基于明胶甲基丙烯酰胺水凝胶生物墨水的3D生物打印方案

基于 GelMA 水凝胶的仿生材料在 3D 生物打印中变得非常流行。然而，其低黏度限制了可打印性。本文中，我们与其他研究人员分享在实验室中打印 GelMA 的策略。

在本视频中，我们充分利用这种生物材料的特殊性质，提出了多种适用于不同三维结构的打印方法，这些方法可进一步推动其在生物医学领域的应用。以器官损伤为例，通过注射、嵌入或追踪打印的 GelMA 结构，有望将其应用于相应的治疗中。将冻干的 GelMA 完全溶解在短时间内并非易事。

为了加快溶解过程，可以使用涡旋混合器。每种生物材料都将利用 GelMA 的特定特性。我建议新加入的研究人员应充分了解在打印过程中哪些条件至关重要。

操作细节决定了打印过程的成功与否。因此，我们选择通过视频演示与其他研究人员分享。要制备微球，首先将两个金属环电极分别连接至接地端和正极端。

将连接高压的金属板置于环形电极下方，并在金属板上放置盛有硅油的培养皿作为液滴接收器。通过将冻干的 GelMA 和 LAP 溶解于 DPBS 中，再经 0.22 微米滤膜过滤以确保无菌，随后在 37 °C 水浴中加热 15 分钟来制备生物墨水。用 3 毫升含 0.25% 胰蛋白酶和 0.02% EDTA 的溶液在 37 °C 下处理 3 分钟，使 MDA-MB-231 细胞脱落。

将细胞转移至15毫升离心管中，在100 × g条件下离心5分钟。弃去上清液，用1毫升预配的生物墨水缓慢吹打重悬细胞，确保避免产生气泡。将1毫升生物墨水与细胞的混合液吸入一支3毫升无菌注射器中。

通过压缩空气推动生物墨水，并将注射器安装到固定装置上。打开高压电源，将电压设置为零至四千伏。同时开启405纳米波长的光照，以在五毫升硅油中交联GelMA液滴。

将培养皿倾斜倒出大部分硅油，然后用勺子将残留的油和微球转移至一个15毫升离心管中。加入5毫升DPBS，混匀后以100 × g离心，弃去上清液。将微球转移至含有DMEM的培养皿中，在37 °C、5% CO₂条件下培养三天。

三天后弃去培养基，并用DPBS洗涤微球。在室温下用2毫升4%多聚甲醛固定30分钟，然后弃去多聚甲醛溶液，再次洗涤微球。在室温下用2毫升0.5%非离子型表面活性剂对细胞进行透化处理5分钟，弃去表面活性剂，再用DPBS洗涤微球。

随后在避光条件下用TRITC-鬼笔环肽染色30分钟，再用DAPI染色10分钟，每次染色后弃去染料，并用DPBS洗涤微球。使用共聚焦荧光显微镜对微球进行成像。将灭菌的海藻酸钠粉末以2%（质量体积比）溶于去离子水中。

按照先前所述方法制备无菌生物墨水溶液，然后将生物墨水和海藻酸钠置于37摄氏度水浴中加热15分钟。按照先前所述MDA-MB 231细胞的方法对bMSCs进行胰酶消化和离心，随后弃去上清液，并用2毫升GelMA生物墨水重悬细胞沉淀。用10毫升注射器吸取2毫升生物墨水-细胞混合物，另取一支注射器吸取2毫升海藻酸钠混合物。

使用两个注射泵分别以每分钟50微米的速度输送生物墨水，以及以每分钟350微米的速度输送海藻酸钠。打开405纳米波长的光源，照射透明管以交联GelMA纤维。用培养皿接收纤维，并用勺子收集。

将纤维转移至含有DMEM/F12的培养皿中，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养三天。细胞培养完成后，按照先前所述步骤，在共聚焦荧光显微镜下观察纤维。将冻干的GelMA和LAP溶解于DPBS中，并向溶液中加入品红食用色素，以提高打印精度。

将溶液通过0.22微米滤膜过滤以确保无菌，并在37摄氏度水浴中加热15分钟。使用CAD软件构建3D模型，并将模型文件导入所用DLP生物打印机的上位软件中。向生物打印机的槽中加入10 mL制备好的生物墨水。

根据文稿说明设置打印参数，然后开始打印。完成后，将打印出的结构从生物打印机中取出，放入培养皿中的DPBS中浸泡。按照之前所述方法解离并收集MDA-MB 231细胞。

用两毫升 DMEM 重悬细胞，并将细胞悬液加入打印的结构中。在 37 摄氏度、5% 二氧化碳条件下培养三天，然后按照之前所述方法制备结构以进行共聚焦荧光显微镜观察。配制 10%（重量/体积）的 GelMA 和 0.5%（重量/体积）的 LAP 溶液，然后通过 0.22 微米滤膜过滤。

将明胶粉末在紫外线下灭菌30分钟，然后按5%（w/v）的比例加入 GelMA LAP 溶液中。将混合物置于37°C水浴中加热15分钟。用制备好的生物墨水填充模具，并置于4°C冰箱中30分钟。

使用刀片将部分交联的水凝胶片从模具中取出。将二维模具成型的水凝胶片组合，并通过在405纳米波长下照射一分钟，使用GelMA将其键合。收集并离心分离HUVECs，将细胞与2 mL DMEM混合，然后用喷嘴和注射器将细胞悬液注入微通道中。

接下来的三小时内，每隔15分钟将芯片倒置一次，以实现细胞均匀且完全的贴附。将芯片置于培养皿中，在DMEM培养基、37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养三天，随后进行形态学观察。当GelMA液滴落入接收用硅油中时，保持标准的球状结构，无尾状残留。

在经历高压电场力作用后，封装的细胞仍保持了其铺展能力，验证了电辅助制备方法的生物相容性。选用DLP生物打印机来制备具有更复杂形状（如鼻形、耳形及多腔室结构）的GelMA结构。接种的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）能够附着于GelMA材料，并在交联后的GelMA结构表面铺展，表明该技术在组织工程领域具有应用潜力。

采用双重交联策略制备基于 GelMA 的微流控芯片。通过按需设计不同的模具，构建具有多种微通道的芯片，并将 HUVECs 接种于通道内，使其附着于通道壁并形成宏观血管结构。在制备微球时需施加高压电源。

研究人员必须在操作前检查电路，并且不得触碰暴露的毫巴，以保护操作人员，防止细胞因短路而受损。超声波水基方法可能是加速理想速度的另一种选择。本研究总结了我们实验室中 GelMA 的 3D 生物打印方法。

研究人员可参考该视频，改进或拓展打印策略，以满足进一步的生物医学需求。