用于体外人中性粒细胞趋化性及分子分析的生物微粒微阵列

本方案具有重要意义，因为它能够实现对中性粒细胞集群行为的体外分析，从而克服了目前无法开展实验的诸多局限。该技术的主要优势在于，可方便地获取中性粒细胞在集群过程中分泌的细胞因子和脂质介质，并支持进行定量成像分析。尽管我们已将该技术应用于中性粒细胞，但它也可拓展用于分析其他白细胞（如单核细胞和T细胞）的迁移行为。

首先，通过将适量的阳离子聚电解质（CP）粉末加入水中，并在搅拌器上搅拌过夜或直至所有固体完全溶解，制备浓度为 1.6 毫克/毫升的阳离子聚电解质（CP）溶液。如有需要，可通过添加荧光素异硫氰酸酯（FITC）标记的聚-L-赖氨酸使该溶液具有荧光。采用标准的光刻工艺制备主硅晶圆。

此处采用的设计是一个 4×4 毫升的矩形阵列，包含直径为 30 微米的实心圆，中心间距为 150 微米，但可根据不同应用需求进行修改。在硅片上旋涂一层 40 微米厚的负性光刻胶，然后在 65°C 下烘烤 5 分钟。

95 摄氏度下加热 10 分钟。通过具有 150 至 160 毫焦每平方厘米的铬掩模，将晶圆暴露于紫外光下。再次在 65 摄氏度下烘烤 5 分钟，然后在 95 摄氏度下烘烤 10 分钟。

然后将其浸入光刻胶显影液中10分钟，并用异丙醇冲洗。此时晶圆表面的图案应已可见。

接下来，将聚二甲基硅氧烷（PDMS）预聚物与其固化剂按10:1的比例充分混合。然后将未固化的混合物倒入培养皿中的主模板晶圆上。对未固化的PDMS混合物进行真空处理，直至无气泡存在。

然后在 65 摄氏度下固化过夜。第二天，使用解剖刀沿晶圆图案区域的外围切割，并缓慢剥离固化的 PDMS 块，将其放置在干净的切割板上，使图案面朝上。

使用8毫米活检打孔器从PDMS平板上打下单独的印章，并将每个印章正面朝下放置在粘性胶带上，以去除碎屑。将这些印章正面朝上放置，每个印章上加入100 µL预配制的CP溶液进行预处理，确保溶液与印章之间不产生气泡。然后将印章翻转至一层CP溶液上，一小时后取出。

将每个湿润的印模面朝下在干净的载玻片上轻按六至八次，以去除多余液体。然后对印模进行一至两分钟的真空处理。将一个八孔、直径八毫米的成像间隔垫置于干净的载玻片上，作为印模定位的引导。

将印章正面朝下放置在成像间隔片每个孔中央的载玻片上。然后在每个印章上放置一个5.6克的平衡重物，静置10分钟以完成压印。移除重物和印章，让CP层在室温下干燥24小时，然后再加入生物颗粒。

如果CP用FITC标记，请使用荧光显微镜检测印章效果。将一块空白PDMS切至成像间隔器的大小，并使用8毫米活检打孔器在PDMS上制备与间隔器孔位对齐的孔。然后将PDMS片粘附到玻片上。

将生物颗粒溶液解冻，并用水将其稀释至每毫升含500微克。向载玻片上的每个PDMS微孔中加入100微升生物颗粒溶液，轻轻摇动载玻片30分钟。用清水彻底冲洗微孔，并用荧光显微镜检查载玻片上的图案。

生物颗粒微阵列可在无尘环境中于4°C保存长达三个月。用含0.4%人血清白蛋白的IMDM培养基将细胞重悬至7.5 × 10⁵ 个细胞/毫升，以制备细胞悬液。向含有生物颗粒微阵列的PDMS小室中加入100 µL细胞悬液，确保细胞悬液在PDMS小室顶部呈凸面且不含任何气泡。

用直径为12毫米的盖玻片密封小孔，用镊子轻轻按压，使多余的细胞悬液挤出至小孔边缘，然后用纸巾吸除多余液体。为成像细胞，将载有细胞的微粒阵列放入配备腔室培养箱的活细胞成像显微镜系统中，腔室条件设置为37°C、5%二氧化碳和90%相对湿度。采用延时成像、荧光及明场显微技术，在405纳米、594纳米和明场条件下，以10倍放大倍数每10秒采集一次图像。

将中性粒细胞与生物颗粒在37摄氏度、5%二氧化碳条件下于孔板中孵育3小时，并在预定时间点取样。使用明场显微镜确认微阵列上已形成细胞群聚。收集单个孔的全部上清液体积，加入0.45微米离心过滤管中，确保每个时间点均设三个重复进行分析。

将离心管在190 × g、20 °C条件下离心5分钟，并收集滤液体积。随后将样品保存在-80 °C，直至进行处理。在执行本方案时，应在通风橱内操作光刻胶和显影液。

在从人类供体采集血液前，须具备经机构审查委员会（IRB）批准的研究方案。需注意，来源于人类血液的材料属于生物安全二级（BSL2）级别。当中性粒细胞被添加到生物颗粒微阵列时，接触生物颗粒簇的中性粒细胞会被激活，并启动趋化聚集反应。

通过延时荧光显微镜追踪中性粒细胞向生物颗粒簇的迁移，对生物颗粒微阵列进行了验证。在暴露30至60分钟后，每个簇周围均形成稳定的中性粒细胞群聚。相比之下，在无生物颗粒簇存在的情况下，中性粒细胞未表现出集体迁移行为。

通过检测染色中性粒细胞核的荧光强度，确定围绕生物颗粒簇的平均群集面积约为1490平方微米。在无颗粒簇存在的情况下，特定兴趣区域的荧光强度随时间保持恒定。中性粒细胞迁移轨迹显示，当存在生物颗粒簇时，中性粒细胞会向其聚集；而在对照系统中则未观察到聚集现象。

测量了成群运动的中性粒细胞与非激活中性粒细胞的运动速度，发现两者在速度分布上存在统计学显著差异。成群运动的中性粒细胞平均速度为 20.6 微米每分钟，而对照组中性粒细胞的平均速度为 2 微米每分钟。随时间分析了中性粒细胞在成群运动过程中释放的 16 种蛋白质的浓度。

10 种蛋白质浓度升高，2 种降低，其余 4 种在群集运动的第 1 小时内升高，之后下降。

进行此操作时，务必确保所有物品清洁且印章已充分干燥，因为这些因素对于细菌颗粒的成功图案化至关重要。该技术的建立将使研究人员能够探索中性粒细胞群集领域的诸多新问题，包括游离介质和细胞外囊泡在中性粒细胞细胞间通讯中的作用。