成像 Dpp 的释放过程 果蝇 翅盘

DPP 通过结合受体并向细胞内传递信号来影响细胞命运，从而调控转录。如果 DPP 被合成但未被释放，则无法接触受体，因而不能发挥其功能。该技术可实现对 DPP 释放的可视化，使研究人员能够探究哪些遗传和环境因素会改变 DPP 的释放动态。

BMP 信号通路从果蝇到人类都具有保守性，因此我们预期决定 DPP 释放的机制也与人类的发育和再生相关。首先将 30 至 40 只处女雌性 DPP GAL4 果蝇与 10 至 15 只雄性 UAS DPP-GFP 果蝇杂交。通过在新鲜的培养管食物中加入少量酵母糊，以促进产卵。

收集卵时，将杂交后的果蝇翻入小瓶中，让其产卵三到四小时，然后移除果蝇。将收集卵的小瓶置于25°C条件下培养约144小时，直至幼虫发育至三龄幼虫阶段。随后挑选合适的幼虫用于解剖。

首先，选择非转基因（non-TB）的幼虫，其体型应为正常长度，而非短而粗。为筛选表达 DPP-GFP 的幼虫，需在荧光体视显微镜下观察。所有非转基因幼虫均会呈现一定程度的荧光，但 GFP 信号仅局限于翅成虫盘，且在 DPP-GFP 幼虫中荧光强度较弱。

根据文稿说明配制改良的HL3培养基，以维持翅盘组织在成像过程中的活性。用HEPES将pH值调节至7.1，然后经0.22微米滤膜过滤。取两条无色双面胶带，横向贴于载玻片上，两条胶带之间留出约5毫米的间隙，并确保胶带两端与载玻片边缘对齐。

使用平整的边缘将胶带牢固地压在载玻片上。在两片胶带之间加入 25 µL 改良的 HL3 培养基。当翅成虫盘被置于培养基中时，两片胶带可防止其被盖玻片压碎。

解剖幼虫时，将其置于改良的HL3培养基中，用两对镊子轻轻将其撕成两半。丢弃后半部分，用一对镊子夹住前半部分的中部，另一对镊子将口钩向内推，直至幼虫完全翻转。寻找沿幼虫两侧分布的两条颜色较深的气管主支上明显的弯曲处。

翅成虫盘位于下方紧贴处。轻轻取下成虫盘，并将其放入已准备好的载玻片上的HL3培养基中，确保没有气管组织残片仍附着在成虫盘上。摆放翅成虫盘时，应使翅囊的围领侧朝上，成虫盘平放。

用盖玻片覆盖翅组织，并用指甲油封片。待指甲油干燥后，立即进行成像。使用共聚焦激光扫描显微镜，配备40倍油镜和488纳米激光，对安装好的翅盘进行成像。

以每秒2帧的速度采集图像，持续2分钟。为获得最佳效果，将激光功率设置为刚好能够清晰观察到DPP释放细胞的水平，以避免过度漂白。将图像作为时间序列采集，并导出为AVI文件，以获得DPP释放过程的视频。

当实验成功时，DPP-GFP 在翅盘中央呈现为一条条带状结构，细胞核表现为非荧光的圆形区域。DPP-GFP 的释放表现为荧光点状结构，这些荧光点可在细胞体内部及远离细胞体的区域出现和消失。这些明显的点状结构可能位于胞膜突起（cytonemes）中或其突触部位。

将翅成虫盘以围膜侧朝上进行封片，以便从该侧进行成像。若从相反的一侧对翅成虫盘进行成像，DPP-GFP 荧光信号将失焦，分辨率会较差。当 GFP 未与 DPP 融合时，在细胞体外不会观察到任何荧光斑点。

该对照表明，DPP-GFP 的行为与单独的 GFP 不同。此外，当不表达 DPP-GFP 时，不会出现荧光斑点。在本实验过程中，必须将翅盘以远端上皮面朝上方式封片。

如果翅盘方向不正确，DPP-GFP 将会失焦。该方法可用于研究其他发育信号配体（如wingless或hedgehog）的释放。我们可以探究所有可能影响DPP释放的不同环境和遗传因素。

此外，我们可以调整该方法以研究其他细胞类型中BMP的释放。