Name: 检测小鼠中性粒细胞的迁移和渗透 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-06T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: 学习使用气囊实验和佐剂诱导关节炎模型评估小鼠中性粒细胞在炎症部位的迁移能力。该方法可应用于关节炎和炎症性肠病研究，为开发靶向治疗提供实验基础。

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本工作得到国家自然科学基金（资助号：81430099 和 31500704）、国际科技合作与交流项目（资助号：2014DFA32950）以及北京中医药大学科研项目（资助号：BUCM-2019-JCRC006 和 2019-JYB-TD013）的支持。

所有实验程序均经北京中医药大学动物护理与使用委员会审查并批准。
注意：使用 C57BL/6 小鼠（7-8 周龄）。
1. 中性粒细胞分离
<ol>
	<li>腹腔渗出细胞的获取
	<ol>
		<li>用去离子水（ddH2O）新鲜配制10%蛋白胨溶液。根据小鼠数量计算所需体积。 
		注意：设小鼠数量为N，需预先溶解并过滤(2N+1) mL溶液。</li>
		<li>用70%乙醇喷洒操作区域。使用胰岛素注射器吸取1 mL蛋白胨溶液，并排出气泡。</li>
		<li>对每只小鼠进行第一次腹腔注射，注射量为1 mL蛋白胨溶液。
		<ol>
			<li>用一只手将小鼠抓握成头朝下的姿势，用蘸有酒精的棉球对注射部位进行消毒。 
			注意：推荐的注射部位位于腹部左下或右下象限的侧面。</li>
			<li>快速注入试剂。使用胰岛素注射器将1 mL溶液注入每只小鼠的腹腔内。 
			注意：针头与皮肤之间的角度应约为15−30°，以避免损伤肠道或其他器官。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>让炎症反应过夜发展。12小时后，以与第一次注射相同的方式进行第二次注射。</li>
		<li>第二次注射后3小时，将小鼠置于流速为2 L/min的气体麻醉室中，用5%异氟烷麻醉5分钟，直至完全麻醉。将麻醉后的小鼠从麻醉室中取出，并通过颈椎脱位法处死。 
		注意：在将小鼠从麻醉室转移至单人操作单元前，应通过夹捏脚趾确认麻醉深度。夹捏脚趾时，小鼠腿部不应出现运动反应。 
		注意：所有后续步骤均应在组织培养生物安全柜中进行。</li>
		<li>用70%乙醇喷洒小鼠体表。将小鼠仰卧于无菌塑料垫上，并用针固定四肢。</li>
		<li>使用一套无菌外科器械，在下腹部中线处做一横向切口（约1 cm）。用镊子提起上腹部皮肤，沿腹中线剪开，暴露完整的腹膜壁。</li>
		<li>使用30 G × 1/2&#34;针头向腹腔内注入5 mL无菌RPMI-1640完全培养基。将针头斜面朝上刺入腹膜壁，并注入全部液体。</li>
		<li>水平摇动塑料垫5分钟，轻轻按摩腹部数次。</li>
		<li>将23 G × 1 1/4&#34;针头插入腹部侧方空间，抽取腹腔液体（约5 mL），收集至50 mL离心管中。 
		注意：为防止中性粒细胞激活，应尽快将离心管置于冰上。</li>
		<li>再次注入5 mL完全培养基，重复操作以回收腹膜内残留细胞。将腹腔液合并至同一50 mL离心管中。</li>
		<li>将合并的腹腔液在室温（RT）下以400 × g离心10分钟。</li>
		<li>弃去上清液。将细胞重悬于1 mL RPMI-1640完全培养基中。 
		注意：避免使用涡旋振荡器，以防激活中性粒细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>中性粒细胞的分离
	<ol>
		<li>在15 mL离心管中加入4 mL新鲜配制的70.2%密度梯度介质（例如Percoll）。</li>
		<li>使用尖头移液器沿15 mL离心管管壁缓慢地将4 mL新鲜配制的54.8%密度梯度介质叠加至70.2%密度梯度介质上方。 
		注意：操作时需小心，避免扰动54.8%与70.2%密度梯度介质之间的界面。</li>
		<li>使用尖头移液器将1 mL腹腔细胞悬液缓慢地叠加至54.8%密度梯度介质层上方（图1A）。 
		注意：操作时需小心，避免扰动细胞悬液与54.8%密度梯度介质之间的界面。</li>
		<li>在22 °C下以1,500 × g离心30分钟，不启用刹车。</li>
		<li>收集位于54.8%与70.2%密度梯度介质界面处的中性粒细胞至新离心管中（图1B）。</li>
		<li>向收集的细胞中加入1 mL RPMI-1640完全培养基，通过轻柔吹打数次小心重悬细胞。在室温下以100 × g离心10分钟，并小心弃去上清液。</li>
		<li>重复洗涤步骤一次（即步骤1.2.6）。</li>
		<li>向细胞沉淀中加入0.5 mL培养基，通过轻柔吹打数次重悬细胞。取50 µL样品，使用全自动血液分析仪进行细胞计数。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 中性粒细胞迁移实验
<ol>
	<li>通过Transwell实验9或Zigmond小室实验检测中性粒细胞迁移，方法如前所述10,11。</li>
</ol>
3. 气囊实验
<ol>
	<li>首次空气注射
	<ol>
		<li>在第0天，将小鼠置于流速为2 L/min的5%异氟烷气体麻醉室中，麻醉3分钟，使其完全麻醉；随后将每只小鼠转移至独立呼吸装置中，以0.5 L/min流速的2%异氟烷维持麻醉状态。 
注意：在将小鼠从麻醉室转移至独立呼吸装置前，应通过夹捏脚趾确认麻醉深度。夹捏脚趾时，小鼠腿部不应出现运动反应。</li>
		<li>使用连接在5 mL注射器上的0.22 µm滤器，抽取3 mL无菌空气。</li>
		<li>用镊子提起麻醉后小鼠背部皮肤，使用26 G x 3/8&#34;针头将3 mL无菌空气皮下注射。</li>
		<li>处理完成后，将小鼠从呼吸装置中移出，持续观察直至其恢复活动，确保存活。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第二次空气注射
	<ol>
		<li>在第3天，向先前建立的气囊中再注入3 mL无菌空气，以维持气囊结构，操作方法同第3.1节所述。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>处理
	<ol>
		<li>在第6天，于处死前6小时向气囊内注射不同处理试剂。注射1 mL磷酸盐缓冲液（PBS）作为阴性对照；注射1 mL浓度为1 µg/mL的LPS作为阳性对照，以诱导局部炎症反应。</li>
		<li>将小鼠置于流速为2 L/min的5%异氟烷气体麻醉室中，麻醉3分钟，使其完全麻醉；随后将每只小鼠转移至独立呼吸装置中，以0.5 L/min流速的2%异氟烷维持麻醉状态。根据材料表配制洗涤缓冲液。 
注意：在将小鼠从麻醉室转移至独立呼吸装置前，应通过夹捏脚趾确认麻醉深度。夹捏脚趾时，小鼠腿部不应出现运动反应。</li>
		<li>对每个气囊，先用1 mL洗涤缓冲液冲洗气囊，并将炎性渗出液收集至15 mL离心管中；随后用2 mL洗涤缓冲液重复冲洗2次，每次冲洗液均收集至同一离心管中。</li>
		<li>在室温下以100 x g离心10分钟。弃去上清液，将细胞重悬于1 mL洗涤缓冲液中，使用全自动血液分析仪计数细胞，以定量中性粒细胞比例。 
		注意：代表性结果见图2。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 诱导佐剂诱导性关节炎（AA）小鼠模型
<ol>
	<li>通过涡旋振荡至少5秒使完全弗氏佐剂（CFA）悬浮均匀，然后用胰岛素注射器吸取100 µL悬浮液。 
注意：建议在实验中使用全新的CFA，以确保无菌。</li>
	<li>按照步骤3.1.1所述方法麻醉小鼠。</li>
	<li>标记选定的足爪，并向踝关节腔内注射20 µL CFA。在选定足爪的四个关节周围部位各注射20 µL悬浮液（共80 µL）。</li>
	<li>将小鼠从呼吸麻醉装置中取出，并将处理后的小鼠放入新的饲养盒中。监测小鼠呼吸情况，直至其恢复自主活动能力。</li>
	<li>每3天通过口袋式厚度计测量踝关节直径，评估关节直径变化（图3A）。</li>
	<li>每3天根据关节炎评分标准评估关节炎严重程度（图3C）：0分，正常，无关节红肿；1分，最轻度关节炎，仅跗骨或踝关节出现轻微红斑和轻度肿胀；2分，中度关节炎，红斑和轻度肿胀从踝关节延伸至跗骨；3分，重度关节炎，红斑和中度肿胀从踝关节延伸至跖趾关节；4分，最严重关节炎，红斑和严重肿胀累及踝关节、足部及足趾，或出现肢体强直。</li>
</ol>
5. 关节切片的免疫组织化学染色
<ol>
	<li>关节分离
	<ol>
		<li>使用异氟烷麻醉后，通过颈椎脱位法处死第4节中的小鼠。用70%乙醇喷洒小鼠体表。</li>
		<li>使用镊子和剪刀去除后肢的皮肤及部分肌肉组织。用70%乙醇喷洒关节，并用纸巾去除残留的肌肉。</li>
		<li>将踝关节在4%多聚甲醛中固定2天（室温）。在10% EDTA中脱钙1个月（室温），每周更换一次脱钙液。</li>
		<li>将组织包埋于石蜡中，并制备4 µm厚的组织切片。
		<ol>
			<li>将组织置于含有定量液态石蜡的标记模具中，短暂冷却。</li>
			<li>设定切片厚度为4 µm，在切片机上进行切片，并将切片漂浮于43 °C水浴中展平。</li>
			<li>将切片贴附于载玻片上，放入70 °C烘箱中烘烤2小时。如需长期保存，将载玻片置于-20 °C环境中。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>关节切片的固绿-藏红O染色 
	注意：以下染色步骤均在室温下进行。
	<ol>
		<li>将步骤5.1.4.3中的载玻片放入染色架中，在室温下依次进行以下洗涤以实现再水化：二甲苯5分钟（3次），100%乙醇2分钟（2次），95%乙醇2分钟（2次），70%乙醇2分钟，50%乙醇15分钟，最后用流动自来水冲洗3分钟。</li>
		<li>用0.1%固绿溶液染色5分钟。用1%乙酸溶液漂洗10秒。</li>
		<li>用0.1%藏红O染色液染色20分钟。随后将载玻片依次浸入以下溶液中洗涤：95%乙醇2分钟（2次），100%乙醇2分钟（2次），二甲苯2分钟（2次）。</li>
		<li>封片后在显微镜下观察组织。 
		注意：代表性图像见图4A。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>免疫组织化学染色以显示中性粒细胞
	<ol>
		<li>将石蜡切片在78 °C下烘烤2小时。将载玻片放入染色架中，在室温下依次进行以下洗涤以实现再水化：二甲苯15分钟（2次），100%乙醇5分钟（2次），95%乙醇5分钟，80%乙醇5分钟，H2O 3分钟，PBS 3分钟。 
		注意：此步骤中切勿让载玻片干燥。</li>
		<li>滴加一滴通透缓冲液覆盖组织，将切片置于湿盒中，在37 °C孵育。</li>
		<li>用PBS漂洗载玻片3分钟（3次）。避免直接冲洗组织区域。</li>
		<li>使用压力锅进行热诱导抗原表位修复。
		<ol>
			<li>将载玻片整齐放入染色架中，浸入盛有修复缓冲液的压力锅内。</li>
			<li>将压力锅置于微波炉中，设定功率为600 W，加热10分钟。</li>
			<li>煮沸后，让载玻片在压力锅中自然冷却至90 °C。取出后用PBS漂洗3分钟（3次）。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在新鲜配制的3% H2O2溶液中室温孵育15分钟，以淬灭内源性过氧化物酶活性。随后用PBS漂洗3分钟（3次）。</li>
		<li>使用疏水笔在样本周围画出较大的封闭圈，注意避免接触样本。在湿盒中用含3%牛血清白蛋白（BSA）的封闭液于37 °C封闭60分钟。</li>
		<li>去除封闭液，迅速向每张切片加入50 µL PBS稀释的一抗。随后将载玻片置于湿盒中，于4 °C孵育过夜。 
		注意：不同抗体使用不同的稀释比例（MPO为1:25，NE为1:20）。</li>
		<li>第二天取出湿盒，于室温静置30分钟，然后用PBS漂洗3分钟（3次）。</li>
		<li>向组织区域加入50 µL PBS稀释的二抗。 
		注意：使用的稀释比例分别为：MPO为1:1,000，NE为1:1,500。</li>
		<li>将载玻片置于湿盒中，37 °C孵育30分钟。随后用PBS漂洗3分钟（3次）。</li>
		<li>用稀释的3,3'-二氨基联苯胺（DAB）溶液显色5分钟。密切观察显色反应，防止出现过深着色。显色完成后用蒸馏水漂洗。</li>
		<li>用苏木精复染10秒，随后用自来水漂洗5分钟。</li>
		<li>用酸性乙醇快速分化液漂洗3秒，再用自来水漂洗10分钟。</li>
		<li>在室温下依次将载玻片浸入以下溶液中洗涤：80%乙醇5分钟，95%乙醇5分钟，100%乙醇5分钟，二甲苯15分钟（2次）。用封片剂封固盖玻片，显微镜下观察组织。 
		注意：代表性图像见图4B。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

长期以来，已有从外周血7、骨髓和组织18中分离高纯度中性粒细胞的详细方案。本文采用从腹腔液19中分离中性粒细胞的方法，所获成熟中性粒细胞仍处于非活化状态，可用于后续抗炎和抗氧化研究。
我们采用气囊实验来探究脂多糖（LPS）诱导的中性粒细胞在体内的浸润情况。该方法被认为是一种在体内直接测量一般炎症环境中细胞浸润的潜在方法。
值得注意的是，气囊模型仅以非器官特异性的方式展示中性粒细胞的功能，并省略了白细胞募集级联反应中的多个步骤。由于中性粒细胞向特定器官的募集可能依赖于不同的器官特性、黏附分子和趋化因子，因此在器官特异性条件下探究中性粒细胞的功能状态，对于研究中性粒细胞在某些疾病中可能发挥的作用具有重要意义3。已有研究建议需要采用终点模型来研究中性粒细胞的浸润情况。因此，对佐剂性关节炎（AA）模型小鼠关节组织切片进行免疫组织化学染色，可为深入...

中性粒细胞是最丰富的白细胞，在人类全部白细胞群体中占50−70%1。在急性炎症过程中，中性粒细胞是主要的早期应答细胞之一。组织驻留细胞释放的细胞因子和趋化因子可引导中性粒细胞迁移至炎症部位2,3,4，该过程由中性粒细胞与血管内皮细胞表面的细胞黏附分子相互作用介导5。中性粒细胞在宿主防御中具有基础性作用，同时因其可通过释放活性氧（ROS）及其他损伤组织的分子而造成组织损伤，也参与了病理性炎症反应3,6。
既往研究已描述了多种从小鼠或人类中分离中性粒细胞的方案。Oh 等人展示了利用密度梯度离心法从全人血中分离人中性粒细胞的方法7。然而，由于小鼠血液体积较小，从小鼠血液中分离出足够数量的中性粒细胞较为困难。另一种方法是从小鼠腹腔液中诱导获取大量纯度高且具有活性的小鼠中性粒细胞，这些经纯化的中性粒细胞可用于体外实验，以检测多种细胞功能，包括中性粒细胞浸润、迁移、趋化性、氧化爆发、细胞因子以及中性粒细胞胞外诱捕网（NET）的产生8。Transwell 实验9或Zigmond小室实验10,11可用于体外评估中性粒细胞的迁移能力。气囊模型则用于在体内评估中性粒细胞的迁移与浸润过程。皮下气囊模型是一种便捷的体内动物模型，可用于研究炎性细胞的迁移行为。
传统上，中性粒细胞被认为是在炎症急性期清除病原体的细胞。然而，近年来的研究表明，中性粒细胞是具有复杂功能的细胞，能够执行多种特异性功能。中性粒细胞可调控多种生理与病理过程，例如急性损伤与修复、肿瘤发生、自身免疫反应以及慢性炎症12,13。中性粒细胞还能调节适应性免疫应答，并影响B细胞和T细胞的功能14,15。人类若严重缺乏中性粒细胞，会导致死亡或严重的免疫缺陷；在小鼠中耗竭中性粒细胞也会导致死亡。而中性粒细胞在器官中的过度活化或募集则会引起多种免疫性疾病，例如类风湿关节炎（RA）和系统性红斑狼疮（SLE）6。在RA患者的滑液中，中性粒细胞是最丰富的细胞类型。中性粒细胞通过降解作用产生过量的髓过氧化物酶（MPO）和中性粒细胞弹性蛋白酶（NE），从而加剧软骨侵蚀。MPO是一种主要在中性粒细胞颗粒中表达的过氧化物酶16。NE与关节软骨破坏密切相关17。MPO和NE可用于评估RA患者组织中中性粒细胞迁移与浸润的状态。
本文提供了三种常规方法，用于评估体内和体外诱导的正常中性粒细胞迁移，以及在小鼠关节特异性炎症模型中病理性中性粒细胞的浸润。

<table><tbody><tr><td>0.1% 快绿溶液</td><td>Solarbio</td><td>8348b</td><td>将一瓶中的 20 mg 快绿 FCF 转移至另一 100 mL 烧杯中。加入 20 mL H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O，搅拌溶解染料以制备 0.1% 快绿溶液，并使用 Nalgene PES 75 mm 滤器过滤</td></tr><tr><td>0.1% 沙黄 O 染色液</td><td>Solarbio</td><td>8348a</td><td>将一瓶中的 20 mg 沙黄 O 染料转移至 100 mL 烧杯中。加入 20 mL H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O，搅拌溶解染料以制备 0.1% 沙黄 O 染色液，并使用 Nalgene PES 75 mm 滤器过滤</td></tr><tr><td>0.5 M 乙二胺四乙酸溶液（EDTA），pH 8.0</td><td>Sigma</td><td>324506</td><td>无菌</td></tr><tr><td>100% 乙醇</td><td>北京化学试剂厂</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100% 甲醇</td><td>北京化学试剂厂</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL 圆锥形聚丙烯离心管</td><td>Falcon</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>23 G × 1 1/4&quot; 针头</td><td>BD</td><td>305120</td><td></td></tr><tr><td>26 G × 3/8&quot; 针头</td><td>BD</td><td>305110</td><td></td></tr><tr><td>3% 牛血清白蛋白（BSA）</td><td></td><td></td><td>将 0.3 g BSA 溶解于 10 mL PBS 中</td></tr><tr><td>3% H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td>将 1 mL 30% H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 与 9 mL 甲醇混合</td></tr><tr><td>3,3'-二氨基联苯胺（DAB）试剂盒</td><td>ZSGB-BIO</td><td>ZLI-9018</td><td></td></tr><tr><td>30 G × 1/2&quot; 针头</td><td>BD</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>30% H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>北京化学试剂厂</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 mL 注射器</td><td>BD</td><td>Z683574</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 圆锥形聚丙烯离心管</td><td>Falcon</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>50% 乙醇</td><td></td><td></td><td>将 500 mL 100% 乙醇与 500 mL dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 混合</td></tr><tr><td>54.8% Percoll</td><td></td><td></td><td>将 2.74 mL 等渗 Percoll（SIP）与 2.26 mL 1&amp;times;PBS 混合，静置</td></tr><tr><td>70% 乙醇</td><td></td><td></td><td>将 700 mL 100% 乙醇与 300 mL dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 混合</td></tr><tr><td>70.2% Percoll</td><td></td><td></td><td>将 3.51 mL SIP 与 1.49 mL 1&amp;times;PBS 混合，静置</td></tr><tr><td>80% 乙醇</td><td></td><td></td><td>将 800 mL 100% 乙醇与 200 mL dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 混合</td></tr><tr><td>95% 乙醇</td><td></td><td></td><td>将 950 mL 100% 乙醇与 50 mL dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 混合</td></tr><tr><td>酸性乙醇超快分化液</td><td>Beyotime</td><td>C0165S</td><td></td></tr><tr><td>抗体</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗髓过氧化物酶抗体</td><td>Abcam</td><td>ab208670</td><td></td></tr><tr><td>抗中性粒细胞弹性蛋白酶抗体</td><td>Abcam</td><td>ab21595</td><td></td></tr><tr><td>全自动血液分析仪</td><td>Sysmex</td><td>XS-800i</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>VWR</td><td>0332-100G</td><td></td></tr><tr><td>完全弗氏佐剂，10 mg/mL</td><td>Sigma</td><td>1002036152</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>CITOGLAS</td><td>10212432C</td><td></td></tr><tr><td>表盘式厚度规</td><td>Mitutoyo</td><td>7301</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 微量离心管，1.5 mL</td><td>Sigma</td><td>Z606340</td><td></td></tr><tr><td>优质胎牛血清（FBS）</td><td>PAN</td><td>P30-1302</td><td></td></tr><tr><td>气体麻醉系统</td><td>ZS Dichuang</td><td>ZS-MV-IV</td><td></td></tr><tr><td>羊抗兔 IgG H&amp;L（HRP）</td><td>PPLYGEN</td><td>C1309</td><td>该试剂为免疫组织化学染色中使用的二抗。</td></tr><tr><td>Hank's 平衡盐溶液（HBSS）</td><td>以色列 Beth HaEmek 生物工业公司</td><td>02-016-1A</td><td>无菌</td></tr><tr><td>苏木精染色液</td><td>ZSGB-BIO</td><td>ZLI-9609</td><td></td></tr><tr><td>脂多糖（LPS）</td><td>Sigma</td><td>L3012</td><td></td></tr><tr><td>培养基与添加剂</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>改良沙黄 O-快绿 FCF 软骨染色试剂盒</td><td>Solarbio</td><td>G1371</td><td></td></tr><tr><td>N-甲酰-甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸（fMLP）</td><td>Sigma</td><td>47729</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液，100&amp;times;</td><td>Invitrogen</td><td>1514022</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare</td><td>10245207</td><td>密度梯度介质</td></tr><tr><td>通透缓冲液</td><td></td><td></td><td>将 100 &amp;mu;L Triton X-100 与 1 L dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 混合，得到 0.01% Triton X-100</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS），1&amp;times;</td><td></td><td></td><td>将 90% ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 与 10%（v/v）10&amp;times;PBS 混合，高压灭菌</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS），10&amp;times;</td><td></td><td></td><td>将 16 g NaCl、0.4 g KCl、2.88 g Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&amp;middot;&lt;/sub&gt;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O、0.48 g KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;（无水）溶于 200 mL ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 中，调节 pH 至 7.4，高压灭菌</td></tr><tr><td>塑料器皿与设备</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>粉末</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>蛋白胨</td><td>Oxoid</td><td>1865317</td><td></td></tr><tr><td>抗原修复缓冲液</td><td></td><td></td><td>将 18 mL 抗原修复缓冲液 A 与 82 mL 抗原修复缓冲液 B 混合，加 dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 至 1000 mL，调节 pH 至 6.0</td></tr><tr><td>IHC 用抗原修复缓冲液 A 储存液</td><td></td><td></td><td>将 4.2 g 柠檬酸（C&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;5&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;7&amp;middot;&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O）溶于 200 mL dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 中</td></tr><tr><td>IHC 用抗原修复缓冲液 B 储存液</td><td></td><td></td><td>将 5.88 g 二水合柠檬酸三钠（C&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;5&lt;/sub&gt;Na&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;7&lt;/sub&gt;&amp;middot;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0）溶于 200 mL dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 中</td></tr><tr><td>罗斯韦尔帕克纪念研究所（RPMI）-1640 培养基</td><td>Sigma</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 完全培养基</td><td></td><td></td><td>RPMI-1640 培养基中添加 10% FBS 和 1% 青霉素/链霉素</td></tr><tr><td>舒瑞 U40 一次性无菌胰岛素注射针头 1 mL</td><td>BD</td><td>328421</td><td></td></tr><tr><td>载玻片</td><td>CITOGLAS</td><td>10127105P-G</td><td></td></tr><tr><td>溶液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>等渗 Percoll 储存液（SIP）</td><td></td><td></td><td>将 90%（v/v）Percoll 与 10%（v/v）10&amp;times;PBS 混合，静置 20 分钟</td></tr><tr><td>气囊实验洗涤缓冲液</td><td></td><td></td><td>将 0.5 M EDTA 用 HBSS 稀释至 10 mM</td></tr><tr><td>二甲苯</td><td>北京化学试剂厂</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

检测小鼠中性粒细胞的迁移与浸润

Detecting Migration and Infiltration of Neutrophils in Mice

中性粒细胞是先天免疫系统的主要成员，在宿主防御病原体以及病理性炎症反应中发挥关键作用。细胞因子和趋化因子可引导中性粒细胞募集至炎症部位。中性粒细胞过度浸润可导致非特异性组织损伤，例如类风湿关节炎（RA）中的情况。从腹腔渗出液中分离的中性粒细胞可在体外通过Transwell或Zigmond小室实验中对确定的趋化因子N-甲酰-甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸（fMLP）产生响应。气囊实验可用于评估中性粒细胞在体内向脂多糖（LPS）趋化的现象。佐剂诱导性关节炎（AA）小鼠模型常用于类风湿关节炎研究，利用抗髓过氧化物酶（MPO）或抗中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）抗体对关节组织切片进行免疫组织化学染色，是检测中性粒细胞浸润的成熟方法。这些技术可用于发现靶向中性粒细胞迁移的潜在治疗策略。

从小鼠腹腔灌洗液中收集腹腔渗出细胞。将细胞重悬于1 mL RPMI-1640完全培养基中，铺在两步不连续密度梯度（54.8%/70.2%）上（图1A），在1,500 × g 条件下离心30分钟。中性粒细胞（纯度≥95%，每只小鼠约1 × 107个中性粒细胞）从下层界面回收（图1B）。
通过气囊实验研究体内脂多糖（LPS）刺激中性粒细胞募集的情况（图2A）。检测了气囊渗出液中白细胞亚群的组成（图2B）。
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本文介绍了三种评估中性粒细胞在体内和体外迁移与浸润的方法。这些方法可用于发现靶向中性粒细胞迁移的潜在治疗药物。

中性粒细胞是先天免疫系统的主要成员，在宿主防御病原体以及病理性炎症反应中发挥关键作用。

本方法旨在描述三种常用的方法，用于评估正常中性粒细胞在体外和体内迁移，以及在小鼠关节炎模型中病理性中性粒细胞的浸润。我们认为该方法可为本领域的其他研究人员提供帮助。本方案包含利用气囊模型实验和佐剂诱导关节炎来评估中性粒细胞在炎症部位迁移能力的方法学细节。通过比较模型组与治疗组，该技术的应用前景可拓展至关节炎治疗领域。该方法有助于深入理解炎症性疾病，并可应用于炎症性肠病的研究。本实验操作将由本实验室的研究生卢 Qingyi 和江 Haixu 进行示范。在第0天对小鼠进行麻醉后，使用连接在5毫升注射器上的0.22微米滤器获取3毫升无菌空气。用镊子提起麻醉小鼠的背部皮肤，通过26号、3/8英寸长的针头皮下注射3毫升无菌空气。处理完成后，将小鼠从呼吸装置中取出，并放入准备妥当的笼具中。观察小鼠以确保其存活直至开始活动。第3天，向先前建立的气囊中额外注射3毫升无菌空气，以维持气囊结构。第6天，将不同的处理物质注射入气囊中。注射一毫升磷酸盐缓冲液（PBS）作为阴性对照，注射一毫升每毫升含一微克脂多糖（LPS）的溶液作为阳性对照，以诱导局部炎症。六小时后处死小鼠。对每个气囊，注入一毫升洗涤缓冲液冲洗气囊，并将炎性渗出液收集至15毫升离心管中。然后用两毫升洗涤缓冲液清洗气囊两次，并将炎性渗出物收集到同一离心管中。在室温下以100 × g离心10分钟。弃去上清液，并将细胞重悬于一毫升洗涤缓冲液中。使用全自动血细胞分析仪对细胞进行计数，以定量中性粒细胞比例。将完全弗氏佐剂通过涡旋振荡至少5秒使其悬浮，然后用胰岛素注射器吸取100 µL悬浮液。麻醉后，标记选定的足爪，并从注射器中向踝关节间隙周围的四个关节周围位点各注射20 µL完全弗氏佐剂。将处理后的小鼠放入新笼中。监测小鼠，确保其呼吸，直至恢复活动能力。每三天使用便携式厚度计测量一次踝关节直径。此外，根据关节炎评分标准评估关节炎严重程度。0 分为正常，无红斑和肿胀迹象。一是最轻度的关节炎，表现为仅局限于跗骨或踝关节的红斑和轻度肿胀。二是中度关节炎。从踝关节延伸至跗骨的红斑和轻度肿胀。三是严重的关节炎。从踝关节延伸至跖骨关节的红斑和中度肿胀。四度为最严重的关节炎表现，红斑和严重肿胀累及踝关节、足部和足趾，或出现肢体关节强直。处死小鼠后，用镊子和剪刀从后肢去除皮肤及部分肌肉组织。用70%乙醇喷洒关节，并用纸巾去除剩余的肌肉组织。将踝关节在4%多聚甲醛中固定两天，室温保存。随后在10%EDTA中脱钙一个月，室温下每周更换一次脱钙液。一个月后，将组织置于含有一定体积液态石蜡的标记模具中，在约 60 摄氏度条件下进行组织包埋，短暂冷却。将切片机厚度设置为 4 µm，进行切片。 然后将切片放入43°C水浴中短时间漂浮，以展开切片。将切片捞至载玻片上，放入70°C烘箱中烘烤两小时。如需长期保存，应将载玻片置于-20°C环境中。 接下来，将切

detecting-migration-and-infiltration-of-neutrophils-in-mice

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

检测小鼠中性粒细胞的迁移和渗透

本文介绍了一种无创的双光子（2P）显微成像方法，用于研究小鼠足垫中的白细胞归巢过程。我们讨论了组织成像制备过程中的技术细节，并指导读者完成从初始设置到实验实施及数据采集的典型实验流程。...

白细胞归巢与迁移的非侵入性成像 体内

我们描述了一种用于在中性粒细胞趋化因子刺激下，中性粒细胞募集过程中动态测量中性粒细胞与内皮细胞相互作用的明场活体显微镜技术方案。...

通过活体视频显微镜追踪中性粒细胞在组织内的管腔内爬行、跨内皮迁移及趋化运动

监测小鼠感染模型中中性粒细胞募集动态及细菌负荷

我们描述了一种通过密度梯度离心法从小鼠骨髓中分离和纯化中性粒细胞，并使用CellTracker染料对中性粒细胞进行标记的实验方案。该方法简单、快速、可重复且经济，适用于获取大量中性粒细胞，以用于后续的功能研究或过继转移与示踪实验。...

小鼠骨髓中性粒细胞的分离、纯化及标记用于功能研究与过继性转移实验

中性粒细胞在黏膜细菌感染刺激下发生跨上皮迁移，可导致上皮损伤及临床疾病。 一个 体外...

体外 共培养实验评估病原体诱导的中性粒细胞跨上皮迁移

我们开发了一种 体外 模拟尿路致病性感染期间膀胱急性炎症反应重要组分的模型...

定量评估人中性粒细胞穿过培养的膀胱上皮的迁移能力

我们详细介绍了一种利用活体共聚焦显微镜在麻醉小鼠的肠系膜静脉中监测中性粒细胞和单核细胞在稳态及炎症条件下行为的实验方案。...

通过活体显微镜实时成像麻醉小鼠肠系膜静脉中的中性粒细胞和单核细胞

本实验方案采用荧光报告基因、体内标记和活体成像技术，以实现对活体动物中中性粒细胞预激活动态过程的监测。...

利用IL-1β启动子驱动的DsRed报告小鼠进行中性粒细胞活化的活体成像

本文介绍了一种检测固定和通透处理的组织切片中中性粒细胞存在情况，以及评估活体纯化中性粒细胞活化状态的实验方案。其中，MUB40 肽可结合存在于中性粒细胞特异性颗粒和三级颗粒中的乳铁蛋白。通过通透处理或中性粒细胞活化暴露颗粒内容物，即可实现对中性粒细胞的标记。...

用于检测中性粒细胞介导的炎症事件的 MUB40 肽

本文展示了如何对小鼠提睾肌的毛细血管后微静脉进行活体显微观察。该技术常用于研究不同类型的炎症和脓毒症模型，尤其是由趋化因子和细胞因子诱导的模型，本文强调了其在研究伴有显著肌肉白细胞浸润的肌病中的重要性。...

通过活体显微镜评估小鼠 cremaster 肌肉中的白细胞浸润

中性粒细胞的迁移依赖于质膜在趋化因子作用及其与细胞外微环境相互作用下发生的快速而持续的重塑。本文介绍了一种基于活体亚细胞显微镜的技术，用于研究注射至麻醉小鼠耳部的中性粒细胞中质膜重塑的动态过程。...

在生理条件下通过小鼠皮肤成像研究中性粒细胞迁移及亚细胞膜重塑

学习使用气囊实验和佐剂诱导关节炎模型评估小鼠中性粒细胞在炎症部位的迁移能力。该方法可应用于关节炎和炎症性肠病研究，为开发靶向治疗提供实验基础。

检测小鼠中性粒细胞的迁移与浸润

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