角膜内皮细胞损失非侵入性激光辅助实验模型的发展

目前角膜内皮细胞流失的疾病模型侧重于内皮的破坏，更可能代表角膜移植不可避免的疾病的最后阶段。然而，使用干细胞或基因疗法的新疗法现在可用于疾病的早期阶段，而缺乏这些模型。使用 Nd:YAG 激光进行光破坏的非侵入性眼内手术已成为眼科医生的常规程序。

从当地屠宰场获得新鲜被驯化的猪眼后，将样本以四摄氏度的全中等温度放置。使用剪刀去除细胞外组织，将眼睛浸泡在5%的碘眼液中5分钟。其次，将消毒样品放在无菌PBS中，在室温下。

使用光谱域光学相干断层扫描设备，筛查眼睛中的主要前段病理，如角膜疤痕、水肿和其他不透明度。经过筛选，将眼睛放在装有波长为 1，064 纳米、空气中焦点直径为 10 微米的 Nd:YAG 激光器的滑灯单元前面。选择 12X 放大率并偏转照明以可视化各个角膜层。

将脉冲能量和焦点设置为角膜内皮细胞选择性消融的适当参数后，对组织进行多次激光照射。然后在解剖显微镜下，将一个清晰的角膜副体靠近边缘，并注射粘弹性，以稳定前室。然后使用8毫米的颤数切除激光处理的中央角膜，将分离的角膜放入12井板内皮侧的一个井中。

收集所有角膜后，在每个样品井中加入三毫米的全介质，并在37摄氏度下孵育样品长达三天。在孵化结束时，用索伦森缓冲液中不含甲醇的4%甲醛代替每口井中的介质，在室温下孵育20分钟。在孵育结束时，将固定样品放在PBS中20%蔗糖中约一小时，直到角膜下沉。

将样品在 PBS 中隔夜转移到 30%蔗糖中，然后将组织嵌入最佳切割温度，在零下 80 摄氏度下储存。使用温度设置为零下 27 摄氏度的低温统计器，在获得后一分钟内获取 10 微米厚的冷冻组织，收集显微镜幻灯片上的每个部分。然后将幻灯片存放在零下80摄氏度，直到染色。

对于赤氧树脂和 eosin 染色，空气干燥冷冻部分几分钟，以去除水分，然后用过滤的 0.1% 迈尔的赤氧素染色，在 50 毫升管中 10 分钟。在孵化结束时，用双蒸馏水冲洗滑梯五分钟。接下来，将幻灯片浸入 0.5%eosin 10 次，然后浸入双蒸馏水中冲洗，直到 eosin 停止条纹。

将冲洗过的幻灯片浸入 50% 乙醇中 10 次，在 70% 乙醇中浸10次。最后70%乙醇浸渍后，在95%乙醇中平衡30秒，随后在100%乙醇中平衡60秒，然后多次浸渍二甲苯。然后在光学显微镜上获取图像之前，使用盖玻片安装试样。

应独立评估两个光子和光显微镜图像，认为无损伤、太大的损伤或正确的损伤量。根据这些评估，可以计算热图，以选择正确的激光参数星座，选择性消融角膜内皮细胞，对周围组织的损害最小。先前的分析已经确定，激光的聚焦点必须至少比角膜内皮后面0.15毫米，以测试测试的最低脉冲能量。

对于高于2.9毫焦耳的脉冲能量，测试的最长焦距仍然离内皮太近。各种细胞保护剂可以测试，而切除标本在培养。如果证明成功，它们可以添加到灌溉溶液中进行处理。