淋巴结冷冻科肿瘤细胞粘附的定量

转移的最常见部位是原始淋巴结。索马特斯可用于检测肿瘤细胞淋巴结部分在体外粘合的亲和力。这项技术的一个优点是，新鲜的淋巴结部分提供了原始组织的自然复杂性，这是不可能使用纯化蛋白质重新创建。

这种方法对于分子肿瘤学研究可能很有用，这些研究寻求识别干扰肿瘤细胞在转移性靶器官（如淋巴结）粘附的基因或疗法。要在牺牲后三十分钟内收获淋巴结，请将成年 Wistar 大鼠放在室温下干净的解剖板上，用 70%异丙醇喷洒毛皮。使用灭菌器，抬起腹部皮肤，做一个内层皮肤切口，以暴露腹部内脏。

提取肠道，直到胸腔和腹部淋巴结变得可见。使用钝尖剪刀，小心切除淋巴结，而不伤害潜在的上肠动脉，并放置淋巴结到含有5 mL无菌PBS的15 mL管。当所有淋巴结都收获后，将每个低温面向下放置一个淋巴结，并添加足够的最佳切温介质来覆盖组织。

捕捉冷冻后，使用低温恒温器在 22 摄氏度下获取 5 到 8 微米厚的部分，并收集到玻璃显微镜幻灯片上。来自同一淋巴结连续切片的高质量冷冻对于最大限度地减少切片之间的差异和促进一致的细胞粘附率至关重要。对于肿瘤细胞标签，从适当阶段性细胞培养物中收获感兴趣的细胞，并在每 mL 浓度和无血清培养的 6 个细胞下重新悬浮细胞。

将1 mL的细胞转移到一个新的15 mL锥形管中，并在37摄氏度下用每毫升DII（C18）2微克标记细胞10分钟，在5分钟内轻轻搅拌以避免细胞沉积。在孵育结束时，通过离心对细胞进行颗粒，用10 mL的新鲜无血清介质洗涤两次，以去除多余的染料。第二次洗涤后，将无血清介质每mL的1 x 10至6个细胞重新悬浮，并辅以0.1%的牛血清白蛋白浓度。

将标记的肿瘤细胞转移到收获的淋巴结组织部分，在PBS中轻轻清洗两次，随后在室温下在新鲜PBS中再水化15分钟。在孵育结束时，在37摄氏度下，用2.5%牛血清白蛋白阻断任何非特异性结合，在37摄氏度下30分钟，然后使用棉签擦干滑梯。使用疏水笔在每个部分周围绘制一个屏障，并将 100 微升标记的细胞添加到每个包围的淋巴结上。

在加湿室37摄氏度下一至两小时后，在PBS中去除任何不粘附细胞，并在室温下将剩余的粘附荧光细胞与PBS中的3.7%甲醛修复15分钟。为了量化粘合剂指数，使用荧光显微镜上的 10 倍目标获取明亮和红色荧光场中每个部分的单个 TIFF 图像。然后，在斐济打开图像之前，系统地命名并保存图像。

设置比例后，使用多边形工具选择要量化的感兴趣区域。选择以量化淋巴结区域。数据以平方毫米表示。

接下来，选择插件、分析、单元格计数器，然后单击要量化的照片。单击初始化并选择计数器类型。然后，单击照片中的单元格。

淋巴结粘附指数将表示为每个淋巴结覆盖区域的粘附肿瘤细胞的数量。要初始化下一张照片，请打开下一张照片，然后重复演示的量化。正如观察的，粘附细胞的形态是圆润的，细胞在异质上分散在感兴趣的淋巴结中。

与相应的NDRG4阳性细胞相比，NDRG4阴性乳腺癌细胞系淋巴结粘附指数高2至3倍。此过程可调整为辅助其他转移目标组织（如大脑或肺）的粘附率，以评估被感染肿瘤细胞的辅助性优先位点。请记住，新鲜和冷冻组织应被视为生物危害，并且应该使用适当的生物安全预防措施进行处理。