采用耗尽法研究短肽在溶液分散无机纳米颗粒上的吸附

蛋白质和多肽与无机材料之间的相互作用是一种基本现象，在纳米技术、生物材料和生物技术领域具有重要意义。理解此类现象的第一步是揭示基本的物理化学常数，例如吸附常数、吉布斯自由能、焓、熵以及极限吸附量，这些参数可通过建立吸附等温线来评估。然而，液相中的吸附受到动力学、表面容量、pH值以及竞争吸附等因素的限制，因此在设计实验前应充分考虑这些因素。

在本视频中，我的同事 Elena Korina 和 Sergei Neifert 将介绍二肽在溶液分散二氧化钛上的物理化学吸附研究，涵盖样品制备的关键步骤，以帮助避免研究人员在进行相关实验时可能遇到的潜在风险。取 183 毫克二肽放入无菌聚合物试管中，用双蒸水定容至约 35 毫升，在室温下剧烈搅拌使其溶解。如果二肽在双蒸水中经搅拌后仍不溶解，可将二肽溶液置于超声水浴中，超声数分钟。

在室温下搅拌二肽溶液，并使用pH计监测pH值，同时小心地向其中加入MES或氢氧化钠溶液，将已预先溶解的肽溶液pH值调节至7.4。调节pH值后，将溶液倒入量筒中。冲洗试管，并用双蒸水定容至40毫升，使最终浓度为16毫摩尔（mmol/L）。

通过将16毫摩尔的二肽溶液用双蒸水稀释，配制浓度在0.4至12毫摩尔之间的二肽稀释液。例如，要配制8毫摩尔的二肽溶液，可将7毫升双蒸水加入10毫升16毫摩尔的二肽溶液中。稀释后，逐滴加入MES或氢氧化钠溶液，调节二肽溶液的pH至7.4。

调节pH后，将溶液倒入量筒中。用双蒸水冲洗试管，并将双蒸水加至量筒中直至体积达到20毫升，以配制8毫摩尔浓度的二肽溶液。其他浓度的二肽储备液依此方法相应配制。

最后，我们得到一系列用于吸附研究的二肽稀释液。配制 10 毫摩尔的 MES 缓冲溶液。在搅拌条件下，用三羟甲基氨基甲烷氢氧化钠调节 pH 至 7.4，并用 pH 计监测 pH 值。

该溶液将仅用于制备。在研钵中研磨约200毫克纳米晶二氧化钛至少五分钟。称取40毫克研磨后的二氧化钛纳米颗粒。

使用实验架将烧瓶放入超声波清洗器中。通过玻璃漏斗向烧瓶中加入20毫升MES缓冲液中的研磨二氧化钛，并在超声波清洗器中处理20分钟。将恒温器设定至所需温度。

向标记好的二氧化钛超声处理悬液吸附管中加入一毫升。将标记好的吸附管放入由泡沫塑料制成的简易漂浮装置中，对应相应的稀释液，并置于恒温器中平衡温度至少五分钟。随后，向对应的标记吸附管中加入一毫升二肽稀释液，确保所有混合溶液温度一致。

将获得的一系列吸附样品置于恒温器中保持24小时，以达到吸附平衡。在恒温过程中需偶尔振荡二氧化钛分散液。为避免温度变化引起的再平衡，每次仅从恒温器中取出一个样品进行过滤。

用注射器从每个玻璃小瓶中吸取二肽溶液样品。取下注射器上的针头，装上注射式滤器，将二肽溶液过滤至玻璃小瓶中。对其他浓度的样品重复过滤操作。

现在这些样品已准备好进行分析。配制50毫升三氟乙酸（TFA）的乙腈溶液。在量筒中加入0.34毫升三氟乙酸（TFA），然后在室温下用乙腈定容至50毫升。

配制衍生化溶液。在量筒中加入299微升苯基异硫氰酸酯和347微升三乙胺，再用乙腈定容至50毫升。在进行高效液相色谱分析前，使用埃德曼试剂在色谱小瓶中对样品进行衍生化处理。

将400 µL样品与400 µL衍生化试剂混合。将样品置于60 °C下保持15分钟。加热后，加入225 µL三氟乙酸（TFA）溶液中和样品，并静置数分钟，使样品冷却至室温。

使用高效液相色谱（HPLC）分析测定吸附前后二肽溶液的浓度。根据软件设定的必要条件，开始对样品进行分析。根据实验所得数据，绘制吸附量随吸附后二肽平衡浓度变化的关系曲线，即吸附等温线。

二肽吸附的测量数据采用亨利模型进行处理。平衡结合常数由二肽吸附量对二肽平衡浓度依赖关系的斜率获得。使用范特霍夫方程确定每个温度下的标准吉布斯自由能。

在自由能随温度变化的图中，我们通过二肽的线性图与自由能轴的截距确定了焓变。各温度下的熵变由基本方程确定。二肽的平衡结合常数、标准吉布斯自由能、焓和熵的计算值列于表一中。

通过耗尽数据构建吸附等温线仍然是无需昂贵装置的最常用方法，可为实际上所有可溶性吸附质提供详尽的物理化学数据。结合光谱学或基于计算机的数据，该方法可揭示生物分子与无机纳米颗粒接触时复杂行为的基本结构特征。