利用抗生素耐药性平台进行抗生素去重

本方案的重要意义在于，无需使用专用设备，即可经济高效且及时地对已知抗生素进行去重。该技术的主要优势在于模板的可定制性。这意味着研究人员可根据自身对底物特异性广度或窄度的需求，灵活选择希望在文库模板中包含的耐药基因。

例如，可以制备表达β-内酰胺的E.coli模板，以实现对β-内酰胺类化合物及其各个亚类的高度特异性去重。采用无菌技术，将500微升阳离子调节的MHB从无菌储液器中移液至无菌的96深孔板的每个孔中。使用已准备好的ARP或MAR-P菌株平板，用接种棒根据ARP或MAR-P图谱对96深孔板进行接种。

在深孔板表面放置透气密封膜，于37摄氏度、250 RPM条件下过夜培养。确保无污染孔。使用多通道移液器，将深孔板各孔中的100微升液体转移至无菌的96孔圆底板中。

向每个孔中加入 100 µL 无菌的 50% 甘油，通过轻轻吹打混匀。至少准备五块文库板。用无菌铝箔封膜覆盖各孔板，并确保每个孔均被单独密封。

将培养皿盖置于铝封膜上方，于负80摄氏度保存。使用木质涂布棒轻轻刮取链霉菌菌落表面的孢子，并将其转移至含有一个无菌玻璃珠和3毫升链霉菌抗生素培养基的试管中。用管盖轻轻盖住试管，但不要拧紧，以允许通气。

使用同一根木质涂布棒，在含有 Bennett 琼脂的培养皿上划线接种无菌对照。将含有种子培养物的试管在 30 °C、250 RPM 条件下振荡培养 6 天，同时将无菌对照平板在 30 °C 培养 6 天。随后，在水平台面上制备去重叠平板。

用血清移液管吸取23毫升温热的Bennett琼脂，将20毫升均匀地铺展在矩形培养皿表面，移液管中剩余的培养基留作防止气泡形成。用皿盖盖好培养皿。轻轻旋转培养皿，直至培养基覆盖整个皿面，并在琼脂完全凝固前勿扰动培养皿。

接下来，使用矩形培养皿盖作为描图模板制备硝酸纤维素膜片，使其能够贴合去重复化平板的表面。将膜片剪裁好后放入无菌袋中进行高压灭菌。现在检查无菌对照平板，确保在培养六天后无任何污染物存在。

若无污染，打开矩形培养皿的皿盖，用移液器将200微升种子培养物滴加到矩形培养皿中 Bennett 琼脂表面。使用无菌棉签将培养物均匀涂布至整个培养皿表面。将制备好的硝酸纤维素膜覆盖于培养皿表面的培养物上时，需将膜的底边与培养皿的底边对齐，然后从底边向顶边缓慢铺放膜片。

使用无菌棉签轻轻压平膜与琼脂界面之间可能形成的任何气泡，确保膜与琼脂表面完全贴合。该膜可允许微生物在其表面产孢，同时次级代谢产物可分泌至下方的培养基中。盖上矩形培养皿的皿盖，并将其倒置放入密封的塑料袋中。

在30摄氏度下培养六天。六天后，从培养箱中取出去重平板。使用无菌镊子，小心地将硝酸纤维素膜从本内特琼脂表面移除。

确保平板边缘仅有少量孢子生长，以降低污染后续覆盖层的风险。确保工作台面水平，使用刻度移液管吸取23毫升温热的阳离子调节MHB琼脂。将20毫升琼脂均匀铺加在去重叠平板表面形成覆盖层，剩余琼脂保留在移液管中，以防止气泡产生。

将平板盖上盖子，轻轻旋转平板，使培养基均匀覆盖整个表面，并避免扰动直至琼脂完全凝固。待冷却凝固后，将去重平板放回密封的塑料袋中，倒置存放于4摄氏度环境中过夜，以促进次级代谢产物向MHB琼脂覆盖层中扩散。

同一天，首先用移液器将100微升阳离子调节的MHB加入96孔板的每个孔中，以接种新鲜的ARP或MARP模板。从-80摄氏度冰箱中取出冷冻保存的ARP或MARP文库板，尚未在底部形成冷凝水之前，移除铝制密封膜。

使用无菌的96孔板打孔工具，小心地从冷冻保存的ARP或MARP文库板中打孔，并接种至含有新鲜MHB的96孔板中。为在去重复过程中尽量减少污染，应准备足够数量的ARP或MARP文库板，使每块文库板仅用于去重复两到三个去重复板。操作完成后，为冷冻模板更换新的无菌铝封膜，并将其放回-80摄氏度冰箱中保存。

将接种后的96孔板放入松散密封的塑料袋中，在37摄氏度、250 RPM振荡条件下培养18小时。从培养箱中取出ARP或MARP模板，通过将培养板与ARP或MARP模板图谱进行比对，确认无污染物存在。从4摄氏度取出去重板，使其平衡至室温。

如果有冷凝水，请打开盖子，并在无菌环境中晾干。使用无菌的接种针工具，从ARP或MARP文库平板上挑取菌落，点种到去重平板的MHB琼脂覆盖层表面。注意不要刺破琼脂。

让模板接种物干燥三到五分钟。将接种后的去重板倒置放入密封塑料袋中，在37摄氏度下过夜培养。次日，通过比较去重板上的生长情况与对应于ARP或MARP图谱的孔位来分析去重结果。

在此ARP或MARP去重复化工作流程中，获得了阳性去重复化结果。其中，为菌株WAC 8921制备的提取物被鉴定为产生氯霉素。ARP生长缺失表明存在一种未在ARP或MARP文库板中涵盖的未知抗生素或较少见的抗生素。

由于MARPA同时利用了野生型大肠杆菌BW25113和一种高通透性且外排功能缺陷的突变型大肠杆菌BW25113 bamB tolC，因而形成了该方法特有的生长模式。该结果提示存在一种具有抗菌活性的化合物，但其无法穿透完整的外膜。这种大肠杆菌的生长模式还表明，穿刺工具灭菌不彻底，导致未知的大肠杆菌菌株在覆盖层之间发生转移。

此处展示了一个ARP或MARP冷冻保存菌种库平板被污染的示例，矩形培养皿表面生长出三个明显不同的大肠杆菌菌落。该结果表明，在去重过程中琼脂覆盖层被刺穿。在去重过程中也可能发生与MHB覆盖层相关的污染，在覆盖层表面呈现不规则的生长模式。

遵循本实验方案时，最重要的是采用正确的灭菌和无菌操作技术，以确保不会因污染而在任何步骤中受阻。这包括准备硝酸纤维素膜，使其尽可能紧密地贴合在Bennett琼脂平板的表面，以减少倾注MHB覆盖层时孢子的扩散。此外，在接种文库平板和去重复过程中，使用经过适当灭菌的点样设备也极为重要，以获得最清晰的结果。

除了用于已知抗生素的去重鉴定外，该方法还可用于发现能够与现有抗生素联合使用以恢复其活性的增效剂。尽管抗生素去重并非新技术，但该过程以耗时耗力而著称。ARP 和 MARP 平台揭示了抗生素去重无需大规模操作，仅需最少的设备即可在两周内完成。