使用延长恐惧条件化方案的大鼠恐惧孵育

记忆是一种心理过程，包括信息获取、巩固和提取等多个阶段。在巩固阶段，会形成新的突触连接并对已有的连接进行修饰。这一巩固过程依赖于刺激的强度，当刺激具有情绪相关性时，记忆痕迹更为强烈。

大多数关于情绪记忆的研究主要集中在杏仁核及其与其他脑结构的关系上，这些现象主要通过恐惧条件化范式进行研究。恐惧条件化是一种学习形式，能够建立厌恶事件与原本中性刺激之间的关联。

在哺乳动物中，最广泛使用的方法之一是经典条件反射，也称为巴甫洛夫条件反射，包括啮齿类动物和人类。以啮齿类动物为例，条件刺激（CS）通常是一幅图像，该图像在一次或多次实验过程中呈现一次或多次。

恐惧条件化实验方案通常包含一到两次声音刺激与电击的配对。然而，其他较少使用的厌恶刺激则涉及长时间的非致伤性电击。这种训练方式被称为厌恶训练，可产生一种持久的记忆效应，称为恐惧孵育。

恐惧孵育是指条件性反应的强度随着时间推移而增强，这种现象可能在进一步暴露于其他类似事件或条件性刺激后加剧。近年来对恐惧孵育在行为学和神经生物学层面的研究进展，揭示了其与其他啮齿类动物行为及心理现象的关联，包括某些精神障碍的延迟反应。本文描述了一种在人类中扩展的恐惧条件化范式，我们在20次实验后，分别于48小时及六周时检测了情境性记忆和线索相关记忆。

这使我们能够测试情绪记忆随时间的强度变化。选取12只成年雄性Wistar大鼠，每4只一组饲养在笼中，实验期间自由饮水。将大鼠维持在其自由进食体重的85%，每天在相同时间给予限量食物。

将受试者随机分配至以下组别：训练后六周进行情绪测试。训练后48小时进行情绪测试。使用10%乙醇溶液清洁实验箱体和网格地板的所有内表面。

将电击强度校准仪上的红色和黑色夹子连接到栅格地板的两根金属棒上。将USB线缆连接到计算机的相应端口。启动电击强度校准仪软件。

通过点击按钮选择应用中一个毫安强度的电流。然后将运行/停止开关切换至运行状态。操作厌恶刺激器，并观察应用面板上显示的电击强度。

如有需要，使用厌恶刺激仪上的旋钮将强度调整至一毫安。关闭实验舱并关闭叙述盒的声音。启动僵直检测系统软件，并打开实验对话窗口。

输入每个受试者的详细信息并加载训练方案文件。选择相应的摄像头，并勾选侧面视频选项。将运动阈值设置为100，最小冻结帧数比设置为13帧。

确认所选摄像头的实时画面显示在屏幕上，同时显示运动阈值图以及训练过程中呈现的不同刺激的时间线。在检查运动指数保持在100以下的同时，连续单击三次“校准”选项，然后通过单击屏幕上相应的按钮选择要锁定的设备。

将实验对象放入实验箱中。点击记录按钮开始实验，共进行25次声音-电击配对或试验，每次试验间间隔60秒，从实验开始时计时。

在每次试次间隔的最后10秒呈现声音刺激，在每次试次间隔的最后2秒给予电击。28分钟实验结束后，将大鼠从实验箱中移出。将动物放回各自的家庭饲养笼中。

将大鼠放于其所在的家笼柜中，从行为训练室转运至动物饲养设施。根据所分配的组别，大鼠分别保持48小时或六周不接受任何处理。

在此期间，动物在其饲养笼中休息，并单独饲养。在六周的孵育期内，每周两次监测动物的体重。称重时，轻轻操作每只动物，持续两分钟。

可在计时后48小时对六只动物进行测试。这六只动物必须在六周后再次进行测试。重复进行冰冻检测系统的校准。

加载文件名和上下文测试协议。通过点击记录按钮开始会话。在此单次10分钟的上下文测试会话期间，不呈现任何刺激。

在情境测试后的第二天，根据分组对每只动物重复以下步骤。为改变视觉环境，将一个塑料围壁插入实验箱中。为改变嗅觉环境，将1%的乙酸涂抹于固定在棉签上的棉球上。

将其放置在金属托盘中，位于网格地板下方。使用不同的文件重复冷冻检测系统的校准。加载名为“Cue test protocol”的文件，通过点击记录按钮开始实验。

在此次持续15分钟的线索测试阶段中，条件刺激音调从第3分钟开始呈现，共呈现10次。即共进行10次线索测试试验，各试验之间以相同的间隔时间分隔，且不伴随电击。使用额外的自定义编程程序，获取训练阶段和线索测试阶段中对音调产生僵直反应的百分比。

每个训练阶段八个三分钟时间段内动物的僵直百分比。C 训练阶段前三分中的僵直百分比。由于在该三分钟期间未呈现任何电击或提示信号，因此可将此最后一项测量视为基线僵直水平。

要获取此数据，请打开冷冻检测系统软件并按照以下步骤操作：选择“文件”、“报告”、“工作台组件摘要”，然后选择开放科学框架免费存储库中可用的 cmd 文件，输入名称后打开文件。

将运动阈值更改为100，然后单击“确定”。选择要分析的文件。打开的文件可以在Microsoft Excel中打开，以进行进一步分析。

最后，通过将每次实验的总僵直持续时间除以僵直发作的总次数，计算每次僵直发作的平均持续时间。在三分钟基线期期间，动物处于活跃状态并探索实验箱。

与后续阶段相比，基线期的僵直时间显著更短，这表明已形成恐惧习得。将试验阶段按每三分钟划分为若干区间后发现，在前三个电击试验期间，僵直时间所占百分比已达到平台期。

这一发现与既往研究结果及其他训练的指示一致。在训练期间，所有动物的僵直百分比显著高于基线期。训练六周后接受测试的动物在情境测试中的僵直百分比显著高于训练后48小时接受测试的动物。

在训练和记忆测试之间未观察到僵直时间的差异。通过其他指标进一步分析了不同组受试者在情境测试中的僵直反应。训练后六周接受测试的受试者活动水平显著低于条件化训练后48小时接受测试的动物。

训练后不久接受测试的动物的僵直时间显著短于训练后六周接受测试的动物。这些结果表明存在恐惧孵育效应。对每次僵直反应的厌恶程度进行分析后发现，在条件刺激后48小时接受测试的动物比训练后48小时接受测试的动物表现出更长的僵直持续时间。

在训练阶段基线期和线索测试中的所有动物的僵直百分比显著低于线索测试的测试期。仅在六周后进行线索测试的动物，其基线期僵直程度与线索测试的测试期相比存在显著差异。线索训练期间的平均僵直程度显著低于六周后线索测试期间的平均僵直程度。

在提示测试中，试验间歇期的平均僵直程度显著低于48小时后训练阶段试验间歇期的平均僵直程度。本文描述了一种扩展的恐惧条件化方案，可在恐惧孵育大鼠中产生过度训练效果。该方法是一种有效且可靠的方法，可用于评估短期（48小时）和长期（六周）的情绪记忆。

有大量的药理学、生理学和解剖学证据支持其在评估情绪记忆现象方面的有效性。该方案具有多种优势，其中包括：首先，前两种记忆测试类型，即情境记忆和线索记忆测试。该测试能够识别出针对情境和线索的测试所产生的不同效应。

其次，仅需一次28分钟的训练即可产生持续数周以上的长期效应。考虑到某些典型恐惧条件化实验需要在10次训练中至少施加100次电击，这一优势尤为显著。恐惧反应提供了多种可自动计算的测量指标。

与其他具有短暂训练阶段的恐惧条件化范式相比，产生厌恶训练效应的延长方案受到的关注较少。与此类厌恶训练相关的一个重要现象是恐惧孵育，该现象直到最近才在行为学和神经生物学层面开始被理解。

并且似乎与其他现象相关，包括创伤后应激障碍的延迟发作。关于这些方案的最佳实施与研究，最终建议包括：正确清洁实验箱，特别是抓握地板；在开启电击刺激前进行校准，以及对电击强度和僵直检测系统的校准。

该方案可用于测试所有品系的大鼠或其他啮齿类动物。在这些情况下，调整运动阈值和电击强度非常重要。