定量荧光显微镜为基础的单脂体测定，用于检测单个脂质体之间的成分不均匀性
2019年12月13日
该协议描述了脂体的制造，以及如何用荧光显微镜将这些脂体固定在表面上，并单独以大规模平行的方式成像。这允许定量种群单脂质体之间的大小和组成不均匀性。
大多数对脂质体的研究都依赖于大胆的技术，内在假设所有的脂质体是相同的。通过研究单脂体，可以观察到显著的异质性。这里介绍的单脂体技术使我们能够同时研究数百种脂质体，并检测其大小和成分的不均匀性。
该方法可以很容易地调整，以研究其他系统在一个单一的脂体水平，如蛋白质膜相互作用。你所需要的只是你研究的化合物被荧光标记。通过这个视频，我们为研究人员提供了他们如何执行单脂体研究的工具。
我们希望，很明显，该分析可以很容易地修改，以研究一系列其他科学课题。首先，将准备好的脂质储存138微升的波普克和120微升胆固醇混合在新鲜的玻璃瓶中。然后添加500微升，每个两个荧光标记脂质和50微升的DSPE-PEG-生物素。
松开玻璃瓶盖，将小瓶在液氮中捕捉冻结一到两分钟。在冷冻干燥机中冷冻脂质混合物过夜。早晨，在干脂中加入一毫升200毫摩尔D-索比托缓冲液。
将混合物加热至45摄氏度，使其暴露在磁搅拌中至少一小时。然后将小瓶浸入液氮中，然后冷冻脂质悬浮液，然后等待悬浮液完全冷冻。接下来，将冷冻悬浮液浸入55摄氏度的加热浴中，直到混合物完全解冻。
将混合物暴露在总共 11 个冷冻解冻循环中。之后，使用迷你挤出套件，通过 800 纳米聚碳酸酯过滤器挤出脂体悬浮液一次。混合 1，200 微升 BSA 和 120 微升 BSA 生物素。
在八井滑梯中，将混合物的300微升加入到每井中，并在室温下孵育20分钟。稍微倾斜幻灯片，从每个滑点的边缘向上倾斜，并吸气介质。立即将 300 微升的 HEPES 缓冲液添加到每个井中进行清洗。
每井总共洗八次。加入250微升的链球菌素，在室温下孵育10分钟。重复前面描述的八次洗涤。
将幻灯片放在显微镜上，并调整显微镜操纵手柄以聚焦在室表面。这可以很容易地使用从玻璃缓冲接口增加的激光反射信号作为参考。在微离心管中，加入含有20微摩尔总脂质的稀释脂质库存10微升。
将 100 微升缓冲液从腔室转移到微离心管，正确混合，然后将 110 微升将缓冲器重新传递回腔室。将室置于显微镜下，并使用能够检测来自脂质荧光团的信号的初级显微镜设置来观察脂质体在表面上被固定。设置手稿中描述的显微镜。
要在脂质体中同时成像 DOPE ATTO488 和 DOPE ATTO655 荧光团，请成像多个通道。确保每个通道按顺序成像，以避免交叉激发。例如，首先在 488 纳米时以令人兴奋的速度拍摄一张图片，在 495 到 590 纳米时读取发射。
此后，更改设置，以 633 纳米的令人兴奋的速度拍摄另一个图像，但读取发射仅为 660 至 710 纳米。分析。在图像菜单中，选择颜色并使用合并通道功能创建两个通道的合成。观察在两个不同的通道中成像的脂质体是否显示良好的共定位，或者是否发生了可见漂移。
要检测粒子，请打开插件菜单，选择 ComDet 并单击检测粒子。在 ComDet 中，检查设置是否正确，然后按"确定"。运行分析后，将显示两个弹出窗口，显示结果和摘要。结果表包含两个通道之间的强度比。
导出包含共同本地化数据的数据表结果。将强度比直方图与高斯函数拟合，并提取均值和标准差。均值和标准差可用于计算不均匀性的程度。
准备通过 50 纳米过滤器挤出多次的脂体配方。通过将荧光强度与DLS的尺寸数据进行比较，校准脂质体的大小。使用与以前相同的实验显微镜设置，对校准脂质体进行成像。
绘制校准脂质体荧光强度的平方根强度直方图。将直方图与对数正态分布拟合，并提取校准脂质体的平均荧光强度作为几何平均值。要确定平方根强度和脂体大小之间的关系，通过将从动态光散射测量中获得的平均脂体直径与平方根强度的几何平均值进行划分来计算校正系数。
计算组合不均匀性实验中脂质体的强度值，并将这两个直径与校正因子相乘。绘制强度比值作为组成非等性脂质脂质体直径的函数，从而实现脂质大小的不和源性，为从大约 50 纳米到 800 纳米的脂质体种群。在该协议中，在衍射有限强度点指示的腔室中加入脂质体溶液后，脂质体的成功表面固定立即显现出来。
建议固定足够的脂质体，以达到每帧 300 到 400 个脂质体的密度。较低的密度使数据分析更加耗时，而较高的密度则难以区分单个脂质体。如果整个视野没有正确聚焦，则样品板可能会倾斜。
此外，如果脂质体看起来又大又模糊，则表示腔室中的缓冲液可能已经蒸发，表面干涸。强度比直方图通常显示围绕平均比率值的高斯分布。如果观察到与高斯分布的强烈偏差，则表示检测灵敏度问题，表明已排除了显示较弱信号的脂质体子集。
将强度比直方图与高斯函数拟合后，将0.23的不和质值度转换为32%的人口，与合奏的均摩尔比相差23%以上。实验不确定性的定量为0.1。检测永远不会得到更好的材料，你使用，所以高品质的非摩尔脂质体是必不可少的。
因此，当您准备这些，不要削减任何角落，如离开冻结解冻周期。糟糕的图像会导致高实验性的不确定性，并让你高估了不均匀性，所以花时间去获取好的对焦图像。测定基本上要研究荧光标签的表面密度。
如果此荧光标签在渗透脂质上，则此检测可用于检测药物输送的脂质体。该设置已被应用于研究肽如何与膜结合和感觉曲率。这给了研究人员独特的见解，指导肽在细胞内如何排序的分子线索。
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概述
该协议描述了一种研究单个脂质体的方法，允许观察到尺寸和组成的显著不均匀性。通过使用荧光显微镜，研究人员可以以平行方式对单个脂质体进行成像和量化。
关键研究组成部分
科学领域
- 生物物理学
- 荧光显微镜
- 纳米技术
背景
- 传统研究假设脂质体是相同的。
- 单个脂质体研究揭示了不均匀性。
- 荧光标记对这种技术至关重要。
- 该方法可以适用于各种系统。
研究目的
- 提供研究单个脂质体的协议。
- 量化尺寸和组成差异。
- 使研究人员能够探索蛋白质膜相互作用。
使用的方法
- 脂质体的制造。
- 在表面上固定。
- 使用荧光显微镜进行大规模并行成像。
- 量化脂质体特征。
主要结果
- 观察到脂质体群体中的显著不均匀性。
- 该方法允许同时研究数百个脂质体。
- 可适用于其他荧光标记的化合物。
- 为该领域的研究人员提供了新的工具。
结论
- 单个脂质体技术增强了对脂质体行为的理解。
- 它为研究复杂的生物相互作用开辟了途径。
- 研究人员现在可以以前所未有的水平调查脂质体的多样性。
常见问题
Executive Industry Relevance
Ensuring batch-to-batch consistency in liposomal drug formulations is critical for predictable pharmacokinetics and regulatory compliance. This single-particle fluorescence microscopy assay enables direct detection of size and compositional inhomogeneities that bulk methods miss, supporting mechanistic de-risking in early formulation development. By quantifying heterogeneity at the individual liposome level, the method improves predictive confidence in lipid nanoparticle performance and informs go/no-go decisions in preclinical screening.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates lipid formulation hypotheses by revealing compositional variance that may impact drug encapsulation efficiency.
- Operational Value: Enables functional validation of lipid excipient ratios through direct single-liposome readouts.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares standardized, characterized liposome populations for downstream protein-membrane interaction or peptide binding assays.
- Operational Value: Delivers quantitative fluorescence intensity ratios as reproducible readouts for assay standardization across labs.
- Scientific Value: Supports scalable screening of lipid variants by enabling parallel imaging of hundreds of liposomes per field.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links liposome physicochemical properties to functional outcomes in drug delivery models through correlative size-composition analysis.
- Operational Value: Provides a disease-relevant system for evaluating how formulation changes affect liposome uniformity prior to in vivo testing.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery-to-preclinical continuum by enabling lipid formulation screening after initial design and before cellular efficacy testing, supporting data-driven progression decisions.
- Discovery Biology: Tests lipid composition hypotheses by measuring inhomogeneity as a function of size, clarifying structure-property relationships in membrane models.
- Screening: Generates intensity ratio histograms that serve as quantitative outputs for comparing lipid formulations under identical imaging conditions.
- Analytics: Extracts mean and standard deviation from Gaussian-fitted intensity ratio histograms to calculate degree of inhomogeneity, enabling statistical comparison of batches.
- Translational Research: Connects nanoscale lipid variability to macroscale performance by correlating single-liposome data with dynamic light scattering size calibration.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for lipid nanoparticle characterization that can be adapted to study protein binding, peptide sorting, or membrane curvature sensing.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in lipid-drug interactions by exposing hidden population heterogeneity.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized immobilization, washing, and multi-channel imaging protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by identifying non-uniform batches early, reducing failure risk in later-stage development.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of lipid formulations based on quantified compositional uniformity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy, lipid handling, and image analysis plugins such as ComDet for particle detection.
- Depends on access to a microscope capable of sequential multi-channel imaging and freeze-thaw extrusion equipment for liposome preparation.
- Necessitates standardization of lipid stock preparation, extrusion cycles, and surface immobilization timing across users.
- Must account for buffer evaporation and focus drift, which can artificially inflate size measurements or reduce signal-to-noise.
- Performance is limited by fluorophore brightness and labeling efficiency; suboptimal labeling increases experimental uncertainty and risks overestimating inhomogeneity.
