淋巴结冷冻切片中肿瘤细胞黏附的定量分析

最常见的转移部位是原发淋巴结。可利用体节细胞在体外检测肿瘤细胞与淋巴结组织切片之间的黏附亲和力。该技术的一个优势在于，新鲜的淋巴结组织切片能够提供原始组织的天然复杂性，而使用纯化蛋白则无法重现这种特性。

该方法可能对分子肿瘤学研究具有重要意义，有助于识别干扰肿瘤细胞在转移靶器官（如淋巴结）黏附的基因或疗法。为在处死动物后三十分钟内获取淋巴结，需将成年Wistar大鼠置于室温下洁净的解剖板上，呈仰卧位，并用70%异丙醇喷洒皮毛。使用灭菌器械提起腹部皮肤，做正中皮肤切口以暴露腹腔脏器。

取出肠道，直至胸腹部淋巴结可见。使用钝头剪刀，小心切除淋巴结，避免损伤下方的肠系膜上动脉，并将淋巴结放入含有5 mL无菌PBS的15 mL离心管中。当所有淋巴结采集完毕后，将每个淋巴结分别倒置放入一个冷冻模具底部，并加入适量的OCT包埋剂，刚好覆盖组织即可。

速冻后，使用冷冻切片机在22摄氏度下切取5至8微米厚的切片，并将切片收集到玻璃载玻片上。来自同一淋巴结连续切片的高质量冷冻切片对于最小化切片间差异并促进细胞黏附率的一致性至关重要。对于肿瘤细胞标记，从适当阶段的细胞培养物中收获目标细胞，并将细胞重悬于无血清培养基中，浓度为1 × 10⁶ 个细胞/毫升。

将1 mL细胞转移至新的15 mL锥形管中，加入终浓度为每毫升2微克的DiI(C18)染料，在37°C孵育10分钟，于5分钟时轻轻振荡以避免细胞沉淀。孵育结束后，通过离心收集细胞，并用10 mL新鲜无血清培养基将标记后的细胞洗涤两次，以去除未结合的染料。第二次洗涤后，将细胞重悬于含0.1%牛血清白蛋白的无血清培养基中，调整细胞密度至1 × 10⁶ 个细胞/mL。

将标记的肿瘤细胞加入到获取的淋巴结组织切片后，用PBS轻轻洗涤切片两次，随后在室温下用新鲜PBS重新水化十五分钟。孵育结束后，在37摄氏度下用2.5%牛血清白蛋白封闭非特异性结合位点三十分钟，然后用棉签将载玻片擦干。使用疏水性笔在每个切片周围画出屏障，并向每个圈出的淋巴结区域加入100 µL标记的细胞。

在37摄氏度的湿化培养箱中孵育一至两小时后，用PBS轻轻洗涤四次以去除未贴壁的细胞，并用含3.7%甲醛的PBS在室温下固定剩余的贴壁荧光细胞15分钟。为量化贴壁指数，使用荧光显微镜的10倍物镜，在明场和红色荧光场下分别获取每个区域的独立TIFF图像。随后，系统命名并保存图像，然后在Fiji中打开这些图像。

设定比例尺后，使用多边形工具选择需要量化的感兴趣区域。选择以量化淋巴结面积。数据将以平方毫米表示。

接下来，选择插件，分析，细胞计数器，然后点击待量化的照片。点击初始化并选择计数类型。随后，在照片中的细胞上点击。

淋巴结黏附指数将以每单位淋巴结覆盖面积上的黏附肿瘤细胞数量来表示。要开始下一张照片的分析，请打开下一张照片，并按照演示的方法重复进行定量分析。可以观察到，黏附细胞的形态呈圆形，且这些细胞在目标淋巴结中呈异质性分布。

NDRG4 阴性乳腺癌细胞系的淋巴结黏附指数比相应的 NDRG4 阳性细胞高出两到三倍。该方法可进行调整，用于辅助测定其他转移靶组织（如脑或肺）中的黏附率，以评估接种肿瘤细胞的继发性优先黏附部位。请注意，新鲜和冷冻组织均应视为生物危害物，并应采取适当的生物安全防护措施进行处理。