Name: 使用抗生素耐药性平台进行抗生素脱除 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: 了解利用抗生素耐药性平台对已知抗生素进行脱除的方法，使用等基因耐药大肠杆菌实现快速、经济高效的鉴定。该方法无需专用设备，可定制耐药基因模板以提高特异性。

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赖特实验室关于ARP/MARP的研究得到了安大略研究基金和加拿大卫生研究院基金（FRN-148463）的支持。我们感谢周 Sommer Chou 在ARP文库的扩充与组织工作中提供的帮助。

1. 准备 E. coli 从斜面琼脂培养物制备甘油菌种库
<ol>
	<li>将 ARP/MARP E. coli 菌株从溶菌肉汤（LB）琼脂斜面接种到含有 LB 琼脂及相应选择标记物的培养皿中（表 1）。</li>
	<li>通过将单个菌落接种至含有相应选择标记物的 3 mL LB 培养基中，为每种 E. coli 菌株制备培养物。在 37 °C 下有氧培养过夜（250 rpm）。</li>
	<li>在 1.8 mL 冻存管中加入 800 μL 培养物和 200 μL 无菌的 80% 甘油。通过轻柔倒置混匀 3−4 次，于 -80 °C 保存。</li>
</ol>
2. ARP/MARP 冻存菌种库板的制备
<ol>
	<li>从第1节制备的甘油菌种中，将 ARP/MARP 菌株划线接种至含有 LB 琼脂及相应选择标记物的新培养皿中，在 37 °C 下过夜培养。</li>
	<li>采用无菌操作技术，从无菌储液中吸取 500 μL 阳离子调节的 Mueller Hinton 肉汤（MHB），加入无菌的 96 孔深孔板的每个孔中。</li>
	<li>使用步骤 2.1 中准备的平板，用接种棒根据 ARP/MARP 图谱（补充图 1 和 补充图 2）对 96 孔深孔板进行接种。确保向每孔中加入相应选择标记物。在深孔板表面覆盖透气密封膜，并在 37 °C 下过夜培养&#160;（250 rpm）。</li>
	<li>参照 ARP/MARP 图谱确认无污染孔；若发现污染，则需重复操作。使用多通道移液器，将深孔板每孔中的 100 μL 菌液转移至无菌的 96 孔圆底板中。重复此步骤以制备多个冷冻保存菌库板。 
	注意：建议每次至少制备 5 块菌库板，以避免因冷冻菌库板污染而重复步骤 2.1−2.4。</li>
	<li>通过向每孔加入 100 μL 无菌的 50% 甘油，并轻轻吹打混匀，完成 ARP/MARP 冷冻菌库板的制备。</li>
	<li>用无菌铝箔封膜覆盖板孔，并确保每个孔均被单独密封。</li>
	<li>对菌库板编号，并在特定时间内仅使用一块冷冻菌库板用于接种新的模板。其余板应作为备份保存，以防冷冻菌库板发生污染。</li>
	<li>将板盖置于铝箔封膜之上，于 -80 °C 保存。</li>
</ol>
3. 种子培养物制备与去重复化平板准备
<ol>
	<li>使用接种棒，将待去重菌株接种于含有一个无菌玻璃珠（用于打散菌丝）的试管中，试管内装有3 mL Streptomyces 抗生素培养基（SAM）（或适用于测试菌株的其他合适培养基）。对于Streptomyces，轻轻刮取菌落表面的孢子。</li>
	<li>使用同一根木制接种棒，在含有 Bennett 培养基的培养皿上划线进行无菌对照。</li>
	<li>将种子培养物在30 °C、通气条件下培养6天（250 rpm），同时将无菌对照平板在30 °C下培养6天。 
	注意： SAM 和 Bennett 培养基的配方请参见表2。上述操作适用于大多数放线菌。根据需要调整其他细菌和真菌的生长培养基。</li>
	<li>通过移液管吸取23 mL温热的Bennett琼脂，用血清移液管将其转移，并将20 mL均匀倾注于矩形培养皿（材料表）表面，保留移液管中剩余培养基以防止气泡产生。 
	注意： 确保倾注平板的台面水平，并在琼脂冷却过度前完成此步骤；平坦的表面对于后续阶段的文库点样至关重要。</li>
	<li>轻轻旋转培养皿，使培养基覆盖整个表面，直至琼脂完全凝固前不再扰动。</li>
	<li>使用矩形培养皿盖作为模板描边，裁剪硝酸纤维素膜片（材料表），使其恰好贴合去重平板的表面。将裁好的膜片放入无菌袋中并进行高压灭菌。 
	注意： 该膜允许微生物在其表面产孢，同时次级代谢产物可分泌至下方培养基中。培养完成后移除膜片，可获得洁净表面用于去重分析。硝酸纤维素膜与Bennett琼脂表面贴合越紧密，去重结果越清晰。</li>
	<li>检查无菌对照平板，确认培养6天后无污染。若无污染，打开矩形培养皿盖，用移液器将200 μL种子培养液加至Bennett琼脂表面。</li>
	<li>使用无菌棉签将菌液均匀涂布至整个培养皿表面。</li>
	<li>将步骤3.6中准备好的硝酸纤维素膜覆盖于培养皿表面的菌液上。先将膜的底边与培养皿底边对齐，再缓慢从底边向顶边铺展膜片。</li>
	<li>使用无菌棉签轻轻压平膜与琼脂界面间可能形成的气泡，确保膜与琼脂表面完全贴合。</li>
	<li>盖上矩形培养皿盖，倒置于密封塑料袋中，在30 °C下培养6天。</li>
</ol>
4. 去重复化平板MHB覆盖及ARP/MARP文库平板制备
<ol>
	<li>6天后，将去重板从30 °C培养箱中取出。使用无菌镊子（经高压灭菌或充分喷洒70%乙醇），小心地从本氏琼脂表面移除硝酸纤维素膜。 
	注意：此步骤可去除生长在膜表面的疏水性孢子和菌丝，从而为去重提供一个洁净的表面，便于进行步骤4.2。</li>
	<li>参照步骤3.4所述，确保工作台面水平，使用血清学移液管吸取23 mL温热的阳离子调节MHB琼脂。将20 mL均匀地铺加到去重板表面形成覆盖层，剩余培养基保留在移液管中，以防止气泡产生。</li>
	<li>轻轻旋转培养板，使培养基覆盖所有区域，并在琼脂完全凝固前不再扰动。待冷却凝固后，将去重板放回密封塑料袋中，倒置于4 °C过夜。 
	注意：此步骤允许发酵后的本氏培养基中的次级代谢产物扩散至MHB琼脂覆盖层中。若硝酸纤维素膜制备不当，则会在培养板边缘出现具有疏水性质的孢子生长，这些孢子会排斥MHB琼脂。切勿在这些孢子上方倾倒覆盖层，以免导致覆盖层污染。</li>
	<li>在倾倒覆盖层的同一天，通过移液枪向96孔板的每个孔中加入100 μL阳离子调节MHB，接种一份新鲜的ARP/MARP模板。 
	注意：为降低去重过程中污染传播的风险，每块ARP/MARP文库板仅用于去重2−3块去重板。因此，应根据待去重菌株的数量，接种足够数量的96孔ARP/MARP板。</li>
	<li>从-80 °C冰箱中取出冷冻保存的ARP/MARP文库板。在铝封膜底面开始形成冷凝水之前移除封膜，从而降低文库板中邻近孔被污染的风险。</li>
	<li>使用无菌的96孔点样工具（或其他形式的接种设备），小心地从冷冻保存的ARP/MARP文库板中点样，并接种至含有新鲜MHB的96孔板中。&#160;为最大限度减少去重过程中的污染，应准备足够数量的ARP或MARP文库板，确保每块文库板仅用于去重2−3块去重板。每次接种不同板之间需对点样工具进行灭菌处理。</li>
	<li>完成操作后，立即为冷冻模板更换新的无菌铝封膜，并放回-80 °C冰箱保存。将已接种的96孔板放入密封塑料袋中，在37 °C条件下振荡培养（250 rpm）18小时。 
	注意：确认无污染后，可从此步骤制备新的冷冻保存文库板。在-80 °C保存前，按照步骤2.5所述向孔板中添加甘油。</li>
</ol>
5. 使用 ARP/MARP 进行去重
<ol>
	<li>从培养箱中取出 ARP/MARP 模板，并确保无任何污染物存在。务必使用 freshly prepared 的模板进行去重复，切勿直接使用冻存的菌种库。</li>
	<li>将去重复平板从 4 °C 取出，使其平衡至室温。若存在冷凝水，请打开皿盖，在无菌环境中晾干。</li>
	<li>使用无菌的点种工具（或其他接种设备），将 ARP/MARP 文库平板中的菌株点种到去重复平板的 MHB 琼脂覆盖层表面。注意避免刺破琼脂层。&#160;每完成一个去重复平板的接种后，需对点种工具进行灭菌处理。</li>
	<li>将模板点种至去重复平板表面后，静置使接种物干燥 3−5 分钟。将接种后的去重复平板倒置放入密封塑料袋中，于 37 °C 培养过夜。</li>
	<li>次日分析去重复结果，通过比较去重复平板上的菌落生长情况与对应 ARP/MARP 图谱的孔位（表 3 和 表 4）进行判断。</li>
</ol>

<ol><li>Lo Grasso, L., Chillura Martino, D., Alduina, R. Production of Antibacterial Compounds from Actinomycetes. actinobacteria. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLo+Grasso%2C+L+%22Basics+and+Biotechnological+Applications%22">Basics and Biotechnological Applications</a>. Dhanasekaran, D., Jiang, Y. , IntechOpen. (2016).</li>
<li>Thaker, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+producers+of+antibacterial+compounds+by+screening+for+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Identifying producers of antibacterial compounds by screening for antibiotic resistance.</a> Nature Biotechnology. 31, 922-927 (2013).</li>
<li>Gajdács, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Concept+of+an+Ideal+Antibiotic%3A+Implications+for+Drug+Design%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">The Concept of an Ideal Antibiotic: Implications for Drug Design.</a> Molecules. 24, 892(2019).</li>
<li>Boucher, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bad+bugs%2C+no+drugs%3A+no+ESKAPE%21+An+update+from+the+Infectious+Diseases+Society+of+America%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Bad bugs, no drugs: no ESKAPE! An update from the Infectious Diseases Society of America.</a> Clinical Infectious Diseases. 48, 1-12 (2009).</li>
<li>Gajdács, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Continuing+Threat+of+Methicillin-Resistant+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Antibiotics%22%5BJournal%5D)">The Continuing Threat of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus.</a> Antibiotics. 8, 52(2019).</li>
<li>Gaudêncio, S. P., Pereira, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dereplication%3A+Racing+to+speed+up+the+natural+products+discovery+process%5BTitle%5D)+AND+%22Natural+Product+Reports%22%5BJournal%5D)">Dereplication: Racing to speed up the natural products discovery process.</a> Natural Product Reports. 32, 779-810 (2015).</li>
<li>Ito, T., Masubuchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dereplication+of+microbial+extracts+and+related+analytical+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Antibiotics+%28Tokyo%29%22%5BJournal%5D)">Dereplication of microbial extracts and related analytical technologies.</a> The Journal of Antibiotics (Tokyo). 67, 353-360 (2014).</li>
<li>Van Middlesworth, F., Cannell, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dereplication+and+Partial+Identification+of+Natural+Products%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Dereplication and Partial Identification of Natural Products.</a> Methods in Biotechnology. , 279-327 (2008).</li>
<li>Tawfike, A. F., Viegelmann, C., Edrada-Ebel, R. Metabolomics and Dereplication Strategies in Natural Products. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTawfike%2C+AF+%22Metabolomics+Tools+for+Natural+Product+Discovery%3A+Methods+and+Protocols%22">Metabolomics Tools for Natural Product Discovery: Methods and Protocols</a>. Roessner, U., Dias, D. A. , Humana Press. Totowa, NJ. 227-244 (2013).</li>
<li>Cox, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Common+Platform+for+Antibiotic+Dereplication+and+Adjuvant+Discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">A Common Platform for Antibiotic Dereplication and Adjuvant Discovery.</a> Cell Chemical Biology. 24, 98-109 (2017).</li>
<li>Hubert, J., Nuzillard, J. M., Renault, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dereplication+strategies+in+natural+product+research%3A+How+many+tools+and+methodologies+behind+the+same+concept%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry+Reviews%22%5BJournal%5D)">Dereplication strategies in natural product research: How many tools and methodologies behind the same concept.</a> Phytochemistry Reviews. 16, 55-95 (2017).</li>
<li>Beutler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dereplication+of+phorbol+bioactives%3A+Lyngbya+majuscula+and+Croton+cuneatus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Natural+Products%22%5BJournal%5D)">Dereplication of phorbol bioactives: Lyngbya majuscula and Croton cuneatus.</a> Journal of Natural Products. 53, 867-874 (1990).</li>
<li>Mohimani, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dereplication+of+microbial+metabolites+through+database+search+of+mass+spectra%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Dereplication of microbial metabolites through database search of mass spectra.</a> Nature Communications. 9, 1-12 (2018).</li>
<li>Baltz, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marcel+Faber+Roundtable%3A+Is+our+antibiotic+pipeline+unproductive+because+of+starvation%2C+constipation+or+lack+of+inspiration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Industrial+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Marcel Faber Roundtable: Is our antibiotic pipeline unproductive because of starvation, constipation or lack of inspiration.</a> Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 33, 507-513 (2006).</li>
<li>Baltz, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic+discovery+from+actinomycetes%3A+Will+a+renaissance+follow+the+decline+and+fall%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Antibiotic discovery from actinomycetes: Will a renaissance follow the decline and fall.</a> Archives of Microbiology. 55, 186-196 (2005).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

上述方案既可用于发现新的抗菌化合物，也可用于发现能与现有抗生素联合使用以恢复其活性的增效剂。该平台利用耐药机制与其相应抗生素之间高度的底物特异性，对粗天然产物提取物中的化合物进行去重。尽管制备去重平板所需时间较长（约2周），但去重过程本身仅需一次过夜培养即可完成，相较于从粗提物中分离和表征化合物所需的时间，这一过程非常快速。此外，该平台无需昂贵或高度专业化的设备，因而具有良好的可及性和成本效益。
该平台的另一个主要优势在于其灵活性。ARP 可扩展以包含涵盖更多抗生素类别的耐药基因。通过监测文献中新型耐药酶的出现，并利用基本的分子克隆技术将这些基因添加到 E. coli 文库中，即可实现这一目标。此外，去重模板可根据用户在进行去重时所需的广谱或窄谱底物特异性程度进行定制。可使用 E. coli 文库中的任意基因组合构建新型文库平板，从而检测具有不同特征的化合物。例如，可开发表达 β-内酰胺酶的 E. coli 模板，以实现对 β-内酰胺类抗生素及其不同亚类的高特异性去重。
尽...

自1928年发现青霉素以来，源自环境微生物的天然产物已被证实是抗菌化合物的重要来源1。大约80%的天然产物类抗生素来源于链霉菌属（Streptomyces）及其他放线菌，其余20%则由真菌物种产生1。临床上使用的一些最常见抗生素骨架，如β-内酰胺类、四环素类、利福霉素类和氨基糖苷类，最初均从微生物中分离获得2。然而，由于多重耐药（MDR）细菌的出现，目前可用的抗生素在治疗中的有效性已逐渐降低3,4。其中包括“ESKAPE”病原体（即耐万古霉素肠球菌以及耐β-内酰胺类的金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus、肺炎克雷伯菌Klebsiella pneumoniae、铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa、鲍曼不动杆菌Acinetobacter baumannii和肠杆菌属Enterobacter sp.），这些细菌被世界卫生组织等多个主要公共卫生机构认定为具有最高风险的病原体3,4,5。这些多重耐药病原体的出现及其全球传播，使得开发新型抗生素的需求持续存在3,4,5。遗憾的是，过去二十年的经验表明，从微生物来源中发现新型抗生素正变得愈发困难6。当前药物发现的常用方法包括对生物活性化合物进行高通量筛选，例如天然产物提取物文库，可在同一时间内测试数千种提取物2。然而，一旦检测到抗菌活性，下一步便是分析粗提物的成分，以鉴定其中的活性组分，并排除含有已知或重复化合物的样本7,8。这一过程被称为去重复化（dereplication），对于防止或显著减少在已知抗生素的重复发现上耗费时间至关重要7,9。尽管去重复化是天然产物药物发现中必不可少的步骤，但该过程以耗时耗力且资源密集著称10。
自从 Beutler 等人首次提出“去重”（dereplication）这一术语以来，人们已投入大量努力，致力于开发用于快速鉴定已知抗生素的创新策略11,12。目前，用于去重的最常用工具包括分析型色谱系统，如高效液相色谱、质谱以及基于核磁共振的检测方法11,13。然而，这些方法均需使用昂贵的分析设备，并且需要复杂的数据解读。
为了建立一种无需特殊设备即可快速完成的去重方法，我们开发了抗生素抗性平台（antibiotic resistance platform, ARP）10。ARP可用于发现抗生素佐剂、针对已知抗性机制对新型抗生素化合物进行表征，以及对放线菌和其他微生物提取物中的已知抗生素进行去重。本文重点介绍其在抗生素去重中的应用。ARP利用一组同源背景的Escherichia coli菌株文库，这些菌株分别表达对最常被重复发现的抗生素有效的单个抗性基因14,15。当该E. coli文库与产次级代谢产物的生物共同培养时，可通过表达相应抗性基因的E. coli菌株的生长情况推断出化合物的种类10。ARP首次报道时，其文库包含&#62;40个基因，赋予对16类抗生素的抗性。最初的去重模板设计为每类抗生素包含部分抗性基因，以便在去重过程中提供抗生素亚类的信息。目前，ARP已扩展至包含&#62;90个基因，赋予对18类抗生素的抗性。基于我们丰富的抗性基因资源，已开发出第二个去重模板，称为最小抗生素抗性平台（minimal antibiotic resistance platform, MARP）。该模板旨在消除基因冗余，仅提供去重代谢物所归属的广谱抗生素类别信息。此外，与仅使用高通透性菌株的原始ARP不同，MARP模板同时包含野生型和高通透性/外排缺陷型的E. coli BW25113（E. coli BW25113 ΔbamBΔtolC）。这一独特设计在去重过程中产生额外的表型，可指示化合物穿透革兰氏阴性菌外膜的能力。本文描述了使用ARP和/或MARP进行去重时应遵循的稳健实验方案，强调最关键的步骤，并讨论各种可能的结果。

<table><tbody><tr><td>琼脂</td><td>Bio Shop</td><td>AGR003.5</td><td></td></tr><tr><td>用于低温储存的 AlumaSeal CS 薄膜</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z722642-50EA</td><td></td></tr><tr><td>氨苄青霉素钠盐</td><td>Bio Shop</td><td>AMP201.100</td><td></td></tr><tr><td>BBL 水解酪蛋白II肉汤（阳离子调节型）</td><td>Becton Dickinson</td><td>212322</td><td></td></tr><tr><td>BBL 植物蛋白胨（Soytone）</td><td>Becton Dickinson</td><td>211906</td><td></td></tr><tr><td>碳酸钙</td><td>Bio Shop</td><td>CAR303.500</td><td></td></tr><tr><td>酪蛋白氨基酸</td><td>Bio Basic</td><td>3060</td><td></td></tr><tr><td>棉签</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-101</td><td></td></tr><tr><td>CryoPure 1.8 mL 混合色冻存管</td><td>Sarstedt</td><td>72.379.992</td><td></td></tr><tr><td>D-葡萄糖</td><td>Bio Shop</td><td>GLU501.5</td><td></td></tr><tr><td>一次性培养管，16 mm × 100 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-961-29</td><td></td></tr><tr><td>无水乙醇</td><td>Commercial Alcohols</td><td>P016EAAN</td><td></td></tr><tr><td>实心玻璃珠</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-312C</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Bio Shop</td><td>GLY001.4</td><td></td></tr><tr><td>盐酸</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144-212</td><td></td></tr><tr><td>即时封口灭菌袋</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-812-54</td><td></td></tr><tr><td>七水合硫酸亚铁</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7002-250G</td><td></td></tr><tr><td>硫酸卡那霉素</td><td>Bio Shop</td><td>KAN201.50</td><td></td></tr><tr><td>LB 肉汤（Lennox 型）</td><td>Bio Shop</td><td>LBL405.500</td><td></td></tr><tr><td>七水合硫酸镁</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63-500</td><td></td></tr><tr><td>MF-Millipore 膜滤器，0.45 &amp;micro;m 孔径</td><td>Millipore-Sigma</td><td>HAWP00010</td><td>10 英尺卷装，亲水性，白色，无衬</td></tr><tr><td>96 孔圆底微量培养板</td><td>Sarstedt</td><td>82.1582.001</td><td></td></tr><tr><td>New Brunswick Innova&amp;nbsp;44</td><td>Eppendorf</td><td>M1282-0000</td><td></td></tr><tr><td>Nunc OmniTray 单孔培养皿</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>264728</td><td>带盖，无菌，未处理</td></tr><tr><td>带卡扣的 92 mm × 16 mm 培养皿</td><td>Sarstedt</td><td>82.1473.001</td><td></td></tr><tr><td>点样工具</td><td>ETH Zurich</td><td>-</td><td>定制订单</td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>马铃薯淀粉</td><td>Bulk Barn</td><td>279</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>硝酸钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>S343-500</td><td></td></tr><tr><td>木制涂布棒</td><td>Dukal Corporation</td><td>9000</td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1422-2</td><td></td></tr></tbody></table>

利用抗生素耐药性平台进行抗生素去重

Antibiotic Dereplication Using the Antibiotic Resistance Platform

从天然产物提取物中寻找新抗生素的主要挑战之一是常见化合物的重复发现。为应对这一挑战，需对目标样品进行去重复化（dereplication），即鉴定已知化合物的过程。传统的去重复化方法，如色谱分离联合质谱分析，耗时且资源消耗大。为优化去重复化流程，我们开发了抗生素抗性平台（antibiotic resistance platform, ARP）。ARP 是一个包含约 100 个抗生素抗性基因的文库，这些基因已被分别克隆至 大肠杆菌 该菌株保藏具有多种应用，包括作为一种经济高效且简便的抗生素去重方法。该方法涉及在含有固体培养基的矩形培养皿表面发酵产抗生素微生物，从而使其分泌的次级代谢产物能够通过培养基扩散。经过6天的发酵后，去除微生物生物量，并在培养皿上添加一层薄琼脂覆盖层，以形成平整表面并支持测试菌的生长 E. coli 指示菌株。随后将我们收集的ARP菌株点种到含抗生素的培养皿表面。接着将平板过夜培养，以允许 E. coli 在覆盖层表面生长的菌落中，只有含有对特定抗生素（或类别）具有抗性的菌株才能生长，从而实现对所产生化合物的快速鉴定。该方法已成功用于已知抗生素产生菌的鉴定，并可作为鉴定新型化合物产生菌的有效手段。

当使用ARP和/或MARP对一组感兴趣的产抗生素菌株进行去重时，获得了以下结果。
ARP/MARP 去重复化工作流程的示意图见图1，文库板布局图见补充图1和补充图2。图2展示了一个阳性去重复化结果，其中环境提取物WAC 8921被鉴定为氯霉素产生菌。图3显示了ARP完全无生长的情况，表明样品中可能存在一种未被ARP/MARP文库板覆盖的未知抗生素或较为罕见的抗生素。图4展示了一种仅在MARPs中出现的独特生长模式，这是由于同时使用了野生型E. coli BW25113以及一种高通透性且外排缺陷的突变株E. coli BW25113 ΔbamBΔtolC。该结果提示存在一种具有抗菌活性的化合物，但无法穿透完整的...

我们描述了一种利用一系列同基因型抗生素抗性大肠杆菌（Escherichia coli）进行抗生素去重的平台。通过表达相应抗性基因的大肠杆菌（E. coli）的生长情况，可推断出由细菌或真菌产生的抗生素的种类。该平台具有经济高效且节省时间的优点。

从天然产物提取物中寻找新抗生素的主要挑战之一是常见化合物的重复发现。为解决这一问题……

本方案的重要意义在于，无需使用专用设备，即可经济高效且及时地对已知抗生素进行去重。该技术的主要优势在于模板的可定制性。这意味着研究人员可根据自身对底物特异性广度或窄度的需求，灵活选择希望在文库模板中包含的耐药基因。例如，可以制备表达β-内酰胺的E.coli模板，以实现对β-内酰胺类化合物及其各个亚类的高度特异性去重。采用无菌技术，将500微升阳离子调节的MHB从无菌储液器中移液至无菌的96深孔板的每个孔中。使用已准备好的ARP或MAR-P菌株平板，用接种棒根据ARP或MAR-P图谱对96深孔板进行接种。在深孔板表面放置透气密封膜，于37摄氏度、250 RPM条件下过夜培养。确保无污染孔。使用多通道移液器，将深孔板各孔中的100微升液体转移至无菌的96孔圆底板中。向每个孔中加入 100 µL 无菌的 50% 甘油，通过轻轻吹打混匀。至少准备五块文库板。用无菌铝箔封膜覆盖各孔板，并确保每个孔均被单独密封。将培养皿盖置于铝封膜上方，于负80摄氏度保存。使用木质涂布棒轻轻刮取链霉菌菌落表面的孢子，并将其转移至含有一个无菌玻璃珠和3毫升链霉菌抗生素培养基的试管中。用管盖轻轻盖住试管，但不要拧紧，以允许通气。使用同一根木质涂布棒，在含有 Bennett 琼脂的培养皿上划线接种无菌对照。将含有种子培养物的试管在 30 °C、250 RPM 条件下振荡培养 6 天，同时将无菌对照平板在 30 °C 培养 6 天。随后，在水平台面上制备去重叠平板。用血清移液管吸取23毫升温热的Bennett琼脂，将20毫升均匀地铺展在矩形培养皿表面，移液管中剩余的培养基留作防止气泡形成。用皿盖盖好培养皿。轻轻旋转培养皿，直至培养基覆盖整个皿面，并在琼脂完全凝固前勿扰动培养皿。接下来，使用矩形培养皿盖作为描图模板制备硝酸纤维素膜片，使其能够贴合去重复化平板的表面。将膜片剪裁好后放入无菌袋中进行高压灭菌。现在检查无菌对照平板，确保在培养六天后无任何污染物存在。若无污染，打开矩形培养皿的皿盖，用移液器将200微升种子培养物滴加到矩形培养皿中 Bennett 琼脂表面。使用无菌棉签将培养物均匀涂布至整个培养皿表面。将制备好的硝酸纤维素膜覆盖于培养皿表面的培养物上时，需将膜的底边与培养皿的底边对齐，然后从底边向顶边缓慢铺放膜片。使用无菌棉签轻轻压平膜与琼脂界面之间可能形成的任何气泡，确保膜与琼脂表面完全贴合。该膜可允许微生物在其表面产孢，同时次级代谢产物可分泌至下方的培养基中。盖上矩形培养皿的皿盖，并将其倒置放入密封的塑料袋中。在30摄氏度下培养六天。六天后，从培养箱中取出去重平板。使用无菌镊子，小心地将硝酸纤维素膜从本内特琼脂表面移除。确保平板边缘仅有少量孢子生长，以降低污染后续覆盖层的风险。确保工作台面水平，使用刻度移液管吸取23毫升温热的阳离子调节MHB琼脂。将20毫升琼脂均匀铺加在去重叠平板表面形成覆盖层，剩余琼脂保留在移液管中，以防止气泡产生。将平板盖上盖子，轻轻旋转平板，使培养基均匀覆盖整个表面，并避免扰动直至琼脂完全凝固。待冷却凝固后，将去重平板放回密封的塑料袋中，倒置存放于4摄氏度环境中过夜，以促进次级代谢产物向MHB琼脂覆盖层中扩散。同一天，首先用移液器将100微升阳离子调节的MHB加入96孔板的每个孔中，以接种新鲜的ARP或MARP模板。从-80摄氏度冰箱中取出冷冻保存的ARP或MARP文库板，尚未在底部形成冷凝水之前，移除铝制密封膜。使用无菌的96孔板打孔工具，小心地从冷冻保存的ARP或MARP文库板中打孔，并接种至含有新鲜MHB的96孔板中。为在去重复过程中尽量减少污染，应准备足够数量的ARP或MARP文库板，使每块文库板仅用于去重复两到三个去重复板。操作完成后，为冷冻模板更换新的无菌铝封膜，并将其放回-80摄氏度冰箱中保存。将接种后的96孔板放入松散密封的塑料袋中，在37摄氏度、250 RPM振荡条件下培养18小时。从培养箱中取出ARP或MARP模板，通过将培养板与ARP或MARP模板图谱进行比对，确认无污染物存在。从4摄氏度取出去重板，使其平衡至室温。如果有冷凝水，请打开盖子，并在无菌环境中晾干。使用无菌的接种针工具，从ARP或MARP文库平板上挑取菌落，点种到去重平板的MHB琼脂覆盖层表面。注意不要刺破琼脂。让模板接种物干燥三到五分钟。将接种后的去重板倒置放入密封塑料袋中，在37摄氏度下过夜培养。次日，通过比较去重板上的生长情况与对应于ARP或MARP图谱的孔位来分析去重结果。在此ARP或MARP去重复化工作流程中，获得了阳性去重复化结果。其中，为菌株WAC 8921制备的提取物被鉴定为产生氯霉素。ARP生长缺失表明存在一种未在ARP或MARP文库板中涵盖的未知抗生素或较少见的抗生素。由于MARPA同时利用了野生型大肠杆菌BW25113和一种高通透性且外排功能缺陷的突变型大肠杆菌BW25113 bamB tolC，因而形成了该方法特有的生长模式。该结果提示存在一种具有抗菌活性的化合物，但其无法穿透完整的外膜。这种大肠杆菌的生长模式还表明，穿刺工具灭菌不彻底，导致未知的大肠杆菌菌株在覆盖层之间发生转移。此处展示了一个ARP或MARP冷冻保存菌种库平板被污染的示例，矩形培养皿表面生长出三个明显不同的大肠杆菌菌落。该结果表明，在去重过程中琼脂覆盖层被刺穿。在去重过程中也可能发生与MHB覆盖层相关的污染，在覆盖层表面呈现不规则的生长模式。遵循本实验方案时，最重要的是采用正确的灭菌和无菌操作技术，以确保不会因污染而在任何步骤中受阻。这包括准备硝酸纤维素膜，使其尽可能紧密地贴合在Bennett琼脂平板的表面，以减少倾注MHB覆盖层时孢子的扩散。此外，在接种文库平板和去重复过程中，使用经过适当灭菌的点样设备也极为重要，以获得最清晰的结果。除了用于已知抗生素的去重鉴定外，该方法还可用于发现能够与现有抗生素联合使用以恢复其活性的增效剂。尽管抗生素去重并非新技术，但该过程以耗时耗力而著称。ARP 和 MARP 平台揭示了抗生素去重无需大规模操作，仅需最少的设备即可在两周内完成。

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科研

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Immunology and Infection

免疫学与感染

使用抗生素耐药性平台进行抗生素脱除

设计一种简便的单日工作流程方案用于细菌病原体诊断，可实现对血流感染的快速识别。该方案包含八种临床相关细菌靶标及其抗生素耐药谱，可使临床医生在同一天内获得初步诊断信息，从而有助于制定更为恰当的治疗方案。...

从血培养中检测细菌病原体及进行抗菌药物耐药性测试的一日工作流程方案

来源：Ghadigaonkar, D. 和 Rath, A. 水源性抗生素耐药细菌的分离与鉴定及其抗生素抗性基因的分子表征。J. Vis. Exp.

从水样中分离耐药细菌用于分子分析

来源：Zhang, M. 等，通过受激拉曼散射成像检测单个细菌中氘掺入实现快速抗菌药物敏感性测试。J. Vis. Exp.

使用受激拉曼散射显微镜检测细菌对抗生素的敏感性

来源：Escudero, J. A., 等. 多拷贝质粒在抗生素耐药性进化中的作用检测。J. Vis. Exp. (2018)本视频展示了通过逐步增加头孢唑林暴露浓度，比较三种含有不同拷贝数氨苄青霉素抗性基因的大肠杆菌（E.

评估基因拷贝数在细菌抗生素耐药性进化中的作用

本文介绍了一种用于检验多拷贝质粒在抗生素耐药性进化中作用的实验方法。...

检测多拷贝质粒在抗生素耐药性进化中的作用

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利用荧光抗生素探针可视化细菌耐药性

我们的实验方法提供了一种策略，用于追踪细菌群体中质粒丰度和抗生素抗性随时间的变化。...

实验进化方法中质粒介导的抗生素抗性定量分析

本文介绍了一种从水体中分离和鉴定耐药细菌的详细方案，以及对其耐药基因（ARGs）进行分子表征的方法。通过基于培养和非培养依赖性（宏基因组分析）技术的结合，可全面了解印度孟买淡水环境中细菌多样性的总体情况以及存在的各类耐药基因的总库。...

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表征多重耐药外排系统 鲍曼不动杆菌 利用外排系统&#45;缺陷型细菌菌株与单拷贝&#45;单拷贝基因表达系统

本方案已针对18个耐药相关区域的靶向深度测序进行了优化 结核分枝杆菌...

使用长读长测序技术进行扩增子测序

了解利用抗生素耐药性平台对已知抗生素进行脱除的方法，使用等基因耐药大肠杆菌实现快速、经济高效的鉴定。该方法无需专用设备，可定制耐药基因模板以提高特异性。

利用抗生素耐药性平台进行抗生素去重

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