Name: 角膜内皮细胞损失非侵入性激光辅助实验模型的发展 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-24T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 23 s
Description: 了解使用Nd:YAG激光非侵入性分离猪眼角膜内皮细胞的方法，建立大泡性角膜病变早期体外疾病模型。该技术为研究角膜内皮细胞动力学和开发早期干预措施提供了新途径。

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感谢 Christine Örün 和 Jan A. M. Sochurek 在实验方法方面提供的帮助。

所有涉及动物组织的操作均遵循当地动物护理与伦理委员会的指导方针。
1. 器官培养的准备与激光处理
<ol>
	<li>从当地屠宰场获取新鲜摘除的猪眼。将其置于含高糖的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中，并添加 L-谷氨酰胺、丙酮酸钠、青霉素/链霉素（1%）和猪血清（10%），于 4 °C 保存。该培养基在本文中简称为完全培养基。</li>
	<li>用剪刀去除眼外组织，将眼球在 5% 聚维酮碘眼用溶液中浸泡 5 分钟，随后置于无菌磷酸盐缓冲液（PBS）中待用。</li>
	<li>使用谱域光学相干断层扫描仪（材料表）筛查眼前节主要病变，如角膜瘢痕、水肿及其他混浊。</li>
	<li>将眼球置于配备 Nd:YAG 激光器（材料表）的裂隙灯装置前，激光波长为 1,064 nm，在空气中的聚焦光斑直径为 10 µm。 
	注意：为实现最佳定位，使用一个 3D 打印的固定装置，该装置设计用于稳固持握眼球，同时避免施加过大压力（图 1）。</li>
	<li>使用 12 倍放大倍率，并偏转照明光路以观察角膜各层结构。</li>
	<li>设定脉冲能量（例如 1.6 mJ）和聚焦点（例如 0.16 mm），以实现对角膜内皮细胞的选择性消融。</li>
	<li>在靠近角膜缘处进行透明角膜穿刺，并注入粘弹剂（材料表），以稳定前房。</li>
	<li>使用 8 mm 角膜刀切除经激光处理的中央角膜区域。</li>
	<li>将切除的角膜组织置于 12 孔板的孔中，内皮面朝上，加入 3 mL 完全培养基，在 37 °C 条件下孵育最多 3 天。 
	注意：在此步骤中，可向培养基中添加潜在的细胞保护剂。</li>
</ol>
2. 组织学准备
<ol>
	<li>配制 pH 为 7.4 的 Sorensen 缓冲液，其中包含 19.6 mL 的 133 mM KH2PO4 和 80.4 mL 的 133 mM Na2HPO4。</li>
	<li>从含有角膜的孔中移除培养基，并在室温（RT）下使用 Sorensen 缓冲液中的无甲醇多聚甲醛（4%）固定组织 20 分钟。</li>
	<li>将组织置于含 20% 蔗糖的 PBS 中直至组织下沉（1 小时），随后在含 30% 蔗糖的 PBS 中于室温下过夜。注意避免组织接触气泡和气液界面。将组织包埋于最佳切割温度（OCT）包埋剂中，并在 -80 °C 下保存。</li>
	<li>使用恒冷切片机在 -27 °C 下切取 10 μm 厚的切片。 
	注意：可使用骆驼毛刷辅助引导切片越过刀刃。</li>
	<li>在切片后 1 分钟内，通过将载玻片接触组织的方式将切片转移至载玻片上，以避免组织冻干。将载玻片在 -80 °C 下保存。</li>
</ol>
3. 苏木精和伊红（H&amp;#38;E）染色
<ol>
	<li>将切片在空气中干燥数分钟，以去除水分。</li>
	<li>在50 mL离心管中，用过滤的0.1% Mayer苏木精染色10分钟。</li>
	<li>在Coplin染色缸中，用流动的冷水ddH2O冲洗5分钟，然后浸入0.5%伊红溶液10次。</li>
	<li>浸入ddH2O中，直至伊红不再出现条纹状，随后依次浸入50%（10次）和70%（10次）乙醇中。</li>
	<li>再依次浸入95%乙醇（30秒）和100%乙醇（60秒）中平衡，然后多次浸入二甲苯中。</li>
	<li>最后封片并加盖盖玻片，使用光学显微镜进行成像。</li>
</ol>

<ol><li>DelMonte, D. W., Kim, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+and+physiology+of+the+cornea%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cataract+and+Refractive+Surgery%22%5BJournal%5D)">Anatomy and physiology of the cornea.</a> Journal of Cataract and Refractive Surgery. 37 (3), 588-598 (2011).</li>
<li>Edelhauser, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+balance+between+corneal+transparency+and+edema%3A+the+Proctor+Lecture%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">The balance between corneal transparency and edema: the Proctor Lecture.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (5), 1754-1767 (2006).</li>
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<li>Gain, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Survey+of+Corneal+Transplantation+and+Eye+Banking%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Global Survey of Corneal Transplantation and Eye Banking.</a> JAMA Ophthalmology. 134 (2), 167-173 (2016).</li>
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<li>Zhao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+three-dimensional+organ+culture+model+for+corneal+wound+healing+and+corneal+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Development of a three-dimensional organ culture model for corneal wound healing and corneal transplantation.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (7), 2840-2846 (2006).</li>
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<li>Zhu, Q., Zhu, Y., Tighe, S., Liu, Y., Hu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+Human+Corneal+Endothelial+Cells+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Engineering of Human Corneal Endothelial Cells In Vitro.</a> International Journal of Medical Sciences. 16 (4), 507-512 (2019).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotinamide+inhibits+corneal+endothelial+mesenchymal+transition+and+accelerates+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Nicotinamide inhibits corneal endothelial mesenchymal transition and accelerates wound healing.</a> Experimental Eye Research. 184, 227-233 (2019).</li>
<li>Pescina, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+convenient+ex+vivo+model+for+the+study+of+the+transcorneal+permeation+of+drugs%3A+histological+and+permeability+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Development of a convenient ex vivo model for the study of the transcorneal permeation of drugs: histological and permeability evaluation.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (1), 63-71 (2015).</li>
<li>Smeringaiova, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+Wound+Repair+of+the+Organ-Cultured+Porcine+Corneas%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Endothelial Wound Repair of the Organ-Cultured Porcine Corneas.</a> Current Eye Research. 43 (7), 856-865 (2018).</li>
<li>Yamashita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Rabbit+Corneal+Endothelial+Dysfunction+Model+Using+Endothelial-Mesenchymal+Transformed+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A Rabbit Corneal Endothelial Dysfunction Model Using Endothelial-Mesenchymal Transformed Cells.</a> Scientific Reports. 8 (1), 16868(2018).</li>
<li>Schubert, H. D., Trokel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+repair+following+Nd%3AYAG+laser+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Endothelial repair following Nd:YAG laser injury.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 25 (8), 971-976 (1984).</li>
<li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rabbit+Model+of+Corneal+Endothelial+Injury+Established+Using+the+Nd%3A+YAG+Laser%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">Rabbit Model of Corneal Endothelial Injury Established Using the Nd: YAG Laser.</a> Cornea. 36 (10), 1274-1281 (2017).</li>
<li>McCally, R. L., Bonney-Ray, J., de la Cruz, Z., Green, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+endothelial+injury+thresholds+for+exposures+to+1.54+micro+m+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Health+Physics%22%5BJournal%5D)">Corneal endothelial injury thresholds for exposures to 1.54 micro m radiation.</a> Health Physics. 92 (3), 205-211 (2007).</li>
<li>Nash, J. P., Wickham, M. G., Binder, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+damage+following+focal+laser+intervention%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Corneal damage following focal laser intervention.</a> Experimental Eye Research. 26 (6), 641-650 (1978).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本初步研究的结果表明，当选择适当的能量剂量和焦点位置参数时，可以使用Nd:YAG激光选择性消融角膜内皮细胞。
由于内皮功能对维持角膜透明性以及防止角膜基质水肿具有重要意义，因此内皮功能障碍模型在抗水肿药物或手术方法的研发中发挥着重要作用。目前已建立多种体外模型用于模拟体内情况10,14,15，但众所周知，体外模型无法完全模拟酶、细胞因子的影响以及细胞间相互作用的效应。相比之下，这种新开发的内皮细胞丢失的离体模型能够在自然环境中监测不同疾病状态及角膜失代偿过程。
由于本模型中的角膜在激光手术后使用角膜环钻切除，角膜的生理状态发生变化，类似于体外情况，区域间的相互作用受到显著阻碍。然而，局部界面仍保持完整，尤其是角膜内细胞与其他细胞之间的通讯得以持续。我们的研究显示，在这些条件下，角膜在体外培养中可维持功能达三天之久，这为观察和评估潜在治疗药物提...

角膜的透明性对于光线传递至视网膜及其感光细胞至关重要1。在此方面，相对脱水的状态对于维持角膜基质内胶原纤维的正确排列至关重要。这种稳态由位于后弹力层（Descemet’s membrane, DM）上的角膜内皮细胞（corneal endothelial cells, CEC）维持2。内皮层是角膜最内层，具有重要的屏障和泵功能，对维持角膜透明性至关重要3。与上皮层不同，内皮层无法自我更新4。因此，任何由疾病或外伤引起的细胞损伤都会刺激残留的内皮细胞增大并迁移，以覆盖形成的缺损区域，维持角膜功能5。然而，当CEC密度降至某一临界阈值以下时，内皮功能失代偿将导致角膜水肿，引起视力模糊、不适甚至剧烈疼痛4。尽管已有药物可缓解症状，但目前此类情况的唯一根治性治疗方法仍是角膜移植，该手术可采用全层移植或板层内皮移植的方式进行。后者包括后弹力层内皮角膜移植术（Descemet's membrane endothelial keratoplasty, DMEK）和后弹力层剥除自动内皮角膜移植术（Descemet's stripping automated endothelial keratoplasty, DSAEK）6。然而，保护残存CEC并增强其存活率可能成为一种替代治疗策略，但该策略需要建立合适的疾病模型以评估潜在的治疗药物。
目前的角膜内皮细胞丢失疾病模型主要通过向眼前房注射毒性物质（如苯扎氯铵）或使用侵入性Descemet撕除技术机械刮除细胞，从而破坏内皮层7,8。尽管这些模型已得到广泛建立，但仍存在诸如引发普遍炎症反应和造成非特异性附带损伤等缺点。因此，这些模型更倾向于代表疾病终末阶段的情况，此时上述手术治疗方案已不可避免。
随着干细胞和基因治疗等细胞治疗策略的进步，在角膜内皮细胞（CEC）丢失的早期阶段应用这些细胞疗法可能具有潜在价值9。因此，我们需要一个能更充分地模拟该疾病早期阶段的模型。在这方面，细胞培养模型在过去十年中已有改进，但其有效性仍存在局限，因为体外培养的细胞难以接近模拟角膜内不同类型细胞之间发生的复杂相互作用10。因此，离体（ex vivo）和在体（in vivo）疾病模型仍然需求迫切，改进现有模型具有重要意义。
自20世纪70年代末引入以来，利用掺钕钇铝石榴石（Nd:YAG）激光通过光致破裂进行的非侵入性眼内手术已成为全球眼科医生的常规操作11。光致破裂依赖于非线性光吸收，导致等离子体形成、声冲击波产生以及在液态环境中施用时产生空化气泡12。通常，这些过程有助于实现精确切割组织的预期效果。然而，它们也可能造成不必要的附带损伤，从而限制激光手术的局部局限性13。
通过表征冲击波传播和空化过程，对所产生的力学效应的预测已显著改善。我们的目标是在尽可能减少对周围组织损伤的情况下靶向角膜内皮细胞（CEC），从而为CEC丢失的早期阶段提供一种非侵入性、激光辅助的实验疾病模型。为此，必须确定激光脉冲能量的最佳值以及激光聚焦点的最优位置。

<table><tbody><tr><td>巴伦真空环钻</td><td>Katena</td><td>K20-2058</td><td></td></tr><tr><td>冷冻切片机</td><td>Leica</td><td>CM 3050S</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科&amp;rsquo;s 改良伊格尔&amp;rsquo;s 中等 - 高葡萄糖培养基</td><td>PAA</td><td>E-15009</td><td></td></tr><tr><td>眼固定器</td><td>自我</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td>Leica</td><td>DMI 6000 B</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>默克</td><td>529568</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>默克</td><td>1065860500</td><td></td></tr><tr><td>Nd:YAG 激光器</td><td>蔡司医疗技术</td><td>visuLAS YAG II plus</td><td></td></tr><tr><td>OCT Tissue Tek</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Gibco</td><td>10010056</td><td></td></tr><tr><td>猪血清</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12736C</td><td></td></tr><tr><td>光谱域光学相干断层扫描仪</td><td>海德堡工程公司</td><td>Spectralis</td><td></td></tr><tr><td>12孔组织培养板</td><td>Sarstedt</td><td>833921</td><td></td></tr><tr><td>双光子显微镜</td><td>JenLab</td><td>DermaInspect</td><td></td></tr><tr><td>粘弹性</td><td>OmniVision</td><td>Methocel</td><td></td></tr></tbody></table>

一种非侵入性激光辅助角膜内皮细胞丢失实验模型的建立

Development of a Noninvasive, Laser-Assisted Experimental Model of Corneal Endothelial Cell Loss

Nd:YAG激光已用于无创眼内手术（如后囊切开术）数十年。其切割效应依赖于激光焦点处的光学击穿。在此过程中产生声学激波和空化气泡，导致组织破裂。气泡尺寸和压力振幅随脉冲能量及焦点位置而变化。本研究将摘除的猪眼置于商用Nd:YAG激光器前方，测试了不同脉冲能量以及角膜后方不同焦点位置的影响。通过双光子显微镜和组织学方法评估所产生的损伤，以确定仅选择性剥离角膜内皮细胞（CEC）并造成最小附带损伤的最佳参数。该方法的优势在于对CEC的精确消融、附带损伤减少，以及最重要的——非接触式治疗。

采用本文所述方法，我们使用Nd:YAG激光器对眼睛进行处理，评估了不同脉冲能量（1.0−4.6 mJ）和焦点位置（距角膜后表面距离：0.0−0.2 mm），以确定最佳参数。每种激光参数组合（12 × 21）均进行多次重复实验（n = 3）评估。
除了上述方案外，在固定和H&amp;E染色前，样本还使用双光子显微镜进行了分析。该双光子显微镜采用一种固态、锁模80 MHz Ti:sapphire激光器作为光源，其调谐范围为690−1040 nm，在800 nm处的平均激光输出功率&gt;900 mW。显微镜向样本输送的脉冲宽度约为150 fs。图像使用显微镜物镜（20x/0.95）在730 nm波长和30 mW激光功率下采集。
两名审稿人独立审阅了双光子显微镜和光学显微镜图像，审稿人在不知晓实验条件的情况下，需将图像归入以下三类：（1）无损伤，（2）损伤过大，或（3）损伤程度适中（图2 和 图3）。根据他们的评估...

本文介绍了一种使用掺钕钇铝石榴石（Nd:YAG）激光从后弹力层（DM）上分离角膜内皮细胞（CEC）的实验方案，作为大泡性角膜病变（BK）的离体疾病模型。

Nd:YAG激光已用于执行数十年的无创眼内手术，例如囊膜切开术。其切割作用依赖于……

目前关于角膜内皮细胞丢失的疾病模型主要集中在内皮层的破坏，更可能代表了疾病终末阶段，此时角膜移植不可避免。然而，现已出现利用干细胞或基因治疗等新疗法，可能对疾病早期阶段更为有效，但针对这些早期阶段的模型尚属缺乏。使用Nd:YAG激光通过光致破裂进行的无创眼内手术，已成为眼科医生的常规操作。从当地屠宰场获取新鲜摘除的猪眼后，将样品置于4°C的完全培养基中。使用剪刀去除细胞外组织，并将眼球浸泡在5%聚维酮碘眼用溶液中5分钟。随后，将消毒后的样品置于室温下的无菌PBS中。使用谱域光学相干断层扫描仪对眼部进行检查，筛查角膜瘢痕、水肿及其他前节主要病变等异常情况。完成筛查后，将眼球置于配备波长为1,064纳米、空气中焦点直径为10微米的Nd:YAG激光器的裂隙灯装置前方。选择12倍放大倍率，并偏转照明光路以观察角膜各层结构。在将脉冲能量和焦点位置调整至适宜参数以选择性消融角膜内皮细胞后，对组织施加数次激光脉冲。随后在解剖显微镜下，于角膜缘附近做一个透明角膜穿刺口，注入粘弹性物质以稳定前房。然后使用直径为8毫米的角膜环钻切除经激光处理的中央角膜，并将分离出的角膜放入12孔板中的一个孔内，内皮面朝上放置。当所有角膜收集完毕后，向每个样本孔中加入三毫米完全培养基，并在37摄氏度下孵育标本最长三天。孵育结束后，将每孔中的培养基替换为不含甲醇的4%多聚甲醛Sorensen缓冲液，在室温下孵育20分钟。孵育结束后，将固定后的样本置于含20%蔗糖的PBS溶液中约一小时，直至角膜下沉。将样本转移至含30%蔗糖的PBS溶液中，4℃过夜孵育，随后将组织包埋于最佳切割温度（OCT）包埋剂中，并于-80℃保存。使用设定为-27℃的冷冻切片机对冷冻组织进行切片，获得厚度为10 µm的切片，并在切片完成后1分钟内将其收集至载玻片上。切片完成后，将载玻片于-80℃保存，直至染色。 进行苏木精-伊红染色时，先将冷冻切片在空气中干燥数分钟以去除水分，然后在50毫升离心管中用滤过的0.1% Mayer苏木精染色10分钟。染色孵育结束后，在比色皿中用双蒸水冲洗切片5分钟。接着将切片浸入0.5%伊红溶液中10次，随后在双蒸水中浸洗，直至伊红不再出现拖尾现象。 将清洗后的载玻片在50%乙醇中浸洗10次，再在70%乙醇中浸洗10次。最后一次70%乙醇浸洗后，将切片在95%乙醇中平衡30秒，随后在100%乙醇中处理60秒，再在二甲苯中多次浸洗。最后用盖玻片封片，并在光学显微镜下观察成像。双光子和光学显微图像应独立评估，判断为无损伤、损伤过度或损伤程度适当。根据这些评估结果，可进一步生成热图，以选择合适的激光参数组合，实现对角膜内皮细胞的选择性消融，同时将对周围组织的损伤降至最低。先前的分析已确定，对于所测试的最低脉冲能量，激光焦点必须位于角膜内皮后方至少0.15毫米处。当脉冲能量高于 2.9 毫焦时，所测试的最长焦距仍然过于接近内皮层。可在离体样本培养期间测试多种细胞保护剂。若证实有效，可将其添加至灌注液中用于治疗。

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角膜新生血管（NV）可导致多种视觉病理并发症。通过使用可控的碱烧伤损伤模型，可产生可量化的角膜新生血管水平，用于角膜新生血管的机制研究以及针对新生血管性疾病的潜在疗法的评估。...

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以下文章提供了一种简便且可重复的技术，用于有效建立可持续的小鼠角膜缘干细胞缺乏症（LSCD）模型。该动物模型可用于测试和比较针对角膜缘干细胞疾病治疗方法的有效性。...

一种建立小鼠角膜缘干细胞缺乏症的简易机械方法

此处，我们展示了纵向研究的实用性 体内 小鼠激光诱导脉络膜新生血管形态学改变随访中的成像...

体内 多模态成像与小鼠激光诱导脉络膜新生血管模型分析

本文介绍了一种猪角膜瓣的制备与培养的逐步操作方案。由于该类器官型培养的器官培养模型在15天内的细胞死亡率与人供体角膜相当，因此成为首个无需添加有毒右旋糖酐即可实现非人角膜长期培养的模型。...

一种利用分割角膜瓣构建的猪角膜内皮器官培养模型

单纯后弹力层剥离术（Descemet's Stripping Only，DSO）是一种实验性手术方法，适用于因福克斯内皮角膜营养不良（Fuchs Endothelial Corneal Dystrophy）导致中央角膜出现滴状赘疣的患者，通过剥离后弹力层，促使周边细胞再生内皮层。本文提出一种新的方法，模拟在体外（ex...

一种仅进行后弹力层剥离的人类角膜器官培养模型及其由工程化成纤维细胞生长因子1促进的加速愈合

本方案描述了一种在小鼠模型中诱导精确且可重复的角膜和角膜缘碱烧伤的方法。该方案的优点在于能够使损伤均匀地分布于曲率较高的小鼠角膜和角膜缘区域。...

采用打孔-角膜环钻技术在小鼠模型中诱导角膜和角缘碱烧伤损伤

本文提出了三种不同的方法来损伤支配角膜的感觉神经纤维。这些方法有助于在小鼠中研究轴突再生。这三种方法可适用于其他动物模型，是研究角膜神经支配生理学及再生的理想选择。...

诱导小鼠角膜神经营养性角膜炎及神经再生的三种策略

了解使用Nd:YAG激光非侵入性分离猪眼角膜内皮细胞的方法，建立大泡性角膜病变早期体外疾病模型。该技术为研究角膜内皮细胞动力学和开发早期干预措施提供了新途径。

一种非侵入性激光辅助角膜内皮细胞丢失实验模型的建立

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