之间的脂肪组织，暴露目标脑区。注意避免损伤颅骨下方的大型血管。 
	注意：此步骤完成后，鱼已准备好进行探针植入。此处仅描述本方案特有的主要操作步骤。其他多种术后操作（如动物健康状况的详细记录、手术器械和区域的消毒灭菌等）未予列出或讨论，因其适用于所有鱼类或小型动物手术。</li>
</ol>
7. 植入探针
注意：为完成本方案的最后一步，需要使用一种操纵器，以便在将植入物插入大脑时固定其位置。
<ol>
	<li>使用操纵器固定记录仪盒盖，使四极电极朝下指向鱼脑。</li>
	<li>弯曲参考电极，使得当四极电极插入脑内时，参考电极仍位于脑外。</li>
	<li>剪裁接地线使其适配颅骨。可选地，将一根接地线连接至其中一个颅骨螺钉。</li>
	<li>降低植入装置，使电极插入脑组织，同时微驱动装置外壳的底部靠近颅骨。</li>
	<li>开始将植入装置固定到颅骨上，先在外壳与最近的颅骨螺钉之间涂抹少量牙科水泥。</li>
	<li>待第一部分牙科水泥固化后，继续涂抹牙科水泥，封闭颅骨上方的开口及所有暴露的颅骨。 
	注意：通常需要多次涂抹牙科水泥，才能完全覆盖所有暴露的颅骨区域。</li>
	<li>将记录仪和电池安装进盒内，并用所有螺丝密封盒体。</li>
	<li>根据实验所用鱼类的种类，施用抗生素和局部止痛药。</li>
	<li>用新鲜水冲洗鱼的鳃部，直至鱼开始苏醒。将鱼从固定装置中取出，并放回其原饲养水箱中。 
	注意：手术后60分钟内，鱼可完全恢复。</li>
	<li>确保鱼能够自由游动并携带植入装置（图3，补充视频1）。如有需要，调整记录仪盒上方挤出聚苯乙烯泡沫的尺寸，使鱼能轻松保持平衡。</li>
</ol>

<ol><li>Jacobson, M., Gaze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Types+of+visual+response+from+single+units+in+the+optic+tectum+and+optic+nerve+of+the+goldfish%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+Journal+of+Experimental+Physiology+and+Cognate+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Types of visual response from single units in the optic tectum and optic nerve of the goldfish.</a> Quarterly Journal of Experimental Physiology and Cognate Medical Sciences. 49 (2), 199-209 (1964).</li>
<li>Ben-Tov, M., Donchin, O., Ben-Shahar, O., Segev, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pop-out+in+visual+search+of+moving+targets+in+the+archer+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Pop-out in visual search of moving targets in the archer fish.</a> Nature Communications. 6, 6476(2015).</li>
<li>Zottoli, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+the+startle+reflex+and+Mauthner+cell+auditory+responses+in+unrestrained+goldfish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Correlation of the startle reflex and Mauthner cell auditory responses in unrestrained goldfish.</a> Journal of Experimental Biology. 66 (1), 243-254 (1977).</li>
<li>Canfield, J. G., Rose, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+Mauthner+neurons+during+prey+capture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Physiology+A%22%5BJournal%5D)">Activation of Mauthner neurons during prey capture.</a> Journal of Comparative Physiology A. 172 (5), 611-618 (1993).</li>
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<li>Orger, M. B., de Polavieja, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+behavior%3A+opportunities+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Zebrafish behavior: opportunities and challenges.</a> Annual Review of Neuroscience. 40, 125-147 (2017).</li>
<li>Vanwalleghem, G. C., Ahrens, M. B., Scott, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+whole-brain+neuroscience+in+larval+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Integrative whole-brain neuroscience in larval zebrafish.</a> Current Opinion in Neurobiology. 50, 136-145 (2018).</li>
<li>Vinepinsky, E., Donchin, O., Segev, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wireless+electrophysiology+of+the+brain+of+freely+swimming+goldfish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Wireless electrophysiology of the brain of freely swimming goldfish.</a> Journal of Neuroscience Methods. 278, 76-86 (2017).</li>
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<li>Ferguson, J. E., Boldt, C., Redish, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creating+low-impedance+tetrodes+by+electroplating+with+additives%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+and+Actuators+A%3A+Physical%22%5BJournal%5D)">Creating low-impedance tetrodes by electroplating with additives.</a> Sensors and Actuators A: Physical. 156 (2), 388-393 (2009).</li>
<li>Arcot Desai, S., Rolston, J. D., Guo, L., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+impedance+of+implantable+microwire+multi-electrode+arrays+by+ultrasonic+electroplating+of+durable+platinum+black%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroengineering%22%5BJournal%5D)">Improving impedance of implantable microwire multi-electrode arrays by ultrasonic electroplating of durable platinum black.</a> Frontiers in Neuroengineering. 3, 5(2010).</li>
<li>Lewicki, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+methods+for+spike+sorting%3A+the+detection+and+classification+of+neural+action+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22Network%3A+Computation+in+Neural+Systems%22%5BJournal%5D)">A review of methods for spike sorting: the detection and classification of neural action potentials.</a> Network: Computation in Neural Systems. 9 (4), R53-R78 (1998).</li>
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<li>Sendra, S., Lloret, J., Rodrigues, J. J., Aguiar, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Underwater+wireless+communications+in+freshwater+at+2.4+GHz%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Communications+Letters%22%5BJournal%5D)">Underwater wireless communications in freshwater at 2.4 GHz.</a> IEEE Communications Letters. 17 (9), 1794-1797 (2013).</li>
<li>Lloret, J., Sendra, S., Ardid, M., Rodrigues, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Underwater+wireless+sensor+communications+in+the+2.4+GHz+ISM+frequency+band%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors%22%5BJournal%5D)">Underwater wireless sensor communications in the 2.4 GHz ISM frequency band.</a> Sensors. 12 (4), 4237-4264 (2012).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案详细介绍了将四极电极阵列植入自由游动的金鱼端脑的步骤。该技术采用一种神经记录仪，可放大并记录来自最多16个通道的信号，同时结合一个可调节脑内电极位置的微型驱动装置。微型驱动装置使得能够在脑内调整电极位置，以优化记录效果。
该方案可轻松修改，用于记录其他脑区（参见Vinepinsky等人的研究8，其中使用类似技术记录视顶盖的活动）或任何体长15 cm及以上（约相当于一条金鱼从头到尾的长度，体重约100克）的水生动物。此外，只要数据记录仪的通信频率能够穿透水体，该方案即可适配于任何类型的数据记录仪。本研究中使用的记录仪采用900 MHz的射频进行通信，可穿透约20 cm深的水层。2.4 GHz的射频也可穿透约15 cm的淡水。更低的频率或其他替代方案可能获得更优的效果13,14,15。本方案采用了一个包含八个记录通道的双四极子电极阵列。此外，该方案...

鱼类是种类最多、多样性最丰富的脊椎动物类群，与其他脊椎动物一样，它们表现出复杂的认知能力，例如导航、社交、睡眠、捕食等。然而，调控鱼类行为的神经机制在很大程度上仍不清楚。
在过去几十年中，对固定鱼类的细胞外记录主要用于研究行为神经基础的各个方面1,2。尽管该技术适用于某些感觉系统，但在固定动物中，要研究行为神经基础的完整谱系，即使并非完全不可能，也极为困难。早期进展包括对束缚状态下游泳鱼类的Mauthner细胞进行记录3,4。然而，Mauthner细胞异常巨大，所记录到的动作电位幅度可高达数毫伏（mV），这为记录提供了便利。随后，Canfield等人首次提出利用束缚动物记录鱼类端脑神经活动的概念验证5。另一种近期用于记录鱼类神经活动的技术是钙成像（参见Orger与de Polavieja6以及Vanwalleghem等人7的综述）。该技术最初是为斑马鱼幼体开发的，因为其皮肤和颅骨在幼体阶段具有透明性。然而，该技术无法用于研究发育后期阶段的复杂行为。
本文介绍了一种记录自由游动鱼类脑部细胞外神经活动的新技术。该技术是对 Vinepinsky 等人8所述方案的改进版本，主要创新在于增加了一个微型驱动装置，使得术后能够调节电极的位置。该技术旨在利用一组四极电极记录金鱼端脑的神经活动，电极通过微型驱动装置连接至神经数据记录仪。整个装置为无线设计，并固定在鱼的颅骨上。通过添加一个小浮子，使系统的比重与水的比重相匹配，从而使鱼能够自由游动。
该技术基于使用一种神经数据记录仪，可对信号进行放大、数字化，并将其存储在设备自带的存储器中。记录仪的遥测系统用于启动和停止记录，以及与摄像机进行同步。在本方案中，采用一个16通道神经记录仪，与微型驱动装置一同嵌入防水盒内。
微型驱动器组件由两个主要部分构成：微型驱动器本身和微型驱动器外壳（图1A,B）。外壳用于固定微型驱动器和四极记录电极，并作为颅骨与记录盒之间的锚定点（图1C）。PVC材质的记录盒通过机械加工制成，并使用O形圈进行密封（图1E-G，另见补充图1、补充图2和补充图3中的三维[3D]示意图）。在记录盒的一端附有一块聚苯乙烯泡沫，用于补偿植入物的重量，使鱼类获得中性浮力的植入装置。本方案中所述微型驱动器的构建方法基于Vandecasteele等9提出的方法，并对其进行了修改，以实现将微型驱动器固定于外壳的结构（图1A）。文中展示了所有主要步骤。
本方案中所述制备鱼颅骨的步骤与Vinepinsky等人8所报道的方法类似，方案中对此进行了简要描述。手术后一天，鱼通常已完全从麻醉效应中恢复，可进行行为学实验。请注意，可通过旋转微型驱动器螺丝来调整四极电极的位置。该螺丝每完整旋转一圈前进300 µm，建议每次推进75 µm，直至到达目标脑区。应参考合适的脑图谱以准确定位特定感兴趣脑区。每次因更换电池或存储卡对鱼进行麻醉时，建议检测电极的阻抗。

<table><tbody><tr><td>0.7 mm 圆形钻头</td><td></td><td></td><td>与钻机兼容。</td></tr><tr><td>15号刀片手术刀</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>16 通道 PCB 板</td><td>Neurlynx</td><td>EIB-16</td><td></td></tr><tr><td>1x3M 菲利普斯平头螺丝</td><td></td><td></td><td>不锈钢。任意类型。</td></tr><tr><td>1x3M 菲利普斯圆头螺丝</td><td></td><td></td><td>不锈钢。任意类型。</td></tr><tr><td>27 cm × 19 cm × 1 mm 黄铜板</td><td></td><td></td><td>见图2</td></tr><tr><td>2个6M十字槽平头螺钉</td><td></td><td></td><td>不锈钢。任意类型。</td></tr><tr><td>3140 RTV 涂层</td><td>戴 crowning</td><td>2767996</td><td></td></tr><tr><td>75 &amp;micro;m 银丝</td><td>A-M Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>黄铜机制螺钉 #00-90</td><td></td><td>947-1006</td><td></td></tr><tr><td>黄铜板 7.5 mm × 2.5 mm × 0.6 mm</td><td></td><td></td><td>提供了一幅三维图。参见补充文件1</td></tr><tr><td>镀膜钨丝 25&amp;micro;m</td><td>加州细丝公司</td><td>5000160</td><td>根据应用需求，可使用各种类型的导线制作四极电极。常用的导线为镍铬合金导线，可选用较小直径的型号（例如 A-M systems，762000）。</td></tr><tr><td>镀层钨丝 50 &amp;micro;m</td><td>A-M Systems</td><td>795500</td><td>可用其他低阻抗导线替代</td></tr><tr><td>氰基丙烯酸酯胶水</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>牙科抛光器</td><td>ComDent UK</td><td></td><td>任何小型无菌不锈钢工具均可。</td></tr><tr><td>牙科水泥 - GCFujiPLUS</td><td>GC</td><td>431011</td><td>其他牙科水泥可能也适用，但我们从未尝试过其他种类。</td></tr><tr><td>牙科钻头或指甲打磨钻</td><td></td><td></td><td>牙科钻头价格昂贵，指甲打磨钻可作为廉价替代品。</td></tr><tr><td>钻头 #65</td><td></td><td>947-65</td><td></td></tr><tr><td>快速固化环氧树脂</td><td></td><td></td><td>任何5分钟固化的环氧树脂均可用于此处。</td></tr><tr><td>带O形圈密封的记录仪盒</td><td></td><td></td><td>提供了一幅三维示意图，参见补充文件1-3。该盒子应通过机械加工制造（不要使用3D打印机）。应使用透明材料，以便能够观察记录仪上的指示LED灯。</td></tr><tr><td>电动旋转装置</td><td></td><td></td><td>按所述定制制作 &quot;Open Ephys&quot; 网站。也可从 neurolynx 购买&quot;Tetrode Spinner 2.0&quot;）或其他方式构建。</td></tr><tr><td>Mouselog-16 神经记录仪</td><td>Deuteron Technologies Ltd</td><td></td><td>目前市场上有多种神经记录仪可供选择，包括：SpikeGadget（UH32，32通道）以及 Alexei Vyssotski 开发的 Neurologger 2/2A/2B。需要注意的是，重量并非主要限制因素，因其可通过浮力泡沫塑料进行配重平衡。</td></tr><tr><td>MS-222</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E10521</td><td>Ethtl 3-氨基苯甲酸甲酯磺酸盐 98%</td></tr><tr><td>Nano-Z 镀膜</td><td>White Matter LLC</td><td></td><td>纳米Z可从多家供应商购买。可使用任何阻抗测量仪，例如 IMP-1 / 6662 / 2788，BAK Electronics。</td></tr><tr><td>PCB 引脚</td><td>Neurlynx</td><td>Neuralynx EIB 针脚</td><td></td></tr><tr><td>聚酰亚胺管 250 &amp;micro;m</td><td>A-M Systems</td><td>822000</td><td></td></tr><tr><td>可充电电池</td><td></td><td></td><td>3.7 V 锂聚合物电池，370 mAh。可支持约 6 小时的录制。可根据需要选用更小或更大的电池，以减轻重量或延长录制时间。</td></tr><tr><td>硅胶管 0.64 mm</td><td>A-M Systems</td><td>806100</td><td></td></tr><tr><td>不锈钢 1.5 mm</td><td>A-M Systems</td><td>846000</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>轻敲 #00-90</td><td></td><td>947-1301</td><td></td></tr><tr><td>凡士林</td><td></td><td></td><td>可使用任何类型的软性石油类皮肤保护剂。</td></tr></tbody></table>

自由游动鱼类中通过可移动四极电极进行神经元无线电生理记录

Wireless Electrophysiological Recording of Neurons by Movable Tetrodes in Freely Swimming Fish

尽管鱼类占所有脊椎动物的大多数，但调控鱼类行为的神经机制在很大程度上仍不清楚。能够记录自由游动鱼类的脑活动将极大推动鱼类行为神经基础的研究。此外，精确控制脑内记录位置对于研究鱼类大脑不同区域之间协调的神经活动至关重要。本文介绍了一种可在自由游动鱼类脑内进行无线记录并精确控制记录深度的技术。该系统基于一种神经记录仪，并结合一种新型的可与水环境兼容的植入装置，该装置可通过微驱动控制的四极电极调节记录位置。通过在金鱼端脑中的记录，展示了该系统的性能。

在记录过程中，金鱼在一个方形水族箱中自由游动，同时记录其端脑的神经活动。这些实验的目的是研究单个细胞的神经活动如何决定鱼的行为。为此，需要在记录的数据中识别出放电活动。记录过程中，脑活动信号由数据记录仪以 31,250 Hz 的频率进行数字化，并通过 300 Hz 的高通滤波。随后，在离线分析中对信号施加带通滤波（300−5,000 Hz），并将预分类的原始数据按每个四极电极的通道和参考通道进行分离（图 4A）。接着，使用常规的 spike 分类算法12来表征单个细胞的活动。首先，根据每个通道的噪声水平，手动设定最小 spike 幅值阈值对各通道进行筛选。其次，由于四极电极的尖端不在同一位置，且参考电极位于脑外，因此出现在多个四极电极或参考通道中的 spike 也被过滤掉。然后，对过滤后的数据通过 spike 形态、持续时间、峰间间隔（连续动作电位之间的时间必须符合神经元的不应期）以及主成分分析（PCA）进行人工聚类和进一步筛选。单...

本文介绍了一种用于记录自由游动金鱼脑部细胞外神经信号的新型无线技术。记录装置由两个四极电极、一个微型驱动器、一个神经数据记录仪和一个防水外壳组成。除数据记录仪及其连接器外，所有部件均为定制。

调控鱼类行为的神经机制在很大程度上仍不清楚，尽管鱼类占所有脊椎动物的大多数。记录大脑活动的能力……

我们开发了一种从自由游动鱼类脑部记录细胞外神经信号的新方法。该方法为研究鱼类行为背后的神经机制开辟了新途径。此技术有效且防水，因此可在鱼类于水箱中自由游动时进行信号记录。此外，可以通过内置的微驱动装置控制记录位置。我们实验室的技术员 Tal Zoor-Novoplansky 将协助我演示该操作步骤。在构建外壳时，使用一块尺寸为 19 毫米 × 29 毫米 × 1 毫米的黄铜板。在长边两侧各开一个5.5毫米的狭缝，狭缝垂直于边缘。狭缝应距离窄边6.5毫米。使用钳子将长边两侧狭缝之间的区域向内折叠。然后将底部向内折叠，上部向外折叠，形成外壳。接着，使用直径为3毫米的钻头在外壳上钻出用于螺钉的孔，并将外壳的侧面进行焊接。使用细圆锉在外壳底部加工出一个半径为1.5毫米的小半圆形狭缝。使用一个1毫米的钻头，在套管背面为四极电极钻一个孔。首先，使用切割工具从单排针状插头条上截取一段三针部分。然后用镊子将中间的针脚拔出。接下来，使用切割工具将剩余的针脚切割至10毫米长度。使用65号钻头在中间的针孔位置钻孔，并使用双零99丝锥攻螺纹。组装微型驱动器和黄铜板。将一颗螺丝依次穿过第一块黄铜板、针座螺纹和第二块黄铜板。最后，在螺丝上装上一个螺母，并轻轻拧紧组装好的微型驱动装置。将针脚与黄铜板焊接在一起，并将螺母与螺丝的尖端焊接在一起。此后，在微型驱动器黄铜板侧面的四个点处将微型驱动器焊接到微型驱动器外壳中。使用环氧胶将一段长六毫米的不锈钢管粘接到微型驱动器外壳底部的小半圆形狭缝处。将一段长三毫米的不锈钢管粘接到针头上，使其与外壳上的六毫米长不锈钢管对齐。将制备好的硅胶管和聚酰亚胺管插入两根不锈钢管中，并使用氰基丙烯酸酯胶水将其粘接到与针座相连的不锈钢管上。然后，将微型驱动装置完全旋紧至顶部，从两根钢管的顶端和底端剪去多余的管材。接着，剪取两根直径为75微米、长度为12厘米的裸银线，将其一端焊接到电极接口板的接地连接处，另一端焊接到所有未使用的通道上。将一根准备好的钨丝插入16通道电极接口板的其中一个孔中。将一根插针放入孔内，并用钳子压紧。测量插针与钨丝未编码端之间的电阻，以检查导通性。对所有准备好的导线重复此过程，包括一根50微米的导线作为参比电极。然后将电极导线分为两组，每组四根，并用胶带在每根导线末端将它们捆在一起，参比电极导线单独放置。将电极接口板置于电动旋转装置上方，将其中一组四根导线的胶带端放置在装置上。顺时针旋转130圈，随后逆时针旋转20圈。然后涂抹氰基丙烯酸酯胶水以覆盖四极电极。待胶水固化后，将四极电极靠近胶带处剪断。对另一个四极电极重复此旋转、粘合和切割过程。首先，用两个毫米螺丝将微驱动装置外壳固定到记录盒上。将四极电极和参考电极从微驱动装置外壳后部的孔中穿出。将四极电极穿过两根硅胶管，并将50微米的钨丝穿过聚酰亚胺管。将微型驱动器完全旋到底部，然后在管子顶端涂上氰基丙烯酸酯胶水，以将四极电极和导线固定在各自的管子上，并确保其运动与微型驱动器保持一致。再将微型驱动器完全旋至顶部。在微驱动装置外壳内的暴露的四极电极和导线上涂抹软质石蜡油，以防止移动。使用环氧树脂将预先切割好的培养皿底部窗口固定在微驱动装置外壳的前方，注意确保接地导线位于窗口外部。接着，在记录仪盒盖与微驱动装置外壳之间的暴露四极电极和导线上涂抹室温硫化涂层。使用锋利的剪刀将四极电极和参考导线剪至所需长度。随后将标有记号的渗出聚苯乙烯泡沫固定到盒子上。调整其尺寸，使其浸入水浴时浮力达到平衡。将鱼麻醉后，将其从水中取出并放入固定装置中。使用无菌刮勺在指定手术部位上方的皮肤上涂抹5%利多卡因软膏，作用10分钟。随后去除利多卡因软膏。使用无菌的15号刀片手术刀去除预定植入区域颅骨上方的皮肤。然后使用配备0.7毫米钻头的牙科钻在颅骨上钻四个孔。在其中一个孔上涂抹氰基丙烯酸酯胶水，并立即插入一颗1毫米的螺钉。对剩余的钻孔重复此过程。之后，使用牙科抛光器将牙科水泥涂抹在螺钉以及暴露的颅骨边缘。使用牙科钻头在目标脑区上方钻一个直径为5毫米的孔。使用精细镊子和软组织纸去除颅骨与脑组织之间的脂肪组织，暴露脑区目标区域，注意不要损伤颅骨下方的大型血管。首先，降低植入物位置，使电极插入脑组织，同时微驱动装置外壳的底部靠近颅骨。开始将植入物固定到颅骨上，方法是在外壳与最近的颅骨螺钉之间涂抹少量牙科水泥。在牙科水泥的第一部分固化后，添加更多的牙科水泥，封闭颅骨上方的孔洞以及所有暴露的颅骨区域。用新鲜水冲洗鱼的鳃以使其苏醒，随后将鱼从固定装置中取出，并放回其原饲养缸中。确保鱼能够自由游动，且植入物无碍。这些实验的目的是研究单个细胞的神经活动如何编码鱼类的行为。为了实现这一目标，将一个四极电极阵列植入自由游动的金鱼端脑中，以记录其神经活动。记录过程中，脑电活动由数据记录仪以 31,250 赫兹的频率进行数字化，并在 300 赫兹处进行高通滤波。然后，对信号应用离线带通滤波器，将预分类的原始数据分离为每个四极记录通道和参考通道。接下来，使用常见的 spike 排序算法来表征单个细胞的活动。首先，通过最小 spike 幅值阈值对每个通道进行手动筛选。出现在多个四极线电极或参考通道中的峰电位也会被过滤。检测到的峰电位随后通过波形、持续时间、峰电位间间隔以及主成分分析进行人工聚类和筛选。手术前检查植入物的完整性非常重要。可以使用标准阻抗计检查四极电极，并应在水下检查盒子是否存在泄漏。只要动物体型足够大以容纳该系统，此方法即可修改后适用于多种水生动物。这有助于研究其行为背后的神经机制。

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